دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Eaton, S. L., Hurtado, M. L., Oldknow, K. J., Graham, L. C., Marchant, T. W., Gillingwater, T. H., Farquharson, C., Wishart, T. M. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. J. Vis. Exp. (93), e52099, doi:10.3791/52099 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

شهدت أواخر 1970s أول استخدام تقارير علنية للطخة غربية، وهي تقنية لتقييم وجود وفرة نسبية من بروتينات معينة في عينات بيولوجية معقدة. منذ ذلك الحين، أصبحت منهجية النشاف الغربية عنصر مشترك من علماء البيولوجيا الجزيئية ذخيرة تجريبية. بحث سريع للمجلات استخدام مصطلح "طخة غربية" تشير إلى أن ما يزيد على 220،000 المخطوطات المنشورة جعلت استخدام هذه التقنية بحلول عام 2014. والأهم من ذلك، شهدت السنوات العشر الأخيرة تطورات تقنية التصوير إلى جانب تنمية العلامات الفلورية للحساسية التي تحسنت حساسية وأسفرت نطاقات أكبر من الكشف الخطي. والنتيجة هي الآن قابلة للقياس الكمي الإسفار حقا مقرها البقعة الغربية (QFWB) التي تسمح للعلماء الأحياء لإجراء تحليل مقارن التعبير بقدر أكبر من الحساسية ودقة من أي وقت مضى. العديد من "الأمثل" النشاف الغربيوتوجد منهجيات واستخدمت في مختبرات مختلفة. هذه غالبا ما يكون من الصعب تنفيذ ذلك بسبب متطلبات التعديلات الإجرائية الدقيقة ولكنها غير موثقة. وينص هذا البروتوكول على وصف شامل لطريقة QFWB ثابتة وقوية، مع استكمال استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Introduction

النشاف الغربي (WB) هو تقنية تحليلية وضعت أصلا في أواخر 1970s لتحديد وجود أو عدم وجود بروتين من الفائدة في عينة بيولوجية معقدة، مثل جناسة الأنسجة 1. يشار إلى أن طخة مناعية البروتين، ويرجع ذلك إلى تفاعل الضد مستضد الرئيسي، وتتكون هذه المنهجية من 5 خطوات متميزة: 1) الفصل الكهربي للبروتينات من خلال وجهة نظرهم تساوي الكهربية. 2) نقل إلى النيتروسليلوز أو البولي فينيل difluoride (PVDF) الغشاء. 3) وضع العلامات باستخدام الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين في المصالح؛ 4) الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية الموجهة ضد الأجسام المضادة الأولية. و5) التصور.

وقد تطورت منهجية التصور مع الوقت لتحسين السلامة والحساسية. أجريت بعض WBS الأولى من استخدام الإذاعة علامات المسمى الذي تقدمت بعد ذلك إلى chemilluminescent أكثر استخداما (ECL) طرق اللونية ثم. Radioactiviوكان تاي المسمى مباشرة على تحقيقات لمستضدات معينة في حين تستخدم منهجيات اللونية وECL تقنية وضع العلامات غير المباشرة مع مراسل انزيم مثل الفوسفاتيز القلوية الغلوثانيون أو streptavidin الفجل (HRP) 2. يتم قياس شدة العلامات من chromagen أو الانارة المنتج باستخدام كثافة حيث قوة الإشارة، قوية أو ضعيفة، ويشير أكثر أو أقل وجود البروتين من الفائدة في العينة. أطلق بيت التمويل الخليجي هو منهجية أكثر حساسية، وبالتالي يفضل 2 ولكن وضعت جميع الطرق 3 البداية على فيلم الأشعة السينية مع تقنيات التصوير الرقمي أكثر تطورا أنشئت في وقت لاحق 3. النهوض التصوير الرقمي من البنك الدولي يسمح ليس فقط الباحث لتحديد وجود أو عدم وجود بروتين اهتمامهم، ولكن أيضا يسمح الاستنتاج إلى مستوى التعبير عن بروتين المحددة عند مقارنتها عينات أخرى، وبالتالي يمكن أن يشار إلى "شبه كمي & #8221 ؛. مؤخرا، تم تطوير تقنية النشاف الغربية الكمية حقا، وأكثر حساسية حيث مستوى مضان تقاس يرتبط مباشرة لكمية والتعبير عن بروتين واحد ضمن العينة: الكمية الفلورسنت غرب النشاف (QFWB).

عند مقارنة QFWB مع وضع العلامات ECL، واستخدام الأجسام المضادة الثانوية فلوري يولد لمحة الكشف الخطي 4. هذا هو على النقيض من تقنيات ECL التي يحدث فيها إشارة خطية عموما مع انخفاض الأحمال البروتين أقل من 5 ميكروغرام وإشارة التشبع علاقة مباشرة البروتين التعبير، أي مع الجينات التدبير المنزلي أعرب بتواجد مطلق 5،6. ومن المرجح أن سبب هذا التفاوت من قبل عدد أكبر من مواقع الربط المتاحة لECL الركيزة أفيدين لربط المعقدة البيروكسيديز الثانوية، مما أدى إلى ارتفاع احتمالات تشبع إشارة محتملة. هذا هو واحد من الأسباب الرئيسية لECL قاعدة immunoblotting إحالتها إلى y ....... قل كماذ "شبه كمي" (7). نقطة التشبع من إشارة ذات أهمية حاسمة عند قياس الاختلافات الطفيفة في مستويات التعبير، ويمكن أن تؤدي إلى قياسات غير دقيقة. في السنوات الأخيرة أدى ظهور تقنيات البروتين على نطاق واسع يفصل متزايدة الحساسية وتحديد الفروق الدقيقة في التعبير عن الاعتماد المتزايد على النشاف الغربي الكمي حقا للتجارب التصديق 8،9. تطبيق منهجية حساسة وقوية والكمية حقا هو بالتالي حاسما.

وقد استخدمت العديد من "الأمثل" منهجيات النشاف الغربية من قبل مختبرات مستقلة، والتي يكون من الصعب في كثير من الأحيان إلى إنشاء أو تكرار بسبب التعديلات المنهجية الدقيقة التي قد لا تكون واضحة في بروتوكولات رسمية موثقة. هذا هو بروتوكول الراسخة والقوية لQFWB ويوفر استراتيجيات قيمة لاستكشاف المشاكل الشائعة ثا إضافير قد تنشأ أثناء التنفيذ.

تم تحسين هذا البروتوكول في الأصل للاستخدام مع الخليط دماغ الفئران، ولكن منذ ذلك الحين يستخدم بشكل فعال عبر مجموعة واسعة من عينات الأنسجة وأنواع 4،9،10. تدرج التغيرات المحتملة بروتوكول المطلوبة لقضايا محددة استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Protocol

وقد تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام مخازن المنتجة تجاريا، والمواد الهلامية ونقل أكوام من أجل الحد من التقلبات وتحسين الاتساق. الرجوع إلى قائمة المواد للحصول على قائمة كاملة من المواد الاستهلاكية المطلوبة.

بروتوكول البنك الدولى الفلورسنت باستخدام I-البقعة نقل سريع وLI-COR نظام التصوير أوديسي

1. إعداد عينة

  1. عازلة اختيار / إعداد
    1. تحديد عازلة استخراج المناسب للعينة التجانس وضمان أن المخزن المؤقت متوافق مع جميع التقنيات المصب لاستخدامها. إعداد استخراج العازلة: عازلة RIPA (25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1٪ NP-40، 1٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ SDS) تحتوي على 5٪ مثبط البروتياز كوكتيل مسبق لعينة العزلة.
      ملاحظة: هناك العديد من أنواع مختلفة من مخازن استخراج المتاحة، ويتم اختيارهم تبعا للموقع من البروتين في المصالح داخل الخلية. وتشمل هذه ولكنها ليستتقتصر على RIPA العازلة (خلية كاملة، الميتوكوندريا والمكونات النووية)، NP-40 تحلل العازلة (خلية كاملة أو غشاء ملزمة) وتريس، تريتون (حشوية الهيكل العظمي ملزمة). ومع ذلك، فإن بعض المنظفات الكيميائية داخل مخازن استخراج قد تساعد على ذوبان أو حتى تعطيل بروتين ولكن يمكن أن تتداخل مع تحديد بروتين معين عند استخدام مقايسة تقرير البروتين، أي حمض Bicinchoninic (BCA) فحص. تحقق المبادئ التوجيهية الشركة المصنعة بشأن التوافق مع الفحص الكيميائي.
  2. استخراج البروتين / الإذابة
    1. أضعف عينة النسيج يدويا باستخدام مقص و / أو مشرط تليها التجانس باستخدام إما dounce أو الخالط باليد الكهربائية مع طرف البولي بروبلين في استخراج العازلة على استعداد في حوالي الساعة 01:10 ث / ت (وزن الأنسجة / حجم عازلة) حتى وينتج السلس / جناسة ثابت.
      ملاحظة: للحصول على أصغر الثمينة / صعوبة الحصول على عينات، CA الاستخراج المنظفات مقرهان يكون لا يزال فعالا وصولا إلى 1: 5.
    2. إضافة التجانس، وعينات الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف التي تحتوي على البروتينات تذوب وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى المطلوبة. الاحتفاظ الكريات غير قابلة للذوبان للسماح استخراج كذلك أكثر صرامة إذا لزم الأمر لاحقا. الشروع في تحديد البروتين خطوة 1.3.
  3. تقرير البروتين
    1. تحديد تركيز البروتين داخل كل عينة المستخرجة باستخدام إما BCA، برادفورد أو فحص مماثل. عند حساب منحنى القياسية، والتأكد من أن معامل نسبة عزم، قيمة-R التربيعية، أكبر من أو تساوي 0.99 مما يعكس عزم الأكثر دقة وفرة البروتين في عينات 15.
      ملاحظة: جميع عينات يجري مقارنة بنسبة QFWB يجب أن يعاير ضد نفس منحنى القياسية.
  4. إعداد عينة
    1. تخطيط وتسجيل النظام تحميل السلالم وعينات لمدة 2 ز متطابقةإلس: هلام 1 لنقل وهلام 2 كعنصر تحكم التحميل. تحميل عنصر التحكم والعينات "تعامل" بالتتابع لتفادي أي تحيز التي يمكن أن تنشأ مع الفقراء أو لا لبس فيه نقل.
    2. حساب حجم البروتين المطلوبة لكل عينة. حمولة البروتين القياسية للكشف عن البروتينات في الخلايا العصبية العزلات هو 15 ميكروغرام. جعل كل عينة تصل إلى حجم 10 ميكرولتر مع DH 2 O. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة تحميل، دوامة والحرارة على 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    3. تشمل عينة مراقبة إيجابية مثل البروتين المؤتلف للمساعدة في تحديد الفرقة الصحيحة من الفائدة. ومع ذلك إعداد عينة مراقبة إيجابية بشكل صحيح المبادئ التوجيهية التالية الشركة المصنعة لتجنب اختيار الفرق خاطئة. انظر الشكل 1.

الشكل 1
الشكل 1. Pاختيار السيطرة ositive. إضافة الضوابط الإيجابية لتجربة تؤكد وضع العلامات الكشف حقيقي. ومع ذلك، يجب أخذ الحذر لضمان التحكم الخاصة بك تعمل بشكل صحيح قبل استخدام العينات التجريبية. تم تحميل) بروتين فيوجن TREM 2 في المبادئ التوجيهية الشركة المصنعة من 1 ميكروغرام / مل، ولكن العلامات لوحظ في 110 النزاعات كيلو دالتون مع ورقة البيانات وتوقع الجزيئي وزن 60-70 كيلو دالتون. ب) بعد إضافة والحضانة مع وكيل الحد، تم الكشف عن وصفها البروتين الانصهار في الوزن الجزيئي وتوقع. ومع ذلك، وهذا يعني هناك حاجة لمزيد من حمولة البروتين كما انخفضت عملية تخفيض إشارة من البروتين.

2. الكهربي فصل البروتينات

  1. إعداد 4-12٪ هلام مكرر / تريس (1.0 مم)
    ملاحظة: يتم استخدام المواد الهلامية التدرج لإنتاج المزيد من الفصل البروتين عبر مجموعة واسعة الوزن الجزيئي.
    1. اختيار وإعداد MESأو اجتماعات الأطراف تعمل عازلة (1 لتر لكل خزان) عن طريق تمييع مع DH 2 O. عازلة MES تنتج أفضل قرار من البروتينات داخل 3،5 حتي 160 كيلو دالتون في حين المماسح ويفضل تشغيل عازلة للكشف عن البروتينات ذات الوزن الجزيئي العالي فوق 200 كيلو دالتون ولكن سوف يكون قرار فقرا أقل من البروتينات الوزن الجزيئي أقل من 15 كيلو دالتون.
    2. إزالة مشط وشريط من الشريط الذي يغطي سفح هلام. غسل بلطف الآبار خارجا مع تشغيل العازلة باستخدام ماصة 1 مل. ملء الآبار مع تشغيل العازلة وضمان بقاء جود فقاعات في هلام.
  2. إعداد جل والتحميل
    1. إدراج المواد الهلامية في خزان وملء هلام حجرة مشتركة مع تشغيل عازلة لضمان جميع الأختام تعمل على نحو فعال.
    2. إضافة 3 ميكرولتر من معيار الوزن الجزيئي في أول بئر في هلام هلام 1 و 2. تحميل 10 ميكرولتر من كل عينة في آبار اللاحقة.
      ملاحظة: فيما عدا السلالم، هلام 1 & 2 هلام يجب أن تكون متطابقة. فمن الضروري عشرفي مرحلة ما قبل الملون معيار الوزن الجزيئي المستخدمة في هلام 2 هي الأزرق وضوحا عند استخدام الإجمالية صمة عار البروتين من أجل أن تكون مرئية في القناة 700 من أوديسي تصوير.
    3. مرة واحدة يتم تحميل المواد الهلامية على حد سواء، وملء خزان مع العازلة المتبقية تشغيل وتأمين الغطاء.
  3. الكهربائي
    1. "تشغيل" هلام في 80 فولت لمدة 4 دقائق لضمان عينة يدخل مصفوفة هلام بولي أكريلاميد بطريقة موحدة. بعد ذلك زيادة في الجهد والوقت ل180 V لمدة 50 دقيقة على التوالي أو حتى يمكن رؤية عينة صبغة عند سفح هلام.
      ملاحظة: ارتفاع الفولتية يمكن تطبيقها لتحقيق الأوقات المدى أقصر. ومع ذلك، فإن هذا قد يؤدي إلى المواد الهلامية "مبتسم" حيث العينات الوسطى من المواد الهلامية تشغيل أسرع من العينات حارة الخارجية الناجمة عن زيادة في درجة حرارة 14.

3. مجموع اللطخة البروتين من جل السيطرة تحميل

  1. هلام الإصدار 2 من الكاسيت باستخدامسكين هلام. إزالة الآبار والقدم من هلام. بمناسبة هلام لمساعدة التوجه.
  2. صب حوالي 30 مل من البروتين وصمة عار في طبق بتري مربع (الحجم التقريبي 12 × 12 سم). وضع الجل 2 إلى وصمة عار البروتين، وضمان حل تغطي جل بأكمله، ثم تستنهض الهمم هلام لأدنى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وصمة عار.
  3. صب وصمة عار البروتين وغسل 3X هلام في الماء المقطر قبل التصور. انتقل إلى الخطوة 6.3 لتصور.

4. I-البقعة شبه الجاف سريع نقل البروتين

ملاحظة: جميع الكواشف اللازمة لنقل البروتين باستخدام جهاز I-البقعة من المنتجات التجارية التي صممت خصيصا لمنهجية I-البقعة ويمكن العثور عليها في قائمة المواد.

  1. إعداد "القاع" نقل المكدس. إزالة غطاء احباط وما قبل الرطب مع تشغيل عازلة مباشر من خزان هلام. ورق الترشيح قبل الرطب مع الماء المقطر.
  2. كرر الخطوة 3.1 و جل 1 مكان علىعلى استعداد "القاع" نقل المكدس.
  3. وضع ورقة الترشيح ما قبل الرطب على هلام. لفة ورقة الترشيح وهلام لضمان عدم وجود فقاعات محاصرون بين الطبقات.
  4. إزالة الغطاء احباط من نقل كبار المكدس ووضع كومة العلوي على رأس ورقة الترشيح وكومة القاع. لفة نقل كومة "ساندويتش" للقضاء على أي فقاعات الهواء.
  5. إدراج الاسفنجة من مجموعة نقل كومة على غطاء الجهاز I-البقعة. وضع شطيرة نقل كومة على مساحة مخصصة على جهاز I-البقعة ثم غطاء قريب آمن. بدء I-البقعة ونقل عن 8.5 دقيقة على برنامج 3.
  6. إذا كان هناك إشارة بروتين منخفضة أو عالية متفاوتة: انخفاض نسب البروتين الوزن الجزيئي، واختبار مرة نقل الشركة المصنعة عند استخدام شبه الجافة "سريع" أسلوب النقل. تشغيل بروتوكول الأمثل بسيط باستخدام يكرر عينة من الحمولة مطابقة لتحديد نقل المثالي مزيج الوقت / الجهد كما رأينا في الشكل 2 .

الرقم 2
وقطعت الرقم 2. الأمثل للنقل باستخدام I-البقعة. A) جل احدة محملة سلم و 15 ميكروغرام من الفئران جناسة الدماغ كله في ثلاث يكرر جنبا إلى جنب إلى ثلاثة أقسام. لم ينقل مقطع واحد، تم نقله واحد مقابل 7.5 دقيقة (حسب إرشادات الشركة المصنعة) واحد مقابل 8.5 دقيقة. ثم تم ملطخة الأقسام هلام مع البروتين الفوري الزرقاء وصمة عار، مسحها ضوئيا على تصوير بالأشعة تحت الحمراء في القناة 680 وكميا. ب) التمثيل البياني للقيم الكمي مما يدل على الفرق في محتوى البروتين المتبقي من كل هلام يلي 0، 7.5، و 8.5 دقيقة نقل. لاحظ أن دقيقة إضافية من الوقت نقل أسفرت عن نقل بروتين إضافي من ما يقرب من 45٪.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغا "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. الكشف عن الأجسام المضادة للبروتينات

  1. إعداد الغشاء ومنع
    1. إزالة نقل كومة من الجهاز I-البقعة. إزالة أعلى ورقة الترشيح طبقة فضح هلام على نقل كومة القاع.
    2. قطع حول هلام مع مشرط وضمان خفض الثلاثي لأغراض التوجه يتمثل في الغشاء. بعد تقليم الغشاء والبروتين وصمة عار في هلام للتحقق كفاءة نقل و / أو تجاهل.
    3. بسرعة تحرك غشاء نظيفة في أنبوب 50 مل (أو وعاء ما يعادلها) تحتوي على 5 مل من 1X PBS ومكان على الأسطوانة الميكانيكية (أو المنصة المدارية) عن التحريض المستمر.
      ملاحظة: ومن الأهمية بمكان أن لا يسمح الغشاء لتجف. خلال نقل شبه الجافة الغشاء سوف تصبح ساخنة. الانتظار 2 دقيقة قبل فتح كومة نقل وهذا سوف يسمح طر لتبريد البطيء ووقت التجفيف خلال كومة التفكيكية. استخدام الأسطوانة وأنبوب للالانفعالات خلال يغسل وحضانات يسمح انخفاض كبير في حجم الحلول المطلوبة.
    4. غسل دقيقة غشاء 3 × 5 في برنامج تلفزيوني 1X. تجاهل 1X PBS ومنع الغشاء مع عازلة تمنع غير مخفف لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد الأجسام المضادة الأولية.
    1. إعداد الأجسام المضادة الأولية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة في 5 مل من حجب العازلة مع 0.1٪ Tween20. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية مستعد ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية مع التحريض المستمر.
      ملاحظة: حجب عازلة يستخدم عادة غير مخفف ولكن قد تكون مخففة تصل إلى 1: 4 مع PBS إذا كانت الأجسام المضادة الأولية لديه خصوصية عالية بما فيه الكفاية.
    2. التخلص من الأجسام المضادة الأولية وغسل غشاء 6 مرات لمدة 5 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني 1X.
  3. اختيار الأجسام المضادة الثانوية وإعداد
    1. لسيكوndary وصفها إلا تقييم لأغراض المراقبة، تجاهل الخطوات 5.2.1 و 5.2.2 أعلاه وانتقل إلى الخطوة 5.3 لتحديد أنماط النطاقات الثانوية عينة محددة. انظر الشكل 3.

الرقم 3
الشكل 3. الأمثل من الأجسام المضادة الثانوية. A) مقارنة الأنواع المتعددة من الثانوي العلامات غير محددة الوحيد ضد 15 ميكروغرام من الفئران (M)، صوف (O) وفرسي (E) الخليط النسيج العصبي مع مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة الثانوية فلوري الموسومة . L هو سلم الوزن الجزيئي. كان جناسة الأنسجة الأغنام العينة الوحيدة التي عبر تتفاعل مع وضع العلامات الثانوي عند استخدام حمار المضادة للماعز 800 الضد. ب) من المهم أيضا للتأكد مما إذا حدث العلامات غير محددة عند استخدام عينة الأنسجة المختلفة، أي عضلة الساق الفئران (15 _6؛ ز تحميل). هذه العينة عبر يتفاعل مع الجسم المضاد الثانوي حمار المضادة للماوس 680، ولكن هذا لم يحدث عند استخدام الماوس جناسة الدماغ.

  1. إعداد فلوري الموسومة الضد الثانوية 680 أو 800 (الأحمر أو قناة خضراء) في أعقاب المصنعة أوصى التركيزات في عرقلة العازلة مع 0.1٪ Tween20. احتضان الغشاء في الظلام مع الأجسام المضادة الثانوية على استعداد لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض المستمر.
  2. التخلص من الأجسام المضادة الثانوية وغسل غشاء 6 مرات لمدة 5 دقائق في غسل مع 1X PBS. انتقل إلى الخطوة 6 - التصور.
    1. إذا لا يعمل كما هو متوقع تصور علامات، سلالم الامتحان مع مجموعة من الأجسام المضادة الثانوية كخطوة إضافية مناسبة. ليس كل الأجسام المضادة الثانوية تسمح التصور من جميع نطاقات علامة في جميع السلالم متوفرة تجاريا.
    2. إذا العصابات المتوقعة هي غير مرئية، استخدم مضيف الثانوي البديل، أي دونكEY مكافحة أرنب أرنب مقابل الماعز المضادة يمثل تعديل بروتوكول مناسب. انظر الشكل 4. الأنواع المضيف تستخدم لرفع الأجسام المضادة الثانوية يمكن أن تسبب أحيانا مشكلة مع التصور بسبب عدم وجود خصوصية لالأجسام المضادة الأولية محددة.

الرقم 4
الرقم 4. استكشاف الأجسام المضادة الثانوية خصوصية طخة غربية مجموعة من عينات الأنسجة (بروتين 15 ميكروغرام لكل حارة) - الدهون والعضلات والكبد والعظام - حضنت مع الأجسام المضادة الأولية إرك وحضنت مع ثلاثة الأجسام المضادة الثانوية المختلفة. أعلى لوحة: WB المسمى مع LI-COR الماعز المضادة للأرنب 680 الضد الثانوية أنتجت العلامات ضعيف من الدهون والعظام والكشف عن أي إشارة في عينات الكبد والعضلات. تم تجريد غشاء (من اللوحة العلوية) وrepr: لوحة المتوسطة عوبيد باستخدام منهجية ECL والماعز المضادة للأرنب HRP مرتبطة الثانوية. العصابات واضحة الآن في العضلات والكبد العينات ويبدو وضع العلامات أكثر كثافة من الدهون والعظام العينات. تم تجريد غشاء (من أعلى لوحة والمتوسطة) وreprobed باستخدام LI-COR حمار المضادة للأرنب 680 الضد الثانوية التي أظهرت قابلية أكبر للالأجسام المضادة الأولية إرك: اللوحة السفلية. وضع العلامات على العضلات والكبد هو الآن مرئية مع زيادة كثافة إشارة من كلا الدهون والعظام العينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. التصور

ملاحظة: يتم الحصول على جميع الصور باستخدام تصوير LI-COR أوديسي كلاسيكي وصورة المرتبطة برو تحليل البرمجيات (الإصدار 3.1.4).

  1. تحويل وتسجيل الدخول إلى الكمبيوتر وتصوير. فتح برامج التصوير وإنشاء ملف جديد. انظر الشكل 5.

"jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الرقم 5
الرقم 5. التصور النوعي والكمي لطخة غربية. مسح لطخة غربية تظهر الفئران عضلة الساق (30 ميكروغرام تحميل) بحث مع الأضداد Annexin الخامس الابتدائي (36 كيلو دالتون) والماعز المضادة للأرنب 800 الضد الثانوية. تم تفحص الغشاء وتصور في القناة 800. لقياس البروتين (Annexin V)، يتم رسم مربع مستطيل حول عصابة من الاهتمام من عينة 1. ثم يتم نسخ ولصق هذا على الممرات عينة المتبقية لضمان قياس من نفس المنطقة. وشكلت الخلفية تلقائيا حول شكل رسمها ولكن هذا يمكن تعديلها لضمان قياس الخلفية ويعرف بدقة. يعرض الجدول أدناه القياسات الكمية من كل شكل مرسومة بما في ذلك إشارة الإجمالية التي تم الحصول عليها، وإشارة الخلفية مع خلفية طرح. ومن ثم يمكن تصديرها الى هذه المعلوماتبرنامج جدول بيانات لحساب نسب التعبير (على النحو الذي تحدده كثافة مضان النسبية) ويسمح التحليلات الإحصائية التالية التي يتعين القيام بها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. فتح غطاء للتصوير. صب كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني 1X إلى الزجاج على أسفل الزاوية اليسرى ثم وضع غشاء على رأس برنامج تلفزيوني. ضمان الغشاء هو مربع مع محور على تصوير والفجوة 1 سم ويترك بين الغشاء ومحور الشبكة.
    1. لفة الغشاء لضمان عدم وجود فقاعات محاصرون بين الزجاج والغشاء.
    2. حساب عدد المربعات تحتل الغشاء على x و y المحور. إغلاق الغطاء للتصوير. أدخل عدد من الساحات ويحتل الغشاء على برامج الكمبيوتر.
    3. اختيار القناة المناسبة لفحص الغشاء الذي سيعتمد على علامة الفلورسنتمن الأجسام المضادة الثانوية، أي 700 أو 800 قناة قناة عندما تم استخدام 680 أو 800 الأضداد الموسومة الفلورسنت على التوالي. عندما يتم وضع العلامات مزدوج خارج، مسح في كل القنوات.
      ملاحظة: تحسين وضع العلامات بروتين واحد قبل القيام الوسم المزدوج.
    4. تحديد كثافة لفحص الغشاء، إذا كان البروتين وفرة عالية تستخدم الاشعة كثافة منخفضة. بدلا من ذلك إذا كان لديه ضعف الأجسام المضادة الأولية للتقارب البروتين من الفائدة اختيار أعلى كثافة الاشعة، أي مستوى 5. اضغط على بدء لبدء المسح الضوئي. انتقل إلى الخطوة 6.4.
  2. التصور من هلام تحكم التحميل (الشكل 6).
    الرقم 6
    الرقم 6. مجموع العلامات البروتين والتحليل. أ) صورة من البروتين الكلي المسمى جل تحتوي على 20 ميكروغرام من الخيول عنق الرحم جناسة العقد لكل حارة. ب) جل من لوحة والممسوحة ضوئيا في 680 قناة. C) رسم بياني لقياس كمية من البروتين الكلي الملون هلام الحصول عليها باستخدام برامج التصوير. وهناك مجموعة من القياسات التي تحددها علامات الوزن الجزيئي، أي 30-110 كيلو دالتون، وتؤخذ لتوفير قياسات الرسم البياني لضمان الخطأ المعياري (SEM) منخفضا (من العينات المجمعة) مشيرا إلى أن مجموع مستويات البروتين في كل عينة موحدة عبر هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
    1. اتبع الخطوات من 6.1 و 6.2.
    2. صب الماء المقطر على الزجاج في الزاوية السفلية للتصوير حيث يبدأ محور الشبكة.
    3. وضع الجل على سطح الماء والمناورة حتى الممرات هي عمودي إما X أو Y محور الشبكة. ترك فجوة 1 سم بين محور Y و X من الشبكة وهلام وحساب عدد المربعات هلام تحتل على محور الشبكة. قريبغطاء للتصوير.
    4. أدخل عدد من الساحات هلام تحتل على برامج الكمبيوتر.
    5. حدد القناة 700 لفحص البروتين الكلي الملون هلام.
      ملاحظة: أزرق تتفلور في القناة 700.
    6. تعيين الكثافة إلى 5 وبداية الصحافة.
  3. الكمي للصورة الممسوحة ضوئيا
    1. ضبط السطوع والتباين أزرار لإنتاج أفضل جودة الصورة. إذا يبدو أن هناك ضجيج في الخلفية عالية، وإعادة تفحص الغشاء في أقل كثافة واستخدام الإعداد المسح الضوئي عالية الجودة.
      ملاحظة: إن أي تعديلات لا تغير من البيانات الفلورسنت المكتسبة عند إجراء المسح الضوئي.
    2. تدوير الصور 90 درجة و 180 درجة و 270 درجة من أجل عرض في الاتجاه المطلوب مع أي تغيير في البيانات التي حصل عليها. ومع ذلك، عندما إجراء تعديلات صغيرة من التوجه في "التناوب الحر"، من خلال أكبر من 3 درجات، البيانات التي حصل عليها في القيم غرابة الأطوار يمكن أن تصبح مشوهة، وبالتالي يؤثر على نتائج القياس الكمي.
    3. حدد شكل من الأشكال القائمة - استخدام مستطيل في معظم الحالات - ورسم حول عصابة من الفائدة (WB) أو حارة كامل (إجمالي هلام بروتين) في عينة حارة 1.
    4. نسخ ولصق الشكل عبر لعينة حارة 2 عصابة من الفائدة أو حارة بأكملها. تكرار عبر كل فرقة الفردية التي تهم كل عينة وكل حارة لمجموع المواد الهلامية البروتين.
    5. تأكد من قياس الخلفية لا يتضمن إشارة في حارة المقبل. الخلفية يمكن أن يتم خصمها تلقائيا من قبل البرنامج وتشمل حافة كاملة حول شكل مرسومة أو أنها يمكن أن تكون محددة لتكون أعلى / أسفل أو اليسار واليمين من الشكل. بدلا من ذلك، تعيين مربع الخلفية التي يحددها المستخدم.
    6. عرض إشارة للجدول الأشكال لكل شكل مرسومة في وحدات الفلورسنت التعسفية. سيتم تلقائيا خصم الخلفية من إشارة.
    7. تصدير الصورة كملف TIF إلى عرض في البرامج المختلفة. لا تصدير الصور والتلاعب باليودسوف نانوغرام غير الصورة الموالية البرمجيات وهذا يغير البيانات الأصلية التي اكتسبها تصوير توليد بيانات كاذبة.
    8. كرر الخطوات 6.4.3-6.4.7 عند قياس العلامات مزدوج أو إجراء قياسات متعددة على المواد الهلامية تحكم التحميل لتوليد وجمع البيانات الخطأ القياسية.

7. مشاركة والتصور

  1. إبقاء الأغشية في برنامج تلفزيوني 1X أو تجفيف للتخزين طويل الأجل للمستقبل إعادة التحقيق وتجريد الأغشية لالبروتينات الأخرى ذات الاهتمام.
  2. تجريد وإعادة التحقيق من الأغشية. انظر الشكل 7.
    الرقم 7
    الرقم 7. غشاء تجريد وreprobing. أمثلة التمثيلية للأغشية الخطوات التالية تجريد مختلف الممسوحة ضوئيا مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء. A. تم تنفيذ أول مناعي من الأجسام المضادة الأولية مع CSP (أرنب) وفحصها في 700 قناة. ب. تجريد أولا وreprobing مع ROCK2 (أرنب) مع 800 قناة. البرتقال السهم يشير المتبقي CSP الأجسام المضادة الأولية الحالي بعد الشريط وإعادة التحقيق. هذا لا يؤثر على قياس ROCK2 كما كانت الفرقة هي الحاضرة في أعلى الوزن الجزيئي (السهم الأبيض). C. تجريد الثانية وreprobed مع β إسبكترن الأجسام المضادة (الماعز) وتصور في 800 قناة. D. تجريد الثالث وreprobing مع الضد α-synuclein (أرنب). E. تجريد الرابع وreprobing مع الأجسام المضادة اليوبيكويتين (الماوس) مع 800 قناة. لا يزال هناك إشارة المتبقية من الأجسام المضادة الماضي (α-synuclein. السهم البرتقالي). F. تجريد الخامس وreprobing مع الأجسام المضادة CALB2 (أرنب) المصورة في 700 قناة. كانت تستخدم الأجسام المضادة الثانوية: 800cw الماعز المضادة للماوس، الماعز المضادة للأرنب 680rd، الماعز المضادة للأرنب 800cw، حمار 800cw مكافحة الماعز (انظر قائمة المواد). حارة العلامات: L - سلم، 02/0160، - عينة 1/2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
    1. مكان غشاء (ق) في طبق بتري مربع التي تحتوي على حوالي 30 مل من Revitablot عازلة تجريد ويتم تحضين بين 5-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض المستمر.
    2. غسل غشاء (ق) 3 مرات في برنامج تلفزيوني ثم إعادة تفحص على تصوير لضمان إزالة كاملة من مضان حدث - وينبغي تكرار هذه الخطوة بعد كل قطاع.
    3. احتضان الغشاء (ق) لفترات أطول إذا ظل مضان. إعادة تفحص الغشاء بعد كل قطاع لتأكيد عدم وجود أي إشارة الثانوية المتبقية.
      ملاحظة: غشاء (ق) ينبغي ألا يجرد reprobed وبحد أقصى 3 مرات من أجل ضمان سلامة الغشاء لم ينل مما أدى إلى ارتفاع الخلفية غير المرغوب فيها للإشارة إلى النسبة.

Representative Results

كما QFWB حساسية ومجموعة خطية من كشف أكبر من كشف ECL التقليدي، وهناك عدد من تدابير الرقابة التي تعتبر حاسمة لضمان دقة البيانات التي يتم جمعها، وبالتالي المساعدة على تفسير فعالية. أولا، إدراج عينات مراقبة إيجابية كما هو مبين في الشكل رقم 1. ثانيا، الاستفادة المثلى من نقل لضمان حركة المكافئة للبروتينات عالية ومنخفضة الوزن الجزيئي من الهلام إلى الغشاء كما عرضت في الشكل 2. ثالثا، الاستفادة المثلى من الأجسام المضادة والثانوي خاصة الأجسام المضادة التي الأمثل غالبا ما يتم تجاهله، ولكن التي يمكن أن تنتج غير محددة النطاقات قادرة على التدخل في التفسير الصحيح للبروتين (ق) من الفائدة. انظر الشكل 3. رابعا، قد يكون الحال أيضا أنه عندما يظهر بروتين غير قابل للكشف لكن من المتوقع أن تكون موجودة، وهذا قد يكون أيضا مسألة الأجسام المضادة الثانوية التي يمكن تصحيحها ببساطة عن طريق استخدام الريس الثانويةإد في مجموعة مختلفة الأنواع. انظر الشكل 4. خامسا، وضع العلامات البروتين الكلي والتحليل هي طريقة أكثر قوة بكثير للقياس ومقارنة لاستخدام بروتين واحد التقليدية (ق) التي يتم التعبير بتواجد مطلق للمعايير المرجعية الداخلية 3. تم العثور على العديد من هذه البروتينات واحدة أن أعرب تفاضلي في نماذج من الأمراض العصبية وكذلك بين عينات من الأنسجة المختلفة وتوحيد التعبير يمكن أن يغير داخل نفس النسيج 3. وبالتالي، فإن إنتاج مادة هلامية السيطرة التحميل يجب التأكد من انتظام الحمل عينة عندما جنبا إلى جنب مع تحليل البروتين الكلي من خلال مقارنة وقياس حمولة البروتين في كل حارة في مختلف الأوزان الجزيئية يتراوح قياسها ضد كل عينة لبيان الخطأ المعياري كما هو موضح في الشكل (6) . والأهم من كل هذه التقنيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها وضوابط فعالة مثل الحساسية واتساق التحليل ر فقطools المطبقة من قبل المشغل (الشكل 5). أخيرا هذه التقنية يفسح المجال لتجريد وإعادة التحقيق من الأغشية مع المزيد من المرونة من ECL بسبب عوامل بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر زيادة الحساسية، وخفض الخلفية، كشف اللون المزدوج والاستقرار الغشاء تحت ظروف التخزين على المدى الطويل. انظر الشكل 7.

Discussion

الاعتبار الواجب والتخطيط أمر ضروري قبل أي التجربة ويمكن تحديد نهاية المطاف نجاح التقنية المستخدمة. التقدم في الكشف عن البروتين باستخدام WB يمكن تقديم مجموعة كبيرة من العقبات المحتملة عند محاولة اختيار الأجسام المضادة، ونقل التصور والطرق المناسبة للاستخدام. لحسن الحظ، وذلك باستخدام قائمة مراجعة متأنية وتدابير الرقابة المناسبة QFWB يمكن استخدامها بشكل روتيني لتحديد وجود البروتين والخلافات التعبير خفية متزايد بين العينات. وينص هذا البروتوكول دليل شامل لالفلورسنت النشاف الغربي الكمي فضلا عن عدد قليل من الاستراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتجنب و / أو التغلب على بعض من كثير من المزالق الشائعة المرتبطة به.

الخطوات الحاسمة المستخدمة للحفاظ على حساسية والحصول حقا وتشمل قياسات قابلة للقياس وقابلة للمقارنة: 1) قوي استخراج البروتين من عينات الأنسجة. 2) إعداد العينة؛ 3) دقيقة البروتين من التحميلز يحددها الكلي تحليل البروتين. 4) نقل الأمثل للبروتينات باستخدام I-البقعة. 5) إعداد الأجسام المضادة الأولية والثانوية في عرقلة العازلة التي تحتوي على 0.1٪ Tween20، و6) التصور الصحيح والتحليل باستخدام الأشعة تحت الحمراء تصوير والبرامج المرتبطة بها.

الكشف الفلوري بالأشعة تحت الحمراء هو حقا الكمي ويوفر حساسية أكبر مقارنة مع المزيد من التقنيات التقليدية كشف ECL 3،11. هذا النظام هو الكشف متعدد الأوجه، وعلى هذا النحو لا يقتصر على QFWB. هذا النظام قادر على التصوير من العلامات immunohistological في الطاقة المنخفضة مما يسمح التصور النوعي والكمي لأقسام الأنسجة كلها 12. وهذا هو المجال الوحيد للتنمية المستقبلية المحتملة من حيث القرار الذي يمكن أن نرى التصوير الحمراء بعيدة ينافس اسر المناعي التقليدي مع المجاهر التقليدية من حيث التقييم الكمي.

ومع ذلك، مع حساسية أكبر للتغيرات الطفيفة في صrotein التعبير من الأهمية بمكان لضمان تقلب يتم الاحتفاظ بها إلى الحد الأدنى والسيطرة على تدابير صارمة مع بروتوكولات قوية. هذا يبدأ مع الدقيق استخراج البروتينات من عينة الأنسجة تليها إنتاج البروتين الكلي ملطخة المواد الهلامية لتقديم ضمانات بأن عينة التحميل هو الزي الرسمي، والاستفادة المثلى من الأجسام المضادة الأولية والثانوية من أجل تحديد ما إذا كان كشف حقيقي واختبار المبادئ التوجيهية الشركة الصانعة فيما يتعلق بنقل الأوقات للحصول على نقل البروتين الفعال.

ومع ذلك، وحتى عندما يتم تحسين شروط البنك الدولي، وهناك قد لا تزال المشاكل المرتبطة بإدارة الغربيين قد لا تم استكشافها بالكامل هنا. وتشمل هذه ولكنها لا تقتصر على العوامل من بينها إذابة البروتين واختيار استخراج العازلة. يمكن لبعض مخازن تتداخل مع المقايسات تركيز البروتين، وبعض الأنسجة من الصعب بشكل خاص للذوبان، والتي تتطلب تقنيات أكثر قوة مثل استخدام macera الآليتينغ حاويات مختومة مثل أنابيب M جنبا إلى جنب مع dissociator أجهزة ماكينتوش. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للتدابير الرقابة بسيطة لتخزين المواد المستخرجة وغير المستخرجة-في -80 درجة مئوية يكون الفرق بين الحصول على العلامات الأمثل مباشرة بعد استخراج وجود وقت لاحق من النتائج السيئة أسابيع.

وأثبتت الأساليب الحديثة QFWB أن تكون أكثر حساسية لالتقاط الفروق الدقيقة في تعبير البروتين ويسمحون أكثر تنوعا في وقت واحد وضع العلامات مزدوج 3 بالمقارنة مع التقنيات القديمة مثل ECL. فمن الأهمية بمكان أن بروتوكولات النشاف الغربية هي قوية وقابلة للتكرار بسهولة لالكمي الدقيق والتحليل الإحصائي. هذا البروتوكول هو حساس وقوي بما فيه الكفاية ليتم استخدامها بشكل روتيني للكشف عن البروتينات عبر مجموعة متنوعة من عينات الأنسجة المختلفة والأنواع 3 و يسمح الكمي للبروتينات وفرة المنخفضة والعالية داخل نفس QFWB بالتالي الحد من استخدام الاستهلاكية فضلا عن الوقت في التجربة 11 وبالإضافة إلى ذلك، فإن زيادة حساسية هذه التقنية تتيح التحقق من شعبية متزايدة - دراسات OMIC 9،14 لكن دقة أمر بالغ الأهمية وإدراج تدابير الرقابة المناسبة يجب الالتزام بها وبالتالي تجنب الحصول على البيانات الخاطئة.

Acknowledgments

نود أن يشكر التالية للحصول على الدعم المالي: معهد BBSRC تمويل البرامج الإستراتيجية - CF & TMW. التمويل BBSRC الشرق بيو DTP - LG. داروين الثقة ادنبره - MLH. نود أيضا أن نشكر الدكتور باري مكول للحصول على إذن لتشمل التحسين TREM2 في هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA Buffer Fisher Scientific UK Ltd 10230544
M Tubes Miltenyi Biotec Inc. 130-093-236
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular Life Technologies, UK IB401001
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) Life Technologies, UK LC5602 Use in gel 1 for Western blotting
SeeBlue Pre-stained protein standard Life Technologies, UK LC5625  Use in gel 2 Total protein stained gel
NuPAge LDS Sample buffer 4x Life Technologies, UK NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20x) Life Technologies, UK NP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well Life Technologies, UK NP0322BOX
Phosphate buffered saline tablet Sigma-Aldrich, UK P4417-100TAB
Micro BCA, Protein Assay Kit Fisher Scientific UK Ltd 10249133
Odyssey blocking buffer Li-Cor Biosciences P/N 927-40000
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences 926-68071
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg  Li-Cor Biosciences 926-68072
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences 926-32211
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences 926-32214
ODYSSEY CL Infra-red imager Li-Cor Biosciences Call for quotation
iBlot 7-Minute Blotting System Life technologies, UK This model is no longer in production
InstantBlue Protein stain Expedeon, UK ISB1L
Revitablot western blot stripping buffer  Rockland Immunochemicals Inc. MB-085-0050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 1992, (24), 145-149 (1979).
  2. Walker, J. M. Protein Protocols on CD-ROM. Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).
  3. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10 (2008).
  4. Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 8, (8), 72457 (2013).
  5. Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots. Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).
  6. Colella, A. D., et al. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 430, (2), 108-110 (2012).
  7. Zellner, M., et al. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).
  8. Kielar, C., et al. Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease. Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).
  9. Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy. Genome Med. 5, (10), 95 (2013).
  10. Wishart, T. M., et al. Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 124, (4), 1821-1834 Forthcoming.
  11. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
  12. Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism. J Neurochem. 93, (5), 1168-1176 (2006).
  13. Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells. Biol Proceed Online. 10, (1), 20-28 (2008).
  14. Wishart, T. M., et al. Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene. Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).
  15. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis. J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics