Очищение нечистых: секвенирование метагеномов и Metatranscriptomes от сложных образцов животного связано

Biology
 

Summary

Использование муковисцидоза дыхательных путей в качестве примера, рукопись представляет собой комплексный технологический процесс, включающий сочетание метагеномных и metatranscriptomic подходов для характеристики микробных и вирусных сообществ в образцах животных-ассоциированной.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Доступность высокопроизводительного секвенирования революцию многих областях биологии. Для того, чтобы лучше понять хостов, ассоциированных вирусных и микробных сообществ, была разработана комплексная рабочий процесс для ДНК и РНК добычи. Рабочий процесс одновременно создает вирусных и микробных метагеномов, а также metatranscriptomes, из одного образца для следующего поколения секвенирования. Связь этих подходов дается обзор обеих таксономических характеристик и закодированы общественные функции. Представленные способы использовать муковисцидоза (CF) мокроты, проблемный тип образца, потому что это чрезвычайно вязким и содержит большое количество муцина, свободный нейтрофилов ДНК, а также другие неизвестные примеси. Протоколы, описанные здесь, нацеленные на эти проблемы и успешно восстановить вирусной и микробной ДНК с минимальным загрязнением ДНК человека. В дополнение к Метагеномика исследования, протокол metatranscriptomics была оптимизирована для восстановления как микробныеи ведущий мРНК, которая содержит относительно мало рибосомальной РНК (рРНК) последовательности. Обзор характеристик данных представлен в качестве эталона для оценки успешности методов. Дополнительные образцы мокроты при МВ были собраны в (I) оценить согласованность микробиомом профилей по всей семи дней подряд в течение одного пациента, и (II) сравнить согласованность метагеномных подхода к генной основе секвенирования 16S рибосомальной РНК. Результаты показали, что суточное колебание микробных профилей без возмущения антибиотика минимальна и таксономии профили общих CF-связанных бактерий были очень похожи между библиотеками рДНК 16S и метагеномов генерируемых из гипотонического лизиса (HL) -derived ДНК. Тем не менее, различия между рДНК 16S профилей таксономических генерируется из общей ДНК и HL-производного ДНК показывают, что гипотонический лизис и стадий промывки пользу не только в удалении ДНК человека, полученных, но и микробного происхождения extracellulAR ДНК, которые могут исказить реальные микробных профилей.

Introduction

Вирусные и микробные сообщества, связанные с человеческим телом были широко исследованы в последние десятилетия благодаря применению технологии построения последовательностей 1,2. Результаты привели к признанию важности микробов в здоровье и болезни человека. Основным инициатива исходила от Микрофлора человека проектом, который описывает бактерии (и некоторое архей), находящегося на коже человека, и в полости рта, дыхательных путей, мочеполовой системы, желудочно-кишечного тракта 3. Дальнейшие микробиомом исследования здоровых дыхательных путей через бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) 4,5 и носоглотки мазков 4 показали, что легких может служить в качестве экологического устройства для взятия проб, результаты в переходном микробной колонизации в дыхательных путях. Тем не менее, влияние микробной колонизации нарушениям поверхностей дыхательных путей может привести к серьезным и хронических легочных инфекций, таких как те, в Муковисцидоз (МВ) пациентов.

т "> CF является смертельным генетическая болезнь, вызванная мутацией при муковисцидозе трансмембранного регулятора (CFTR) гена 6. Эти мутации приводят к дефектных белков CFTR, что, в свою очередь влияет на транспорт трансэпителиальный ионов через апикальной поверхности эпителия. Болезнь поражает несколько органов и систем, но большинство смертности и заболеваемости приходится на болезни легких при МВ 7. CF легких дает уникальную экосистему для микробной колонизации. дефект в транспорте ионов вызывает слизь накапливаться в CF дыхательных путей, создавая микросреды, состоящие из аэробных , микроаэрофильные, и анаэробные отсеки якорь статического богатой питательными веществами поверхности слизистой оболочки. Эта среда способствует колонизации и пролиферацию микроорганизмов, в том числе вирусных, бактерий и грибов. Острые и хронические легочные микробные инфекции приводит к постоянным, но неэффективных иммунного ответа, в результате чего обширное ремоделирование дыхательных путей, потеря способности легких, и в конечном счете пульмони капли провал.

Бактериальные сообщества, связанные с CF легких были хорошо описаны с использованием как культурно-зависимые и культуры независимой подходы, которые включают в себя использование 16S рибосомальной РНК (рРНК) секвенирование гена 8 и ружья Метагеномика 9,10. Подход 16S рРНК основе может характеризовать широкий спектр видов микроорганизмов и захватить широкие изменения в Основной разнообразия. Тем не менее, она ограничена в своей резолюции в определении сообщества (приведены в Claesson и др. 2010 11) и предсказания метаболических потенциалов ограничены теми общих функций, известных таксонов было выявлено. Таким образом, 16S рРНК методы секвенирования генов недостаточно для необходимой таксономической и функциональной аналитической точности различных микробных сообществ, присутствующих в CF легких. Метагеномных подход, описанный здесь дополняет подход 16S рРНК, основанного на преодолевает свои ограничения, и позволяет относительно эффективный способчтобы проанализировать как микробного сообщества таксономии и генетические содержание в CF легких.

Микробные ДНК, выделенную из образцов животных, ассоциированных часто содержит большое количество ДНК хозяина. CF мокроты или образцов легочной ткани, как правило, содержат большое количество ДНК человека выпущенный нейтрофилов в иммунного ответа, часто больше, чем 99% от общей ДНК 12 - 14. Хотя некоторые интактные клетки человека могут присутствовать, большая часть этой ДНК в растворе в свободном или адсорбируют на поверхности микробов. Кроме того, присутствие исключительно вязких пробками слизи, клеточных остатков и других неизвестных загрязнений дополнительно усложняет выделение микробных клеток. Несколько методов были испытаны на слой этих образцов ДНК человека, в том числе Перколл градиентов в отдельном человека от микробных клеток 15, обработкой ДНКазой I, бромистый этидий моноазид выборочно ухудшить ДНК человека 16, и комплект MolYsis, все с ограниченным успехом. На сегодняшний день наиболее эффективной процедуры очистки микробной ДНК CF мокроты был модификацией процесса, описанного Брайтенстайну и др. (1995) 17. Этот подход, известный как в данном способе гипотонического лизиса (HL), использует комбинацию β-меркаптоэтанола, чтобы уменьшить муцина дисульфидные связи, гипотонический лизис клеток эукариот и ДНКазы I обработку растворимого ДНК 9. Несмотря на отсутствие альтернативы способ HL вызывает некоторую обеспокоенность в связи с (I) возможных погрешностей в результате нежелательного лизиса бактерий и (II) наблюдаемые флуктуации в составе сообществ 9,10 ли артефакт вариаций, связанных с обработкой образца. В дополнение к генерации дробовика метагеномов, мы решить эти проблемы путем сравнения генных профилей 16S рРНК общей ДНК и микробной ДНК, выделенной из метода HL, используя тот же набор образцов мокроты, собранных из одного пациента через семь дней подряд.

ЛОР "> По сравнению с микробных сообществ, характеристика вирусных общин, связанных с животными ограничено 18,19 Вирусные общины в CF дыхательных путей были только характеризуется минимально 20 -.. 22 Первый метагеномных исследование, характеризующее ДНК вирусных общин в CF дыхательных путей показал, что большинство вирусов, связанные с CF легкие фаги 20. метаболический потенциал фага в CF и без МВ был значительно отличаются. В частности, фаг общины в МВ осуществляется гены отражает бактериальных принимающих адаптации к физиологии CF дыхательных путей, и бактериальные вирулентность 20. Последующие метагеномных исследования вирусов в легких при МВ ткани продемонстрировали отличную пространственную гетерогенность вирусных сообществ между анатомических областей 22. Кроме того, CF легочной ткани питал самую низкую вирусную разнообразие наблюдается на сегодняшний день в любой экосистеме 22. Большинство вирусов Были выявлены фагис потенциалом, чтобы заразить CF патогенов. Тем не менее, эукариотические вирусы, такие как вирусы герпеса, аденовирусов и папилломы человека, вирусы (ВПЧ) были также обнаружены. В одном случае, где наблюдались кисты в легочной ткани при вскрытии, более 99% из генома вируса папилломы человека была восстановлена, хотя пациент никогда не диагноз легочной папилломы или рака. Это указывает на то, что вирусная разнообразие присутствует не только отражает тяжесть повреждения тканей, но также может выявить и объяснить основную неохарактеризованных болезни. Протоколы, описанные здесь, обеспечивают простой, но эффективный способ изолировать вирусные частицы (VLP), из образцов, которые состоят из большого количества густой слизи, хозяина и микробных клеток, свободной ДНК, а также клеточная мусора.

В дополнение Метагеномика, metatranscriptomics используется для отслеживания динамики экспрессии генов через микробного сообщества и хозяина 9,23. В этом случае, как и микробного Ост мРНК должны быть преимущественно выбран. Так бактериальные мРНК не Полиаденилированную, олиго-дТ на основе мРНК выпадающее метод не может быть использован. Полиаденилирование-зависимой амплификации РНК не могут быть использованы в образцах принимающих ассоциированный если образцы, как известно, содержат большое количество эукариотических мРНК. Многие животные, связанные образцы, в том числе мокроты при МВ, содержат высокую плотность клеток в дополнение к высоким содержанием остатков клеток и нуклеаз, которые включают РНКазы. Таким образом, еще сложной задачей, чтобы предотвратить обширный деградации РНК в ходе metatranscriptome обработки. В большинстве случаев, общая РНК, выделенной из мокроты при МВ частично деградировали, ограничивая вниз по течению приложений и полезность полученной РНК. В последние годы несколько подходов к истощению рРНК были разработаны и адаптированы в коммерчески доступных наборов. Эффективность этих подходов, однако, ограничены, особенно при работе с частично деградированных рРНК 9,24. Методы, используемые здесь позволяютред для извлечения частично деградированной общей РНК, подходящую для эффективной последующей полного удаления рРНК. Прямое сравнение эффективности при удалении рРНК частично деградированных общей РНК сравнении двух различных наборов было проиллюстрировано Лим и др. (2012) 9.

В целом, цель этой рукописи является предоставление полного набора протоколов (Рисунок 1) для получения вирусных и микробных дробовика метагеномов, и metatranscriptome, от одного животного связаны образца, используя индуцированный мокроты в качестве примера. Молекулярная лаборатория рабочий должен включать следующее: выделенные зоны до и после усиления, чтобы минимизировать перекрестное загрязнение. Эти методы можно легко адаптировать к другим видам образцов, таких как ткани 22, носоглотки и ротоглотки тампоны 25, бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и кораллов (неопубликованные данные). Каждый образец должен быть обработан сразу же после сбора, особенно когда микробные Метагеномика и встретилсяatranscriptomics исследования лучшего. Если образцы были заморожены, он ограничивает выделение интактных микробных клеток для микробиологических метагеномов, как замораживание потенциально нарушить целостность клеток. Тем не менее, замораживание не исключает metatranscriptomics и выделения вируса, но качество РНК и количество вирусных частиц, извлеченных могут быть затронуты в процессе замораживания-оттаивания. Важно отметить, что мокроте служил в качестве основного источника образцов во многих исследованиях, связанных со взрослыми пациентами CF и других хронических легочных заболеваний 26,27 в БАЛ может быть слишком агрессивным. В наших исследованиях мокроты образцы были собраны с тщательным и последовательным методом проб, т.е., после полоскания рта и полоскания полости рта с использованием стерильного физиологического раствора, чтобы сохранить загрязнения микроорганизмами ротовой полости в образцах мокроты до минимума.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Индуцированные образцы мокроты были собраны в соответствии с Университетом Калифорнии Institutional Review Board (HRPP 081500) и Сан-Диего государственный университет Institutional Review Board (SDSU IRB # 2121), научно-исследовательским координатора в Университете Калифорнии, Сан-Диего (UCSD ) взрослый CF клиника.

1. по сбору проб и предварительной обработки (предварительная обработка образцы в течение 30 мин после сбора)

  1. До Сбор образцов, этикетки четыре 15 мл трубки как: (я) вирусная метагенома, (II) микробиологические метагенома, (III) metatranscriptome, и (IV) дополнительные мокроты. Повторите эти действия для каждого образца. Добавить 2 мл 0,1 мм кремнезема бисера в пробирку "Metatranscriptome", а затем 6 мл гуанидинизотиоцианата буфер на основе РНК лизиса (GITC лизиса буфера).
  2. Во время сбора образцов, используют стерильный солевой раствор (60 мл) в виде полоскания рта, чтобы свести к минимуму загрязнение микроорганизмами ротовой полости. Сбор образцов мокроты в течение периода времени 30 мин послевдыхание 4 мл 7% гипертонического раствора через небулайзер. Образцы процесса непосредственно, как описано ниже.
  3. Развести образца до общего объема 8 мл.
    1. Оценка объема выборки путем взвешивания пустой мокроты чашку до и после взятия пробы.
    2. Если объем выборки составляет менее 8 мл, добавить соответствующее количество 0,02 мкм фильтрованной 1x PBS для получения общего объема выборки, по крайней мере 8 мл.
    3. Сразу гомогенизации образца с 3 мл шприца, пока никаких видимых комков не остаются в мокроте
    4. Используя тот же шприц, составить 2 мл мокроты и немедленно приступить к шагу 1.4.
  4. Сохраняя при этом полный РНК из образца мокроты
    1. Подайте 2 мл образца мокроты, начиная с шага 1.3.4 в "metatranscriptome" пробирку, содержащую диоксид кремния шарики и GITC-буфера для лизиса.
    2. Закройте крышку и уплотнение трубки надежно парафильмом, чтобы избежать утечки.
    3. Сразу однородный мокроты на средней скорости в течение 10 мип. В зависимости от вихревом доступной, поместите трубку горизонтально и закрепите скотчем, если это необходимо.
    4. Хранить трубку при 4 ° С или в коробке со льдом и транспортировки в лабораторию, если необходимо.
  5. Используя тот же шприц, кратный 2 мл мокроты каждый в трубах с надписью "вирусный метагенома" и "микробная метагенома" и перевести оставшуюся мокроты из мокроты чашки в пробирку "экстра мокроты".
  6. Хранить все пробирки при температуре 4 ° С или на льду поле и транспортировки в лабораторию, если необходимо.

2. Создание Вирусный метагенома

  1. Получение Буферы и растворы:
    1. Подготовка 50 мМ дитиотреитола (DTT) в заранее и хранить при 4 ° С. Это является стабильным в течение 2 недель.
    2. Подготовьте физиологический раствор магния (SM) буфер (250 мл): 1 М NaCl, 10 мМ MgSO 4, 50 мМ Трис-HCl; доведения рН до 7,4. Фильтр стерилизуют (размер пор 0,02 мкм) и хранят при комнатной температуре. Подготовка ДНКазы I фермента 100 U / мкл (в воде молекулярного класса) из лиофилизированного бычьей поджелудочной железы ДНКазы I в соответствии с активностью, определенной блоком Dornase / мг сухого веса.
    3. Подготовка 10x ДНКазы I-буфера (50 мл): 100 мМ MgCl 2, 20 мМ CaCl 2; доведения рН до 6,5. Фильтр стерилизуют (размер пор 0,02 мкм) и хранят при комнатной температуре.
    4. Подготовка 4% параформальдегида.
    5. Подготовка 200x ТЕ-буфера: 2 М Трис-НСl (рН 8,5), 0,2 М ЭДТА. Фильтр стерилизуют (размер пор 0,02 мкм) и хранят при комнатной температуре.
    6. Подготовка 10 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS) с использованием воды молекулярно-биологического качества.
    7. Подготовка 50 мл СТАВ / NaCl (10% СТАВ. 700 мм NaCl), используя воду молекулярно-биологического качества. Растворите СТАВ ночь. Если осадки сохранятся, нагреть раствор при 65 ° С. Решение имеет высокую вязкость при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: фильтрация буферов, используя 0,02 мкм фильтр позволяет удалить вирус-одинаковых частиц в растворе, но небесплатно загрязнение нуклеиновой кислоты.
  2. Пробоподготовки
    1. Подготовка соответствующее количество свежего 6,5 мм дитиотреитолом (DTT).
    2. Развести гомогената путем добавления 0,02 мкм фильтрованный-буфера SM, чтобы генерировать общий объем 6 мл.
    3. Для помощи в растворения слизи, добавляют равный объем (6 мл) 6,5 мМ дитиотреитола (DTT) в образце вихревые энергично перемешивают и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
    4. Вихревой обработанный образец энергично и спина при 10 ° С, 3056 мкг в течение 15-20 мин.
    5. Собирают супернатант в новую пробирку 15 мл.
    6. Повторите шаг 2.2.3 и 2.2.5 для следующего образца.
    7. Передача и фильтрации супернатанта с 0,45 мкм фильтр, установленный на шприц в новую пробирку 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если сабо фильтр, получить образцы из шприца и пропустить шаг фильтрации.
    8. Возьмите 100 мкл подвыборки мкм фильтрованной пробе 0,45, выполните хлороформа и лечение ДНКазы I (см SEие 2.3.12-2.3.15) и добавить равный объем 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать образец для эпифлуоресцентной микроскопии (рис 2а).
    9. Для "универсальные" вирусных частиц обогащения подхода (см обсуждения), перейдите к шагу 2.3.12 опустить выбор вирусные частицы на основе цезия градиента хлорида ультрацентрифугированием. Тем не менее, это может привести к хлороформ-стойкие бактериальной контаминации и большего количества хост-ДНК в вирусных лизата.
  3. Вирусный частицы (ВПЧ) Обогащение и очистка
    1. Подготовьте отдельные хлорида цези (CsCl) решения растворением соответствующего количества CsCl с нефильтрованной буфера SM до желаемой плотности (1,7 г / мл, 1,5 мкг / мл, 1,35 мкг / мл и 1,2 мкг / мл). Фильтр каждый раствора через 0,02 мкм фильтр перед использованием.
    2. Настройка CsCl градиент, как показано на рисунке 2В.
    3. Добавить 1 мл 1,7 г / мл в каждую пробирку, нагрузка 1 мл 1,5 г / мл в каждую пробирку, нагрузка 1 мл 1,35 г/ мл в каждую пробирку, нагрузка 1,2 г / мл в каждую пробирку (опционально), и, наконец, загрузить 6-8 образца мл в соответствующей трубы. Все отдельные слои для обозначения места каждой фракции.
    4. Баланс каждого оппонента пару трубок с точностью до 1 мг.
    5. Тщательно загрузить каждую пробирку в спиновой ведро. Спин все ведра, даже если они пусты. Загрузите спина ведро на ротор.
    6. Центрифуга на 82844 мкг при 4 ° С в течение 2 ч.
    7. После центрифугирования, осторожно снимите трубки от держателя, не нарушая градиентов плотности.
    8. Использование 3 мл шприц с иглой 18 G, прокалывают трубу чуть ниже г / мл плотности слоя 1,5 (рисунок 2, красная стрелка) и тянуть ~ 1,5 мл в шприц.
    9. Собирают верхнюю часть, медленно удаления иглы и позволяя остальные фракции в трубке капать в новую пробирку 15 мл через прокол. Добавьте описание этого как "верхней фракции отходов».
    10. Соберите 1,5 г / мл fractioN (ВПЧ), содержащий от шприца путем выталкивания содержимого на две новые микроцентрифужные пробирки.
    11. Повторите шаг 2.3.8-2.3.10 для всех образцов.
    12. Добавить 0,2 объема хлороформа в вирусный концентрата, энергично встряхивают, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, отжим на максимальной скорости в течение 5 мин, и собирают водную фазу.
    13. Добавить буфера 10x ДНКазы и ДНКазы I (конечная концентрация = 2,5 ед / мкл) в хлороформе обработанных вирусной концентрата, и инкубируют при 37 ° С в течение 1,5-2 ч.
    14. Инактивации ДНКазы активность при 65 ° С в течение 15 мин.
    15. Удалить 15 мкл хлороформ и ДНКазы I-обработанной вирусной фракции в новую пробирку и добавить 15 мкл 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать образец для эпифлуоресцентной микроскопии.
  4. ДНК Добыча
    1. Бассейн вирусные концентраты из каждого образца в очищенном и автоклавного 50 мл Oak Ridge высокоскоростной центрифуге трубки.
    2. Добавьте следующий: 0,1 громкости 200x ТЕ-буфера, 10 мкл 0,5 М ЭДТА на мл сдостаточно, один объем формамида и 10 мкл гликогена. Тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
    3. Использование новых объемов, добавить 2 тома комнатной температуры 100% этанола. Тщательно перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение не менее 30 мин.
    4. Осадок ДНК, вращая трубы на 17226 мкг в течение 20 мин при 4 ° С с использованием СС-34 ротором.
    5. Жидкость над осадком сливают тщательно с помощью серологического пипетки. Промыть гранулу два раза охлажденным на льду 70% -ного этанола.
    6. Удалить столько жидкости, сколько возможно, и позволяют гранул в воздушно-сухой при комнатной температуре в течение 15 мин.
    7. Ресуспендируют осадок ДНК в 567 мкл 1x TE буфера (рН 8,0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позвольте по крайней мере 15 мин для полного взмучивания при комнатной температуре. не хранить ресуспендировали ДНК в течение ночи при 4 ° С до дальнейшей обработки.
    8. Передать весь 567 мкл раствора ДНК ресуспендированной в новый 1,5 мл пробирке. Добавить 30 мкл подогретого 10% SDS и 3 мкл протеиназы К (20 _6; г / мл), тщательно перемешать и выдержать в течение 1 ч при 56 ° С. Предварительно теплой СТАВ / NaCl при 65 ° С.
    9. Добавить 100 мкл 5 М NaCl и тщательно перемешать. Добавить 80 мкл предварительно нагревают раствора СТАВ / NaCl, вихря, и инкубируют в течение 10 мин при 65 ° С.
    10. Добавить равный объем хлороформа, вихря смешивания, и спина в 16100 мкг в течение 5 мин.
    11. Передача супернатант к новому 1,5 мл пробирке. Добавить равный объем фенола / хлороформа, вихря смешивания, и спина в 16100 мкг в течение 5 мин.
    12. Передача супернатант к новому 1,5 мл пробирке. Добавить равный объем хлороформа, вихря смешивания, и спина в 16100 мкг в течение 5 мин.
    13. Передача супернатант к новому 1,5 мл пробирке. Добавить равный объем изопропанола, фракции супернатанта, смешать и инкубировать при 20 ° С в течение не менее 30 мин.
    14. Осаждения ДНК, спина в 16100 мкг в течение 15 мин при 4 ° С. Внесите надосадочную тщательно и мыть гранул в два раза с ледяной 70% этанола. Выполнение короткий спина и удаления оставшегося этанола из трубки. Воздух сухой осадок в течение 15 мин.
    15. Ресуспендируют осадок ДНК с 50 мкл элюирующего буфера (5 мМ Трис, рН 8,5). Разрешить осадок увлажняет, по крайней мере, 5 минут в комнатной температуре.
    16. Количественная ДНК с использованием анализа с высокой чувствительностью флуоресценции основе.
  5. Амплификации с использованием Phi29-полимеразы (Необязательно)
    1. Подготовка 2x отжига буфер: 80 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 20 мМ MgCl 2.
    2. Развести полимеразы ДНК Phi29 до 5 ед / мкл.
    3. Премикс буфера выборки, состоящий из 50 мкл случайного гексамера праймера (100 мкМ), 125 мкл 2х буфера для отжига и 25 мкл воды. Аликвоты и хранить при -20 ° С.
    4. Pre-реакционной смеси буфер, состоящий из 100 мкл Phi29 10x буфера, 40 мкл 10 мМ дНТФ, 560 мкл воды. Аликвоты и хранить при -20 ° С.
    5. Добавить 1 мкл матричной ДНК в 4 мкл буфера для образца.
    6. Выдержите-йе смеси при 95 ° С в течение 3 мин и охладили на льду.
    7. Добавить 14 мкл реакционного буфера в смеси из 2.4.4, перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
    8. Добавить 1 мкл полимеразы Phi29 ДНК, перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, и инкубируют при 30 ° С в течение 18 ч с последующим 65 ° С в течение 10 мин.
    9. Очистка реакции с использованием геномной колонки ДНК или фенол / хлороформ и этанол осадков.
  6. Эпифлуоресцентной микроскопия (См Haas и др. 2014 28 для настройки системы фильтрации)
    Примечание: После выделения и очистки, эпифлуоресцентной микроскопии с красителями нуклеиновых кислот может быть использована для проверки наличия и чистоты вирусных частиц в образцах (2а и 2в). Свободной ДНК в образце может привести к высокой фоновой флуоресценции. Таким образом, выборка должна быть ДНКазы I-обработке до фиксации и окрашивания для микрофотографии.
    1. Получают раствор монтирования (0,1% аскорбиновой кислоты, 50% глицерина). Добавить 100 мкл 10% аскорбиновой кислоты с 4,9 мл 1x фосфатным буферным раствором (PBS), тщательно перемешать. Добавить 5 мл 100% глицерина в смеси, тщательно перемешать и маркировать трубки в качестве "монтировать".
    2. Держатель фильтра с помощью 0,02 алюминия матрица мкм одноразовые шприцы фильтра, Алиготе в микроцентрифужные труб и хранить при температуре -20 ° C.
    3. Алиготе 100 мкл образца в новую пробирке и добавить равный объем 4% параформальдегида фиксировать VLPs. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение не менее 10 мин.
    4. Макияж объем до 1 мл добавлением 800 мкл 0,02 мкм фильтрованной воды. Добавить 1 мкл SYBR Gold пятно в трубку и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
    5. Настройка системы фильтрации путем включения вакуумного насоса между -9 и -10 фунтов на квадратный дюйм (-62,1 и -68,9 кПа).
    6. Вымойте пьедестал с водой и поместите матрицу оксида алюминия фильтр 0,02 мкм с кольцевой полипропилена опорного кольца в фильтр пьедестал,
    7. Поставьте башню фильтр в верхней части фильтра пьедестале с фильтром и закрепите зажимом.
    8. Внесите содержимое из 1,5 мл пробирке в башню фильтра и позволяет несколько минут образец проникать.
    9. Этикетка и пипеток 10 мкл горе реагента в предметное стекло.
    10. Оставьте вакуум на время снятия башни фильтра и зажим.
    11. Осторожно снимите фильтр из фильтровальной пьедестала и промокните нижнюю часть фильтра с Kimwipe, а затем поместите фильтр непосредственно на вершине горы на предметное стекло.
    12. Внесите еще 10 мкл на гору реагента на фильтр и поместите покровное на фильтре.

3. Создание Микробная метагенома

  1. Получение Буферы и растворы:
    1. Подготовка 50 мл ДНКазы 1x буфер: 50 мМ NaAc, 10 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2; доведения рН до 6,5. Фильтр стерилизуют (0,22 мкм) и хранитьпри комнатной температуре.
    2. Подготовка фермента ДНКазы I с 1000 ед / мкл (в воде молекулярного класса) из лиофилизированного бычьей поджелудочной железы ДНКазы I в соответствии с активностью, определенной блоком Dornase / мг сухого веса.
    3. Подготовка 100 мл SE буфера: 75 мм NaCl, 25 мМ ЭДТА; доведения рН до 7,5. Фильтр стерилизуют (0,22 мкм) и хранят при комнатной температуре.
  2. Пробоподготовки Перед ДНК Добыча
    1. Развести гомогената путем добавления 5 объемов 0,22 мкм фильтрованной 1x PBS. Например, добавьте 10 мл 1x PBS в 2 мл образца.
    2. Добавить β-меркаптоэтанола до 2% (объем / объем) конечной концентрации. Rock смеси (в химической капотом) при комнатной температуре в течение 2 часов.
    3. Спин образца при 10 ° С и 3056 мкг в течение 15 мин, и отбросить супернатант.
    4. Ресуспендируют осадок в 10 мл воды молекулярной класса (или 0,22 мкм фильтрованной воды), и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
    5. Повторите шаги 3.2.3 и 3.2.4 один раз.
    6. Спип при 10 ° С и 3056 мкг в течение 15 мин, и отбросить супернатант.
    7. Ресуспендируют осадок в 5 мл 1x ДНКазы буфера и добавить 15 мкл ДНКазы I (1000 U / мкл) на мл образца.
    8. Инкубируют при 37 ° С при повторном перемешивания в течение 2 часов.
    9. Инактивации ДНКазы активность при 65 ° С в течение 15 мин.
    10. Спин при 10 ° С и 3056 мкг в течение 15 мин, и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 10 мл SE буфера.
    11. Повторите шаг 3.2.10.
    12. Спин при 10 ° С и 3056 мкг в течение 15 мин, и отбросить супернатант.
    13. Ресуспендируют осадок в 2 мл буфера SE, и передать два микроцентрифужные пробирки.
    14. Гранул клеток в микроцентрифужных пробирках. Спин трубы на 16100 мкг при комнатной температуре в течение 15 мин.
    15. Удалить супернатант и извлечь ДНК из осажденной клеток с использованием геномной ДНК экстракции комплект, грамположительные протокола вариации.

4. Создание Metatranscriptome

  1. Пробоподготовки-лечение
    1. Выполните механическую лизис клеток в шаровой избиения в GITC-буфера для лизиса сразу после сбора образца и гомогенизации. См шаг 1,4.
    2. Спин смеси при 4 ° С и 600 мкг в течение 5 мин для осаждения диоксида кремния шарики.
    3. Передача супернатант в новую пробирку.
    4. Добавить 200 мкл хлороформа в течение каждых 750 мкл GITC-буфера для лизиса, используемых, энергично встряхивают вручную в течение 15 сек, инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин, и спина при 4 ° С и 3056 х г в течение 15 мин. В течение этого 15 мин спина, подготовиться к шагу 4.2.
    5. После мин спина 15 (четкое разделение водных форм фаза-межфазную органической фазы), экстрагируют водную фазу (без нарушения межфазной) в новой РНКазы трубки (ов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: водная фаза содержит РНК. Хранить трубы на льду до следующего шага.
  2. Выполните полную экстракцию РНК и очистки с использованием коммерчески доступных столбцов на основе комплектов очистки РНК или удобстntional изопропанол основе РНК осадков.
    1. Silica колонки на основе РНК Очистка
      1. Измерить общий объем водной фракции, полученной.
      2. Добавить соответствующий объем РНК-связывающего буфера образца и хорошо перемешать.
      3. Отрегулируйте смеси с соответствующим обязательным условием в соответствии с протоколом производителя. Все хорошо перемешать и сделать короткий отжим.
      4. Загрузите смесь в РНК-колонки. Для большой выборке объема, использовать несколько загрузку и загрузить каждый столбец до 4x. В противном случае, рекомендуется использовать несколько столбцов для каждого образца.
      5. Промыть колонку соответствующим в соответствии с протоколом производителя.
      6. Элюции РНК, по крайней мере, 30 мкл РНКазы свободной воды. Дважды элюирование будет немного увеличить выход РНК. Тем не менее, это будет разбавлять концентрацию РНК.
      7. Измерьте концентрацию РНК и переходите непосредственно к лечению ДНКазы I. Используйте Bioanalyzer, чтобы проверить качество РНК (рекомендуется).
      8. РНК Осадки
        1. Добавить равный объем изопропанола (например, 500 мкл изопропанола в 500 мкл водной фракции) и 2 мкл 10 мкг / мкл РНКазы гликогена в образце.
        2. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 10 мин.
        3. Спин при 12000 х г и 4 ° С в течение 15 мин.
        4. Осторожно удалите супернатант, добавить 1 мл РНКазы 75% этанола. Спин смеси при 7500 мкг и 4 ° С в течение 5 мин, чтобы убедиться, осадок нетронутыми.
        5. Осторожно снимите этанола.
        6. Повторите шаги 4.2.2.4 и 4.2.2.5 раз.
        7. Воздух сухой осадок в течение 10 мин.
        8. Увлажняет осадок в 50 мкл РНКазы свободной воды, инкубировать при 55 ° С в течение 5 мин и сразу перейти к обработке ДНКазой. Используйте Bioanalyzer, чтобы проверить качество РНК (рекомендуется).
        9. Магазин РНК в аликвотах при -20 ° С, или -80 ° С в течение длительного хранения.

Representative Results

Вирусные метагеномов

CF мокроты исключительно вязкая и содержит большое количество муцина и свободной ДНК (Фигура 2А); градиент плотности ультрацентрифугирования облегчает ликвидацию принимающей полученных ДНК (Фигура 2В). Результаты предыдущих исследований 9 показывает восемь viromes генерируемые из представленного процесса суммированы здесь (таблица 1). Семь образцов (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, и CF5-B; Таблица 1) были обработаны, как описано в разделе 2. Сформированные viromes содержит мало (0,02 % -3,7%) последовательности человека, полученных только с одним исключением (70%). CF4-была исключена из градиент плотности ультрацентрифугирования стадии (CF4-А) и virome, генерируемых из данного конкретного образца содержали> 97% человеческих полученных последовательностей (таблица 1). Рисунок 2 показывает пример эпифлуоресцентной-микроскопическое изображение типичный CF sputuм образца до (2А) и после (фиг.2с) ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Очистить вирусные частицы (VLP) наблюдали в микрофотографии без крупных частиц после разделения в градиенте плотности. После экстракции ДНК VLPs, бактериальное загрязнение часто проверена с помощью 16S рДНК усиление до секвенирования VLPs ДНК.

Микробные метагеномов

Семь образцов мокроты, представленные здесь, были получены от одного пациента CF через семь дней подряд. Пациент начато лечение антибиотиками (ципрофлоксацин и доксициклин) на 3-й день после мокроты было собрано. Объем каждого образца мокроты, собранные от этого пациента был 15 мл в течение 7 дней; Поэтому, PBS, не было добавлено к образцу. Целью данного мероприятия Отбор проб для оценки протоколы, представленные в этой рабочем процессе (I), оценивающих ежедневный изменения структуры микробных сообществ, и (II) сравнитьСтруктура микробного сообщества и разрешение между Метагеномика и 16S рДНК секвенирования. Таким образом, общая ДНК и HL-ДНК экстрагировали из каждого образца.

Концентрация HL-ДНК каждого образца мокроты следующей экстракции ДНК представлена ​​в таблице 2. Общий выход HL-ДНК составляла от 210 нг до> 5 мкг. Illumina библиотеки секвенирования были получены с общей исходного материала 1 нг для каждого образца (рисунок 3). Характеристики данных Метагеномика представлены в таблице 2. Все, кроме одного библиотека дали более 1 млн последовательности и более 85% последовательности высокое качество были сохранены на предварительной обработки данных с помощью программного обеспечения PRINSEQ 29. Все наборы данных были впервые предварительной обработке для удаления дубликатов и последовательности низкое качество (минимальное качество оценка 25), а затем дальнейшего скрининга и удаления последовательностей человека, полученных с использованием DeconSeq 30. Количество человеко-дезагрязнения привели к расколу последовательности в значительной степени зависит от свойств образца. Здесь общее количество последовательностей человека, полученных в диапазоне от 14-46% (таблица 2). Предобработанных последовательности затем аннотированный с помощью Metaphlan 31 трубопровода, а также MG-Раст 32 сервер.

В дополнение к метагеномов, 16S рДНК ампликонов библиотеки были получены как от общей ДНК и HL-ДНК с помощью праймеров, направленных примерно 300 п.н. вариабельной области V1-V2 в гена 16S рРНК 33,34. ПЦР-продукты из индивидуальных образцов были нормализованы и объединены для секвенирования с использованием Illumina 500-цикла с двух концов последовательности выполняемых на MiSeq платформы. Парноконцевое 16S рДНК ампликонов последовательности были отсортированы по образцу по штрих-кодов с помощью сценария питона и парные чтения были собраны с использованием phrap 35,36. Концы Сборные последовательность не были отделаны до Средняя оценка качества была ≥20 с использованием окна 5 NT. Потенциальные химеры былин удалить с помощью Uchime 37 против химеры без подмножества исходных последовательностей Сильва 38. Taxanomy был назначен высокое качество читает с SINA 39 (версия 1.2.11), используя 418 497 бактериальных последовательностей из базы данных Сильва 38. Последовательности с одинаковыми таксономических заданий были сгруппированы для получения оперативных таксономических единиц (ОТЕ). Этот процесс генерируется 1655278 последовательности для 16 образцов (средний размер: 103 455 последовательностей / образец; минимальный: 72603, Макс: 127113). Оценка охвата медиана товары, мера полноты последовательности, был ≥ 99,9%. Пакет программного обеспечения Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) был использован для анализа и генерации фигуры. Альфа-разнообразие (внутри образца) и бета-разнообразие (в том выборки) были вычислены в Explicet на разрежения точки 72603 последовательностей с 100 бутстраповских повторных выборок.

Первый вопрос мишенью данного исследования было ли гипотонического лизиса preferentiсоюзник выбирает для (то есть, преимущественно сохраняет или лизирует) отдельные группы микробов. После первого гипотонического лизиса, ресуспендировали осажденные клетки половинной дискретизации из первых двух образцов (CF1-1A * и *) CF1-2A сравнить с аналогичными образцами после второй гипотонического лизиса (CF1-1and CF1-2). Все образцы обрабатывали в равной степени, то есть, обрабатывали ДНКазой I до экстракции ДНК с последующей экстракцией ДНК и секвенирования трубопровода. Как показано на фиг.4, микробные профили подвыборок очень похож на образцах после двух обработок гипотоническим лизисом. Кроме того, второй гипотонического лизиса увеличивает долю не-человеческих последовательностей с 6-17% в течение метагеномов (таблица 2).

Для проверки различий в микробного состава между metagenomic- и 16S рДНК на основе профилирования и изменения до и после гипотонического лизиса которые могли бы объяснить различия, ранее считавшиеся между нашей шпильких годов и другие бактериальные библиотеки секвенирования рДНК 16S были получены как от общей ДНК и HL-производного ДНК (фиг.4В). На уровне рода, с таксономией, профили общих CF-ассоциированный бактерий, таких как Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella и Streptococcus были очень похожи между библиотеками 16S рДНК и метагеномов генерируемых из HL, полученных ДНК. Однако, обнаружение Rothia в библиотеках 16S рДНК было не так обильно, как с метагеномных библиотек. При сравнении Таксономические профили рДНК 16S, полученные от общей ДНК и HL-производного ДНК, Pseudomonas дифференцированно представлены в общей ДНК по сравнению с HL-получены исходной ДНК из 3-й день.

Metatranscriptomes

Как правило, суммарную РНК экстрагировали из CF мокроты частично деградированных и размер в диапазоне от 25-4,000 бит (фиг.5А и и др. 2012 9. Фракция рРНК в не-обедненного metatranscriptomes в диапазоне от 27-83%, а относительное содержание рРНК варьировалась в зависимости от образцов (таблица 3; данные, извлеченные из Lim и др 9.). Тем не менее, истощение с рибо- нулевой комплекта уменьшало рРНК относительное содержание рРНК до 1-5%, за исключением образца CF1-F. Изменение эффективности удаления рРНК может отражать качество добываемого РНК, или различия в настоящее время микробных сообществ и, следовательно, доступность рРНК для зондов гибридизации 9. В электрофореграммы из процедуры удаления успешно (фиг.5В) и неудачной (фиг 5D) рРНК с использованием набора для удаления рибо- нулевой рРНК различаются, при котором рРНК пиков видны в неудачной удаления.

Диапазон размера кДНК библиотеки GEnerated часто отражает диапазон размеров исходного образца РНК. Библиотеки кДНК, представленные здесь, были получены с целым транскриптомный усиления комплекте (БТА2) при рРНК истощения с последующим Roche-454 готовки библиотек секвенирования 9. КДНК генерируется содержат фрагменты, начиная от 50-4,000 бит (рис 5E и 5F) и очень последовательно через образцов (Lim и др. 2012) 9. Наличие других конкретных платформ Секвенирование РНК подготовки библиотека комплектов в настоящее время обеспечивают больше альтернативных вариантов для одного, чтобы объединить синтез кДНК и подготовки библиотеки последовательности в оптимальных условиях. Один из рекомендуемых вариантов на сегодняшний день является ScriptSeq Полный Gold Комплект объединения реагентов рРНК удаления рекомендованные выше, и РНК-Seq подготовки библиотека комплект.

Рисунок 1
Рисунок 1: Последовательность действий для подготовительнойтовка принимающих ассоциированных образцов, таких как образца мокроты, для virome, микробиомом и metatranscriptome секвенирования.

Фиг.2
Рисунок 2: цезий хлорида градиенты плотности ультрацентрифугирования содействия ликвидации внеклеточной ДНК и крупных частиц (А), и позволяют оптимального выделения вирусной как частицы из CF мокроты. Один миллилитр каждого градиента слой поверх друг друга до загрузки предварительно обработанного образца (B). Изоляция следующие частицы и очистка, эпифлуоресцентной микроскопии с красителями нуклеиновых кислот, такие как SYBR Золото используется для проверки наличия и чистоты вирусных частиц в образцах. Очистить вирусные частицы (C; белые стрелки) были обнаружены после градиенте плотности разделения CF мокроты образца.


Рисунок 3:. Пример распределения по размерам NextEra XT библиотек, полученных от 1 нг HL-ДНК, в результате мокроты при МВ microbiomes Библиотека нормализация, объединение и загрузка количество было сделано, как описано в протоколе производителя без каких-либо отклонений.

Рисунок 4
Рисунок 4: таксономический анализ микробных сообществ в девяти образцов, собранных в продольном направлении от одного МВ пациента (A) микробиологические профили, основанные на метагеномных библиотек, полученных от гипотонического лизиса метода на основе ДНК.. Назначение вид был основан на Metaphlan трубопроводов следующих данных предварительной обработки, что удаления дубликатов и последовательности с низким качеством и гомологии последовательности человека. Для того, чтобы показать, что две улEPS гипотоническая лизис сделал преимущественно не выбирает для отдельных групп микробов, подвыборках (*) после первого гипотоническая лизис были включены. (B) Микробные профили на основе v1v2 области 16S рРНК генов последовательности от общего ДНК (Т) и гипотонической методом лизиса -based ДНК (HL). Эти данные не публиковались ранее.

Рисунок 5
Рисунок 5: Примеры Agilent 2100 Bioanalyzer электрофореграммы РНК (AD) и ДНК (EF) генерируются для metatranscriptomic библиотек, используя РНК пико и высокой чувствительности дцДНК фишки соответственно. (А) и (С) показаны примеры электрофореграммы до процедуры удаления рРНК. В электрофореграммы успешной (б) и неудачной процедуры удаления (D) рРНК, используя общую рРНК удаления набора немного отличаться,т, что рРНК пиков видны в неудачной удаления. Диапазон размера кДНК (EF) генерируется с помощью усиления комплект целого транскриптом (Sigma-Aldrich) аналогично диапазоне размеров исходного рРНК обедненного РНК, и очень последовательно через два разных образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть Более крупная версия этой фигуры.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4- CF4-B CF4-C CF5- CF5-B
Общее количество просмотров 224859 87891 106189 93301 140020 1558 272552 217438
Препроцессированные читает 109389 73624 67070 82011 68617 1137 215808 158432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
Количество баз 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
Средняя чтения длину 432 453 431 337 428 215 441 439
Последовательности Хост B 240 526 28 79774 13 797 585 5859
0,21% 0,71% 0,04% 97.27% 0,02% 70.10% 0,27% 3.70%
Вирусные хиты с 7214 23550 4070 737 4642 22 6466 5981
6,59% 31.99% 6.07% 0,90% 6,77% 1,93% 3,00% 3,78%
Не назначено Читает D 103888 60490 32780 1935 68440 311 105612 119551
94.97% 82.16% 48.87% 2,36% 99.74% 27.35% 48.94% 75.46%
Читает после выхода данных предварительного процеssing по PRINSEQ 29.
б Human читает определены DeconSeq 30 плюс читает с лучшим BLASTN хит (базы данных NCBI нуклеотидов) к типу Chordata.
С tBLASTx ударяется в доме вирусной базы данных генома. Процент была рассчитана с использованием общего количества предварительной обработке считывает.
d Читает, не BLASTN удар по базе данных NCBI нуклеотидов. Процент была рассчитана с использованием общего количества предварительной обработке считывает. Некоторые читает с не BLASTN ударил в базе данных NCBI нуклеотидной не были идентифицированы как вирусная на уровне белка в анализе tBLASTx.

Таблица 1:. Библиотека характеристики восьми viromes, полученных от образцов мокроты с помощью подарил рабочий Эта таблица извлекается из Lim <EM> и др. (2012) 9. Семь образцов (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, и CF5-B) были обработаны, как описано в разделе 2 и генерируется viromes, что содержит мало (0,02% - 3,7 %) человек, полученных последовательностей с одним исключением (70%). CF4-был опущен на стадии градиента плотности ультрацентрифугирования (CF4-A) и генерируемого virome, который содержал> 97% человеческого происхождения последовательности.

Образец Концентрация Общий выход Общее количество Читает Общее количество операций чтения (Обработано б) Номера последовательностей человека
(Нг / мкл) (Нг) (Raw) (%)
CF1-1A * 2,3 1098454 937688 691541
74%
CF1-1 13 1300 2212756 1958910 1574520
80%
CF1-2A * 2,1 210 672878 588106 407530
69%
CF1-2 5,2 520 1944012 1697010 1455174
86%
CF1-3 28,8 2880 1048304 896756 560852
63%
CF1-4 24,1 2410 1154922 984702 621098
63%
CF1-5 33,6 3360 1029622 888630 481548
54%
CF1-6 43,2 4320 1434016 1256504 725858
58%
CF1-7 57,8 5780 1000174 872036 565376
65%
* 1 мл образца половинной дискретизации от CF1 -1 И CF1-2 после первого гипотонического лизиса этапе (этап 3.1.5) до второго гипотонического лизиса процедуры. Клетки центрифугировали, как описано в 3.1.7, и пройти через оставшегося протокола без каких-либо изменений.
Необработанные Illumina читает из 2 х 300 б.п. MiSeq секвенирования перспективе.
б Читает были оценены, обрезать, и удаляется в зависимости от качества и длины, как описано в обсуждении.

Таблица 2:. Характеристики microbiomes генерируемых из образцов мокроты с использованием рабочего процесса, представленную Концентрацию ДНК из каждого образца в 100 мкл буфера для элюции (5 мМ Трис / HCl, рН 8,5) и характеристик данных последовательности представлены. Всего 1 нг была использована для формирования индивидуальной библиотеки с помощью библиотеки подготовка комплекта NextEra XT.

0 "FO: Keep-together.within-страницу =" всегда "> Образец CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Лечение Ни один Рибо-Zero Ни один Рибо-Zero Ни один Рибо-Zero Ни один Рибо-Zero Препроцессированные читает 2088 1991 40876 25238 19728 32737 31791 36172 Средняя чтения длину 275 245 262 270 233 259 240 267 Всего рРНК читает 1737 91 29499 17267 5285 291 16371 1761 83.20% 4.60% 72.20% 68.40% 26.80% 0,90% 51.50% 4.90% Микробная рРНК 1414 32 19978 12035 23 227 6916 1076 67.70% 1.60% 48.90% 47.70% 0,10% 0,70% 21.80% 3,00% Eukaryota рРНК 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15.50% 3,00% 23.30% 20.70% 26.70% 0,20% 29.70% 1.90% % РРНК удалены * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% Номера рРНК читает 351 (16,8%) 1900 (95,4%) 11377 (27,8%) 7971 (31,6%) 14443 (73,2%) 32446 (99,1%) 15420 (48,5%) 34411 (95,1%) Всего хитов NR 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3327 (8,1%) 2857 (11,3%) 4938 (25,0%) 10751 (32,8%) 5905 (18,6%) 15766 (43,6%) Eukaryotic 74 407 2790 2524 4614 10227 4553 8274 Бактериальный 26 283 520 312 287 471 1326 7442 Не назначено читает 249 (11,9%) 1209 (60,7%) 8050 (19,7%) 5114 (20,3%) 9505 (48,2%) 21695 (66,3%) 9515 (29,9%) 18645 (51,5%) * Количество рРНК удаляют, выраженное в процентах от количества присутствующего в не-обедненного аликвоты.

Таблица 3:. Библиотека характеристики metatranscriptomes с и без разрушения рРНК данных извлекается из Лим и его коллеги (2012) 9, который имеет дополнительное сравнение других наборов удаления рРНК и эффект кДНК распыления до подготовки библиотеки последовательности..

Discussion

Вирусные Метагеномика

Вирусные частицы концентрируют с использованием полиэтиленгликоль (ПЭГ) или осаждение мелких концентраторов громкости. В некоторых случаях, концентрация не могут быть необходимы, но предварительной фильтрации или низкие скорости шага центрифугирования используются для удаления эукариотических и микробные клетки. Вирусные лизаты будет обогащен и очищали с использованием градиенте плотности ультрацентрифугирование 9,41 или небольшие фильтры размера (например, 0,45 мкм), чтобы удалить эукариотических и большие микробных клеток 25. Ультрацентрифугирования в градиенте плотности, как правило, выполнены с плотными, но инертных растворов, таких как сахароза или цезия хлорид, чтобы изолировать и концентрации вирусных частиц 41. Физическое разделение в зависимости от размера и плавучей плотности вирусных частиц. Таким образом, правильный выбор размера пор фильтра и строгий подготовка градиентов необходимо выделить отдельные вирусные общины, так как успех физического выздоровленияВПЧ определяет сообщество изолированные 41 (то есть, вирусные частицы, которые не проходят через фильтр или попадают в плотности добычи не будет обнаружен в метагенома). После выделения вируса и концентрации, может быть, не загрязняющих вирусной геномной материала, присутствующего в образце, как в виде свободных нуклеиновых кислот и микробных и эукариотических клетках. Таким образом, крайне важно, чтобы проверить на чистоту вирусных частиц в образцах (фиг.1А и 1В). Лечение хлороформ обычно используется для лизиса оставшихся клеток с последующей обработкой нуклеазой деградировать свободных нуклеиновых кислот до экстракции нуклеиновой кислоты.

Предостережение представленной процесса было использование разделения в градиенте плотности, чтобы изолировать вирусные частицы, поскольку это может исключить оболочечных вирусных частиц, которые могут быть слишком плавучесть, чтобы войти в градиент CsCl. Альтернативный метод "поймать всех" является опустить градиент плотности SEPARвания и изолировать общины ДНК из 0,45 мкм - фильтратов обрабатывали хлороформом и ДНКазы I. Такой подход также подходит для размещения небольших объемов образцов, таких как те, от тампонов или плазмы крови. Тем не менее, это может привести к хлороформ-стойкие бактериальной контаминации и большего количества ДНКазы I-стойкого внеклеточной ДНК.

Современные протоколы требуют секвенирования 1 нг до 1 мкг нуклеиновых кислот для получения библиотеки последовательности в результате чего более высокие выходы ДНК обеспечивают более широкий выбор вариантов секвенирования. Концентрацию ДНК генерируемых viromes часто в диапазоне от ниже предела обнаружения более 200 нг / мкл. Количество вирусных нуклеиновых кислот, извлеченных может быть недостаточно для непосредственной подготовки библиотеки последовательности. В таких случаях, амплификации нуклеиновых кислот имеет важное значение. Линкерные усиления дробовик библиотеки (LASLs) 2,42,43 и весь геном усиления на основе усиления несколько смещение (MDA) являются двумяМетоды, наиболее часто используется для генерации достаточного для секвенирования ДНК. Способы MDA таких как те, которые основаны на Phi29 ДНК-полимеразы, как известно, страдают от амплификации смещений, а также преимущественно усиливает оцДНК и кольцевую ДНК, в результате чего без количественного таксономического и функциональные характеристики 44,45. Оптимизированная версия подхода LASLs было показано ввести только минимальные уклоны, способствует более высокой чувствительности (для небольших количеств исходного материала), и легко адаптируется для различных секвенирования платформы 43. Тем не менее, подход имеет много шагов, требуется специальное оборудование, чтобы свести к минимуму потери ДНК, и ограничивается шаблонов дцДНК. В нашей лаборатории, этот подход был успешно адаптирован для усиления обнаруживаемого и обнаружить количество ДНК, извлеченной из бронхоальвеолярного lavage-, coral- и морской воды происходит ВПЧ (неопубликованные и Гурвица и др. 46).

Разработка анализа данных трубопроводов CLAssically был одним из самых сложных аспектов вирусной анализа Метагеномика из-за высокой разнообразны и во многом неизвестной природы вирусных сообществ. В то время как по оценкам, насчитывается 10 8 вирусные генотипы в биосфере, на сегодняшний день в настоящее время вирусных базах данных содержат ~ 4000 вирусных геномов, что составляет около 1/100000-этого Примерная сумма вирусной разнообразия. Таким образом, сходство на основе поиски (такие как BLAST 47) для таксономических и функционального назначения при вирусных метагеномов обладают сопутствующих трудностей. Многие последовательности не имеют значительное сходство в геномах в базе данных, и, следовательно, классифицируются как неизвестные. Несмотря на то, запросы гомологии основе являются наиболее важными приложениями для назначения таксономии и функции для последовательности данных, альтернативные подходы, основанные на базе данных, независимый анализ были разработаны 48- 50. Fancello и др. 51 обеспечивают полный обзор вычислительных средств и алгоритмов, используемых в вирал Метагеномика.

Микробная Метагеномика

Как правило, общее количество ДНК экстрагировали из гипотонических лизиса обработанных микробных сообществ (HL-ДНК) в диапазоне от 20 нг до 5 мкг. Выход сильно зависит от состояния здоровья пациента и количества образца мокроты, собранной, который объясняет изменения, видимые в общий выход HL-ДНК, извлеченной в этом исследовании (таблица 2). Критические шаги для создания данных о последовательности хорошее качество полагаться на качество секвенирования библиотек генерируется. Рисунок 2 показывает типичный диапазон размера для библиотек секвенирования, полученных от CF мокроты, полученной микробной ДНК с использованием процедуры фрагментации ДНК ферментативной основе. Оптимальный размер библиотеки зависит от выбора секвенирования платформы и приложения, и, следовательно, процедура фрагментации может быть оптимизирована, если это необходимо, с помощью альтернативных подходов, таких как обработка ультразвуком и распылении. В дополнение кпредставленные показательные результаты, успех предложенного метода на CF мокроты собирали от многих больных на нескольких временных точках также показано на Лим и др. (2012) 9 и Лим и др. (2014) 10.

Предыдущие исследования 9,10 предположить, что каждый пациент таит в себе уникальный набор микробного сообщества, который переходит с течением времени, отражая тем самым сохранение основных игроков в общине, а колебания, скорее всего, из-за возмущений, таких как лечения антибиотиками. Если возникают эти колебания ежедневно, даже без внешних возмущений или из-за процедуры отбора образцов и обработки образцов, по-прежнему под вопросом. На основании метагеномных HL-ДНК и 16S-рДНК анализа ампликона, 7 дней в продольном выборки показывает, что суточное колебание микробных профилей без возмущения антибиотиками (день 1, 2 и 3) была минимальна (Фигуры 3А и 3В). По интроводство пероральных антибиотиков сразу же после отбора проб день 3, изменения в профиле сообщества стало очевидным в День 4. Хотя ципрофлоксацин антибиотик охватывает широкий спектр известных бактериальных патогенов, таких как П. палочки, золотистого стафилококка, а Streptococcus пневмонии, обработка увеличивает относительное содержание P. палочки с одновременным уменьшением стрептококки. и П. melaninogenica. По 6-й день, сообщество медленно восстановился до исходной структуры отправной сообщества. Полученные результаты свидетельствуют о том, что колебания микробных профилей в рамках одного пациента, скорее всего, из-за общественных возмущений в дыхательных путях.

Учитывая согласованность между микробных профилей 16S рДНК библиотек и метагеномов из HL-производных ДНК, мы исключили предубеждения, происходящие из праймеров 16S рРНК, используемых в данном исследовании. Одно из возможных объяснений различий, присущих всей 16S рДНК таксономическихAl профили, полученные от тотальной ДНК и HL-производных ДНК (рис 3B) может быть присутствие больших количеств Pseudomonas SPP. внеклеточная ДНК после лечения антибиотиками. Это подтверждается данными, что эти различия были наиболее очевидны в День 7, через три дня после лечения антибиотиками, которая ориентирована Pseudomonas SPP. в дополнение к другим. Ципрофлоксацин широко используется в качестве терапии первой линии у пациентов с МВ и хронической P. палочки инфекции, хотя спектр его деятельности включает в себя большинство CF-ассоциированный патогенов. Мы предположили, что лечение антибиотиками уничтожает восприимчивых общин, включая стрептококки. и, следовательно, создания нишу, заполненную устойчивостью P. палочки. синегнойная палочка может получить сопротивление за счет увеличения его биопленки сообщества и внеклеточной ДНК было показано, что основной структурный элемент его биопленки архитектуры 52. Даже сейчас, когда тон структура сообщества выздоровел, внеклеточная ДНК, возможно, остались в мокроты при МВ. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что гипотонический лизис и этапы стиральные, представленные в этом документооборота получить выгоду не только в удалении ДНК человека, полученных, но и микробного происхождения внеклеточная ДНК, которые могут исказить реальные микробных профилей.

Metatranscriptomics

Высокое качество metatranscriptome должно содержать сравнительно мало рибосомальной РНК (рРНК) последовательности и представляют собой объективную выборку из общих транскриптов (мРНК). Из-за короткого периода полураспада и ограниченное количество мРНК, очень важно, чтобы протокол, представленный здесь, минимизирует обращение с пробами, чтобы максимизировать количество транскриптов восстановлены.

В последние годы несколько подходов к истощению рРНК были разработаны и адаптированы в коммерчески доступных наборов. Они включают в себя MiCRob обогащать, Рибо-Zero, и примеры конкретных вычитания часybridizations 53, которые основаны на олигонуклеотидным гибридизации и мРНК-ТОЛЬКО комплект, который основан на экзонуклеазную ферментативной активности таргетирования РНК, содержащей 'монофосфат 5. Кроме того, несколько подходов к мРНК обогащения, такие как MessageAmp II-Бактерии комплект, который преимущественно polyadenylates и усиливает линейное РНК также доступны. Некоторые из этих методов (например, мРНК-ТОЛЬКО, MiCRob E Xpress и MessageAmp) используются одновременно для оптимальной эффективности. Тем не менее, эффективность всех этих подходов ограничены, особенно при работе с частичной деградации рРНК, как это часто наблюдается в общей РНК, экстрагированной из образцов CF. Полиаденилирование-зависимой амплификации РНК не может быть использован для создания metatranscriptomes, состоящих из эукариотической и прокариотической мРНК. Кроме того, поли (А) кабель добавили к последовательности могут уменьшает количество данных полезных последовательностей. Регионы с гомополимерных участков будет, как правило, имеют более низкие показатели качества, сausing значительное количество просмотров быть отфильтрованы с помощью секвенирования и после секвенирования программного обеспечения, и средней длине полезной для чтения после обрезки поли (А) хвост будет значительно уменьшена 54.

Работа со сложными CF микробных сообществ и частично деградированных РНК (4а и 4в), нашего предыдущего исследования показали, что метод гибридизации захват Золотой комплект Рибо-Зиро был более эффективным в удалении как человека и микробов рРНК по сравнению с комбината процедур с использованием Другие наборы 9 (таблица 3). Полученный данных позволяет одновременный анализ как человека-хозяина и микроорганизмов транскриптов. В зависимости от урожайности и качества РНК, а также окончательный выбор секвенирования платформы, многие из этих процессов, включающий стадию синтеза кДНК может быть упрощен с образованием библиотеки последовательности. Например, рибо- нулевой обработке РНК может быть использован для секвенирования metatranscriptome ВесыРайс помощью ScriptSeq Секвенирование РНК Подготовка Библиотека комплект.

Метагеномных анализ животного связаны сообществ предоставляет полный представление общей функциональной сущности, что включает в себя множество и связанные с сообществам. Рабочий процесс, представленный здесь можно приспособить к различным сложных образцов животного связаны, особенно те, которые содержат густой слизи, большое количество клеточного дебриса, внеклеточной ДНК, белков и гликопротеинов комплексов, а также клетки-хозяева, в дополнение к желаемому вирусной и микробной частицы. Несмотря на то, вирусные и микробные частицы могут быть потеряны при каждом шаге, частицы Выделение и очистка необходимы, чтобы свести к минимуму количество ДНК хозяина. В то время как данные Метагеномика обеспечивает обменные потенциалы общин исследованных metatranscriptomics дополнение к этому, раскрыв дифференциальную экспрессию кодированных функций 9. Комплексная оценка геномики и стенограммы данные получены новые модулиЗагорается на динамику общественных взаимодействий и способствует развитию оздоровительных терапий 9,10,55.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (1 R01 GM095384-01) присуждена Форест Ровер. Мы благодарим Epicentre, компании Illumina для обеспечения раннего доступа к Рибо-Zero эпидемиологии комплектов. Мы благодарим Отметить Хатай для проектирования и производства владельца ультрацентрифугирование трубки. Мы благодарим Андреаса Хаас и Бенджамин Ноулз для критических чтений и дискуссий рукописи, и Лорен Пол для оказания помощи съемочный процесс.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65, (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10, (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184, (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7, (10), e47305 (2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40, (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7, (9), e45001 (2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12, (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52, (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38, (22), e200 (2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23, (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87, (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3, (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67, (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67, (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23, (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2, (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67, (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4, (10), e7370 (2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1, (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2, (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12, (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8, (3), e58404 (2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56, (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44, (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, Forthcoming.
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27, (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6, (3), e17288 (2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9, (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9, (1), 386 (2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189, (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339, (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8, (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8, (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27, (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28, (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29, (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4, (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5, (2), e9083 (2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14, (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7, (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -H., Bae, J. -W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77, (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15, (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6, (1), 41 (2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5, (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28, (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434, (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59, (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8, (5), e64285 (2013).

Comments

5 Comments

  1. Hi, when generating the microbial metagenome: are you sure you are using DNase I at 1,000 U/µl concentration?

    I think it must be 1,000 U/ml instead of 1,000 U/µl

    Thanks in advance,
    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 16, 2015 - 6:42 AM
  2. Hi Galo,

    Yes to your question. We are using extremely high concentration of the DNase I (1000U/µl) to ensure all extracellular DNA are digested while not adding too much volume to the sample. The amount of extracellular DNA in CF sputum is high. If you were to use this protocol for other samples that do not have that much extracellular DNA, you can definitely adjust the amount of DNase I. The high concentration of DNase I can be prepared from the lyophilized DNase I. The catalogue number is in the materials table.

    Please let me know if you have any other questions.

    Yan Wei

    Reply
    Posted by: Yan Wei L.
    September 16, 2015 - 12:53 PM
  3. In that case I think I had to use that high concentrations of DNase since, although I don't work with CF, my samples are sputum too.

    Thank you very much!

    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 17, 2015 - 4:15 AM
  4. Actually I have another question I cannot answer from internet.

    Normally I use DTT in order to liquefy sputum samples. In your paper you use DTT for the viral extraction, but B-mercaptoethanol for the microbial one instead.

    I don't know if it really makes any difference or there is any reason to use one or another in microbial extracion.

    Thanks again,

    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 17, 2015 - 5:47 AM
  5. Hi Galo,

    Many has tried and used DTT. Our group didn't see any differences. However, since we are modifying the protocol described by Breitenstein et al. (1995) and they used B-mercap, we decided to stick to B-mercap.

    Yan Wei

    Reply
    Posted by: Yan Wei L.
    September 17, 2015 - 12:46 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics