Rena Oren: sekvense Metagenomes och Metatranscriptomes från Komplexa Animal-associerade Prover

Biology
 

Summary

Använda cystisk fibros luftväg som ett exempel, presenterar manuskriptet en omfattande arbetsflöde innefattar en kombination av metagenomic och metatranscriptomic tillvägagångssätt för att karakterisera den mikrobiella och virala samhällen i djurassocierade prover.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tillgängligheten av hög genomströmning sekvense har revolution många områden av biologin. För att bättre förstå värdassocierad virala och mikrobiella samhällen, var en omfattande arbetsflöde för DNA och RNA-extraktion utvecklas. Arbetsflödet genererar samtidigt virala och mikrobiella metagenomes samt metatranscriptomes, från ett enda prov för nästa generations sekvensering. Kopplingen av dessa metoder ger en översikt över både de taxonomiska egenskaper och samhälls kodade funktioner. De presenterade metoderna använder Cystisk fibros (CF) sputum, en problematisk provtyp, eftersom det är utomordentligt viskös och innehåller höga halter av muciner, fri neutrofil-DNA, och andra okända föroreningar. De protokoll som beskrivs här rikta dessa problem och framgångsrikt återhämta virus och mikrobiell DNA med minimal mänsklig DNA kontamination. För att komplettera metagenomiken studierna gjordes en metatranscriptomics protokoll optimerad för att återvinna både mikrobielloch värd mRNA som innehåller relativt få ribosomalt RNA (rRNA) sekvenser. En översikt av dataegenskaperna presenteras för att tjäna som en referens för att bedöma framgången av metoderna. Ytterligare CF sputumprover ades också in för att (i) utvärdera konsistens av microbiome profiler inom sju dagar i följd inom en enda patient, och (ii) jämför konsistensen av metagenomic förhållningssätt till en 16S ribosom RNA-gen-baserad sekvensering. Resultaten visade att daglig fluktuation av mikrobiella profiler utan antibiotika störning var minimal och taxonomi profilerna för de gemensamma CF-associerade bakterier var mycket likartad mellan 16S rDNA bibliotek och metagenomes genererade från hypotonisk lys (HL) härrörande DNA. Skillnaderna mellan 16S rDNA taxonomiska profiler genereras från totalt DNA och HL-härledda DNA antyder att hypotonisk lys och tvättstegen gynnas inte bara avlägsnande av DNA från människa härledd, men också mikrobiellt härledd extracellular-DNA som kan förvränga det faktiska mikrobiella profilerna.

Introduction

Virala och mikrobiella samhällen som är förknippade med den mänskliga kroppen har undersökts i stor omfattning under det senaste decenniet genom tillämpning av sekvenseringsteknologier 1,2. Utfallen har lett till erkännande av betydelsen mikroberna i människors hälsa och sjukdom. Den större initiativ kom från den mänskliga microbiome projekt som beskriver bakterierna (och vissa arkéer) bosatt på mänsklig hud, och inom orala håligheter, luftvägar, urogenitala området, och mag-tarmkanalen 3. Ytterligare microbiome studier av friska humana luftvägar genom bronkoalveolär lavage (BAL) 4,5 och nasofarynxpinnar 4 har visat att lungan kan tjäna som en miljöprovtagningsanordning, resulterar i övergående mikrobiell kolonisering i luftvägarna. Däremot kan effekterna av mikrobiell kolonisering i nedsatt luftvägsytor leda till allvarliga och kroniska lunginfektioner, såsom de framgår av cystisk fibros (CF) patienter.

t "> CF är en dödlig genetisk sjukdom som orsakas av mutation i cystisk fibros transmembran regulator (CFTR) gen 6. Dessa mutationer ger upphov till defekta CFTR-proteiner som i sin tur påverkar transepitelial jontransport över det apikala ytan av epitelet. Sjukdomen drabbar flera organsystem, men majoriteten av dödlighet och sjuklighet är hänförlig till CF lungsjukdom 7. CF lungan ger ett unikt ekosystem för mikrobiell kolonisering. Defekten i jontransport orsakar slem att bygga upp i CF luftvägarna, skapar mikromiljöer som består av aerob , mikroaerofila och anaeroba fack förankrad med en statisk näringsrikt slemhinneyta. Denna miljö underlättar kolonisering och spridning av mikrober, inklusive virala, bakterier och svampar. Akuta och kroniska pulmonella mikrobiella infektioner leder till konstanta men ineffektiva immunsvar, vilket resulterar i omfattande luftvägs ombyggnad, förlust av lungkapacitet, och i slutändan pulmonary misslyckande.

Bakteriella samhällen som är förknippade med CF lungan har beskrivits väl med båda kulturberoende och kulturoberoende metoder, bland annat med hjälp av 16S ribosomalt RNA (rRNA) genen sekvense 8 och shotgun metagenomik 9,10. 16S rRNA-baserade tillvägagångssätt är i stånd att karakterisera ett brett spektrum av mikrobiella arter och fånga breda förskjutningar i gemenskap mångfald. Det är dock begränsad i sin resolution att definiera de samhällen (sammanfattade i Claesson et al. 2010 11) och förutsägelser metabola potentialer är begränsade till dessa allmänna funktioner kända för taxa identifieras. Därför 16S rRNA genen sekvenseringsmetoder är otillräckliga för den nödvändiga taxonomiska och funktionell analytisk noggrannhet de olika mikrobiella samhällen som finns i CF lungorna. Den metagenomic tillvägagångssätt beskrivs här kompletterar 16S rRNA synsätt, övervinner sina begränsningar, och möjliggör ett relativt effektivt sättatt analysera både den mikrobiella taxonomi och genetiska innehållet i CF lungorna.

Mikrobiell DNA isolerat från animaliska associerade prover innehåller ofta en stor mängd värd-DNA. CF sputum eller lungvävnadsprover innehåller vanligtvis en stor mängd mänskligt DNA släpptes av neutrofiler i immunsvaret, ofta mer än 99% av den totala DNA 12-14. Även om vissa intakta humana celler kan vara närvarande, är det mesta av detta DNA-fria i lösning eller adsorberas till ytan av mikrober. Dessutom närvaron av exceptionellt viskösa slemproppar, cellrester och andra okända föroreningar ytterligare komplicera isolering av mikrobiella celler. Flera metoder testades för att tömma dessa prover av humant DNA, inklusive Percoll-gradienter för att separera humana från mikrobiella celler 15, behandling med DNas I, etidiumbromid monoazide att selektivt nedbryta humant DNA 16 och MolYsis satsen, alla med begränsad framgång. Hittills har mest effektiv mikrobiell DNA förfarande för CF-sputum rening har varit en modifiering av förfarandet beskrivet av Breitenstein et al. (1995) 17. Detta tillvägagångssätt, häri känt som hypotonisk lys (HL) metoden, använder en kombination av β-merkaptoetanol för att minska mucin disulfidbindningar, hypotonisk lys av eukaryota celler, och DNas I-behandling av lösligt DNA 9. Trots bristen på alternativ HL metoden väckt vissa farhågor på grund av (i) eventuella fördomar till följd av oönskad lys av mikrober och (ii) om de observerade fluktuationer i samhällets sammansättning 9,10 är en artefakt av variationer i samband med provbearbetning. Förutom alstringen av shotgun metagenomes, vi itu med dessa frågor genom att jämföra 16S rRNA-genen profiler av det totala DNA och mikrobiell extraheras DNA från HL-metoden med användning av samma uppsättning av sputumprover uppsamlade från en enda patient över sju dagar i följd.

ent "> Jämfört med mikrobiella samhällen, är karakterisering av virus samhällen förknippas med djur begränsad 18,19 De virala samhällena i CF airways har endast karakteriseras minimalt 20 -.. 22 Den första metagenomic studien karakterisera DNA av virus samhällen i CF airways visade att de flesta virus förknippade med CF lungorna är fager 20. Den metaboliska potential fag i CF och icke-CF individer var signifikant olika. Specifikt fag samhällen i CF individer genom gener reflekterande av bakteriella värd anpassningar fysiologi CF luftvägar, och bakteriella virulens 20. Efterföljande metagenomic studier av virus i CF lungvävnad visade distinkt rumslig heterogenitet av virala samhällen mellan anatomiska regioner 22. Dessutom CF lungvävnad hyste lägsta viral mångfald observerats hittills i alla ekosystem 22. De flesta virus identifierade var fagermed potential att infektera CF patogener. Men eukaryota virus såsom herpesvirus, adenovirus och humana papillomvirus (HPV) har också upptäckts. I ett fall där cystor i lungvävnaden observerades under dissektion, var mer än 99% av ett humant papillomvirus genomet återvinns, trots att patienten aldrig diagnostiserats med en lung papillom eller carcinom. Detta indikerar att den virala mångfalden närvarande inte bara återspeglar hur allvarlig vävnadsskada, men kan också avslöja och förklara en underliggande okaraktäriserat sjukdom. De protokoll som beskrivs här ger ett enkelt, men ändå kraftfullt sätt att isolera viruslika partiklar (VLP) från prov som består av stora mängder tjockt slem, värd och mikrobiella celler, fritt DNA, såväl som cellrester.

Komplement metagenomik är metatranscriptomics används för att övervaka dynamiken i genuttryck över mikrobiella och värd 9,23. I det här fallet, både mikrobiellt och HOSt-mRNA måste företrädesvis väljas. Eftersom bakterie mRNA inte polyadenyleras, kan en oligo-dT-baserade mRNA rullgardins metoden inte utnyttjas. Polyadenylering-beroende RNA-förstärkning kan inte användas i värdassocierade prover om provtagningen är kända för att innehålla stora mängder eukaryot mRNA. Många djurrelaterade prover, inklusive CF slem, innehåller en hög täthet av celler förutom stora mängder cellrester och nukleaser som inkluderar RNaser. Därför är en annan utmaning för att förhindra omfattande RNA nedbrytning under metatranscriptome bearbetningen. I de flesta fall är total RNA extraherat från CF slem delvis försämrad, begränsar nedströms applikationer och verktyg för den härledda RNA. Under senare år har flera metoder för rRNA utarmning utvecklats och anpassats i kommersiellt tillgängliga kit. Effekten av dessa metoder är dock begränsad, speciellt vid arbete med delvis försämrad rRNA 9,24. De metoder som används här tillåtered för hämtning av delvis nedbrutet totalt RNA lämpligt för effektiv nedströms totala rRNA borttagning. Direkt jämförelse av effektiviteten i rRNA avlägsnande från delvis försämrat total RNA jämföra två olika satser illustrerades av Lim et al. (2012) 9.

Sammantaget är målet för detta manuskript för att ge en komplett uppsättning protokoll (Figur 1) för att generera virala och mikrobiella hagelgevär metagenomes, och en metatranscriptome, från ett enda djur associerad prov, med hjälp av inducerat sputum provet som ett exempel. Molekylär laboratorium arbetsflöde bör omfatta separata för- och efterförstärkningsområden för att minimera korskontaminering. Metoderna är lätt att anpassa till andra provtyper såsom vävnads 22, nasofaryngeal och svalg 25, bronkoalveolärt lavage (BAL) och korall (opublicerade data). Varje prov bör behandlas omedelbart efter samlingen speciellt när mikrobiella metagenomik och träffadeatranscriptomics studier önskas. Om proverna frystes, begränsar det isolering av intakta mikrobiella celler för mikrobiella metagenomes som frysning potentiellt störa cellernas integritet. Däremot frysning inte utesluta metatranscriptomics och viral isolering, men kvaliteten på RNA och mängden av viruspartiklar återvunna kan påverkas genom frys-tö process. Det är viktigt att notera att inducerad sputum har fungerat som den primära källan av prover i många studier i samband med vuxna CF-patienter och andra kroniska lungsjukdomar 26,27 som BAL kan vara för invasiva. I våra studier var sputumprover samlas med en noggrann och konsekvent provtagningsmetod, dvs efter munvatten och sköljning av munhålan med steril koksaltlösning för att hålla muntliga mikrober förorening inom sputumprover till ett minimum.

Protocol

OBS: inducerat sputum samlades in i enlighet med University of California Institutional Review Board (HRPP 081.500) och San Diego State University Institutional Review Board (SDSU IRB # 2121), genom forskningskoordinator vid University of California, San Diego (UCSD ) vuxna CF klinik.

1. Provtagning och förbehandling (Förbehandla Prover inom 30 min efter samling)

  1. Före provsamling, etikett fyra 15 ml rör som: (i) viralt metagenome, (ii) mikrobiell metagenome, (iii) metatranscriptome, och (iv) extra upphostningar. Upprepa för varje prov. Tillsätt 2 ml 0,1 mm kiseldioxidpärlor i röret märkt "Metatranscriptome", följt av 6 ml guanidinisotiocyanat baserad RNA lyseringsbuffert (GITC-lysbuffert).
  2. Under provsamling, använd steril koksaltlösning (60 ml) som en mun skölj att minimera förorening med orala mikrober. Samla sputumprover under en 30 min period efterinhalation av 4 ml av 7% hyperton saltlösning via en nebulisator. Processprover omedelbart, såsom beskrives nedan.
  3. Späd provet till en total volym av 8 ml.
    1. Uppskatta provvolym genom att väga tom sputum cup före och efter provtagningen.
    2. Om volymen av provet är mindre än 8 ml, tillsätt lämplig mängd av 0,02 ^ m-filtrerad 1 x PBS för att generera en total provvolym på minst 8 ml.
    3. Omedelbart homogenisera provet med en 3 ml sprutan tills inga synliga klumpar kvar inom sputum
    4. Med samma spruta, utarbeta 2 ml slem och omedelbart gå till steg 1.4.
  4. Bevara Total RNA från upphostningsprov
    1. Injicera 2 ml slem prov från steg 1.3.4 i "metatranscriptome" rör innehållande kiseldioxid pärlor och GITC-lyseringsbuffert.
    2. Stäng locket och försegla röret säkert med Parafilm för att undvika läckage.
    3. Homogeni sputum omedelbart vid medelhastighet under 10 kmn. Beroende på virvel tillgängliga, placera röret horisontellt och säkra med tejp vid behov.
    4. Håll röret vid 4 ° C eller i ett is låda och transport till laboratoriet om så är nödvändigt.
  5. Med samma spruta, delprov 2 ml slem vardera i rören märkta "viral metagenome" och "mikrobiell metagenome" och överföra de återstående slem från sputum koppen i röret märkt "extra slem".
  6. Förvara alla rör vid 4 ° C eller isbox och transport till laboratoriet vid behov.

2. Generera Viral Metagenome

  1. Framställning av buffertar och lösningar
    1. Förbered 50 mM ditiotreitol (DTT) i förväg och förvara vid 4 ° C. Detta är stabil i 2 veckor.
    2. Förbered Saline Magnesium (SM) buffert (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO 4, 50 mM Tris-HCl; justera pH till 7,4. Filter sterilisera (0,02 um porstorlek) och förvara i rumstemperatur. Förbered DNas I enzym till 100 U / l (i molekylär kvalitet vatten) från frystorkat bovint pankreas DNas I enlighet med den verksamhet som definieras av Dornase enhet / mg torrvikt.
    3. Förbered 10x DNas I-buffert (50 ml): 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl2; justera pH till 6,5. Filter sterilisera (0,02 um porstorlek) och förvara i rumstemperatur.
    4. Förbered 4% paraformaldehyd.
    5. Förbered 200x TE-buffert: 2 M Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M EDTA. Filter sterilisera (0,02 um porstorlek) och förvara i rumstemperatur.
    6. Bered 10 ml av 10% natriumdodecylsulfat (SDS) med användning av molekylärbiologisk kvalitet vatten.
    7. Förbered 50 ml CTAB / NaCl (10% CTAB. 700 mM NaCl) med hjälp av molekylärbiologisk kvalitet vatten. Lös CTAB över natten. Om fällningar kvarstår, värma upp lösningen vid 65 ° C. Lösningen är mycket viskös i rumstemperatur.
      OBS: Den filtrering av buffertar som använder 0,02 ìm filter medger avlägsnande av viruslika partiklar i lösningen, men intefri nukleinsyra föroreningar syra.
  2. Prov Förbehandling
    1. Bered lämplig mängd färskt 6,5 mM ditiotreitol (DTT).
    2. Späd blandningen med tillsats av 0,02 ^ m-filtrerad SM-buffert för att alstra en total volym av 6 ml.
    3. För att underlätta slem upplösning, tillsätt lika volym (6 ml) av 6,5 mM ditiotreitol (DTT) till provet, skaka kraftigt för att blanda och inkubera under en timme vid 37 ° C.
    4. Vortex det behandlade provet kraftigt och centrifugera vid 10 ° C, 3056 x g under 15 till 20 min.
    5. Samla upp supernatanten i en ny 15 ml tub.
    6. Upprepa steg 2.2.3 och 2.2.5 för nästa prov.
    7. Överföring och filtrera supernatanten med ett filter 0,45 | im är monterad på en spruta in i en ny 15 ml tub.
      OBS: Om filter träskor, hämta proverna från sprutan och utelämna filtreringssteget.
    8. Ta en 100 l delprov av 0,45 um-filtrerat prov, utför kloroform och DNas I-behandling (se seInsatser 2.3.12-2.3.15) och tillsätt lika stor volym av 4% paraformaldehyd för att fixera provet för epifluorescensmikroskopi (Figur 2A).
    9. För en "catch-all" viruspartiklar anriknings synsätt (se diskussion), gå till steg 2.3.12 att utelämna viruspartiklar urval baserat på cesiumkloridgradient ultracentrifuge. Emellertid kan detta resultera i kloroform-resistent bakteriell förorening och högre mängd värd-DNA i det virala lysatet.
  3. Viral lika partiklar (VLP) Anrikning och rening
    1. Förbered individuell cesiumklorid (CsCl) lösningar genom upplösning av den lämpliga mängden av CsCI med ofiltrerat SM-buffert till den önskade densiteten (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml och 1,2 g / ml). Filtrera varje lösning genom ett 0,02 pm filter före användning.
    2. Konfigurera CsCl-gradient som visas i figur 2B.
    3. Belastning 1 ml av 1,7 g / ml i varje rör, belastning 1 ml 1,5 g / ml i varje rör, belastning 1 ml 1,35 g/ ml i varje rör, last 1,2 g / ml i varje rör (tillval), och slutligen lasta 6-8 ml prov i respektive rör. Markera enstaka skikt för att beteckna placeringen av varje fraktion.
    4. Balanserar varandra motsatta par rör på 1 mg.
    5. Lasta varje rör i spinn hinken. Spin alla skopor även om de är tomma. Ladda spin skopan på rotorn.
    6. Centrifugera vid 82844 xg vid 4 ° C under 2 h.
    7. Efter centrifugering, försiktigt bort rören från innehavaren utan att störa de densitetsgradienter.
    8. Med användning av en 3 ml spruta med en 18 G nål, genomborra röret strax under 1,5 g / ml densitet skikt (figur 2, röd pil) och dra ~ 1,5 ml in i sprutan.
    9. Samla upp den övre fraktionen genom att långsamt ta bort nålen och att låta den återstående fraktionen i röret för att droppa in i ett nytt 15 ml rör genom punktionen. Märk detta som "övre fraktionen avfall".
    10. Samla 1,5 g / ml FRACTIOn (innehållande VLP) från sprutan genom att mata ut innehållet i två nya mikrofugrör.
    11. Upprepa steg 2.3.8-2.3.10 för alla prover.
    12. Lägg 0,2 volym kloroform i den virala koncentratet, skaka kraftigt, inkubera vid RT i 10 min, centrifuge vid max hastighet i 5 min, och samla vattenfasen.
    13. Lägg 10x DNas buffert och DNas I (slutlig koncentration = 2,5 U / | il) i kloroform behandlade viruskoncentrat, och inkubera vid 37 ° C under 1,5-2 h.
    14. Inaktivera DNas aktiviteten vid 65 ° C i 15 minuter.
    15. Avlägsna 15 ul av kloroform och DNas I-behandlad virusfraktionen till ett nytt rör och tillsätt 15 | il 4% paraformaldehyd för att fixera provet för epifluorescensmikroskopi.
  4. DNA-extraktion
    1. Pool virala koncentrat från varje prov i en rengjord och autoklaveras 50 ml Oak Ridge höghastighetståg centrifugrör.
    2. Lägg till följande: 0,1 volym 200x TE-buffert, 10 pl 0,5 M EDTA per ml sriklig, 1 volym formamid och 10 pl glykogen. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
    3. Använda de nya volymer, tillsätt 2 volymer av rumstemperatur 100% etanol. Blanda väl och inkubera vid 4 ° C under minst 30 min.
    4. Pellets DNA genom spinning röret vid 17.226 xg under 20 min, vid 4 ° C med användning av en SS-34-rotor.
    5. Kassera supernatanten försiktigt med hjälp av en serologisk pipett. Tvätta pelleten två gånger med iskall 70% etanol.
    6. Avlägsna så mycket vätska som möjligt och göra det möjligt för pelleten lufttorka vid rumstemperatur i 15 min.
    7. Resuspendera DNA-pelleten i 567 | il 1 x TE-buffert (pH 8,0).
      OBS: Lämna minst 15 min för fullständigt upplöst vid rumstemperatur. Förvara återsuspenderades DNA över natten vid 4 ° C tills vidare bearbetning.
    8. Överför hela 567 pl suspenderade DNA-lösning i en ny 1,5 ml mikrofugrör. Lägg 30 pl förvärmda 10% SDS och 3 pl proteinas K (20 _6; g / ml), blanda väl och inkubera i 1 timme vid 56 ° C. Pre-varma CTAB / NaCl vid 65 ° C.
    9. Lägg 100 pl av 5 M NaCl och blanda väl. Lägg 80 | il av förvärmda CTAB / NaCl-lösning, virvel, och inkubera under 10 min vid 65 ° C.
    10. Lägg lika stor volym kloroform, virvelström för att blanda, och centrifugera vid 16.100 xg under 5 minuter.
    11. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrofugrör. Tillsätt en lika volym av fenol / kloroform, virvelström för att blanda, och centrifugera vid 16.100 xg under 5 minuter.
    12. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrofugrör. Tillsätt en lika stor volym kloroform, virvelström för att blanda, och centrifugera vid 16.100 xg under 5 minuter.
    13. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrofugrör. Lägg lika volym isopropanol till supernatanten fraktionen, blanda och inkubera vid -20 ° C under minst 30 min.
    14. Pellets DNA, centrifugera vid 16.100 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Pipettera supernatanten försiktigt och skölj pelleten två gånger med iskall 70% etanol. Utför en kort centrifugering och avlägsnande av kvarvarande etanol ur röret. Lufttorka pelleten i 15 min.
    15. Resuspendera DNA-pelleten med 50 pl elueringsbuffert (5 mM Tris, pH 8,5). Låt pelleten rehydrera i minst 5 min i rumstemperatur.
    16. Kvantifiera DNA med en högkänslig fluorescens-baserad analys.
  5. Förstärkning med hjälp Phi29 polymeras (tillval)
    1. Bered 2x pamingsbuffert: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM MgCl2.
    2. Späd Phi29 DNA-polymeras till 5 U / ^.
    3. Förblandning provbuffert, som består av 50 pl slumpmässig hexamer primer (100 M), 125 pl 2x pamingsbuffert och 25 pl vatten. Alikvotera och förvara vid -20 ° C.
    4. Förblandning reaktionsbuffert, som består av 100 l Phi29 10x buffert, 40 pl 10 mM dNTP och 560 l vatten. Alikvotera och förvara vid -20 ° C.
    5. Lägg ett pl mall-DNA i 4 pl provbuffert.
    6. Inkubera the blandningen vid 95 ° C under 3 min och kyler på is.
    7. Lägg 14 | il reaktionsbuffert i blandningen från 2.4.4, blanda genom att pipettera upp och ned.
    8. Lägg ett pl av Phi29 DNA-polymeras, blanda genom att pipettera upp och ner, och inkubera vid 30 ° C under 18 h följt av 65 ° C under 10 min.
    9. Städa upp reaktionerna använder iska DNA-kolonner eller fenol / kloroform och etanolutfällningar.
  6. Epifluorescensmikroskopi (Se Haas et al. 2014 28 för filtrering systeminställnings)
    OBS: Efter isolering och rening, epifluorescensmikroskopi med nukleinsyra-färgämnen kan användas för att verifiera närvaron och renhet av virala partiklar i prover (figurerna 2A och 2C). Fri DNA i provet kan ge upphov till hög bakgrundsfluorescens. Därför bör provet vara DNas I-behandlad före fixering och färgning för mikrofotografier.
    1. Förbered monteringslösning (0,1% askorbinsyra, 50% glycerol). Lägg 100 pl av 10% askorbinsyra till 4,9 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), blanda omsorgsfullt. Tillsätt 5 ml av 100% glycerol till blandningen, blanda väl och märka röret som "mount".
    2. Filter montera med hjälp av en 0,02 um aluminiummatris engångsspruta filter, portion i mikrofugrör, och förvara vid -20 ° C.
    3. Alikvot 100 pl prov till ett nytt mikrofugrör och lägga lika stor volym av 4% paraformaldehyd fixa VLP. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under åtminstone 10 min.
    4. Gör upp volymen till 1 ml genom att tillsätta 800 pl 0,02 um-filtrerat vatten. Lägg ett pl av SYBR Gold fläck i röret och inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
    5. Ställ in filtreringssystem genom att slå på vakuumpumpen mellan -9 och -10 psi (-62,1 och -68,9 kPa).
    6. Tvätta piedestalen med vatten och placera en 0,02 um aluminiummatrisfilter med ringformig polypropylen stödring i filter piedestal.
    7. Placera en filtertorn på toppen av filtret piedestal med filtret och säker med en klämma.
    8. Pipet innehållet från 1,5 ml mikrofugrör i filtertornet, och låt några minuter för prov för att filtrera igenom.
    9. Etikett och pipett 10 ul mount reagens i ett objektglas.
    10. Låt vakuum på när du tar bort filtret tornet och klämma.
    11. Ta försiktigt bort filtret från filter piedestal och blot botten av filtret med en Kimwipe, sedan placera filtret direkt på toppen av berget på objektglaset.
    12. Pipet ytterligare 10 pl mount reagens på filter och placera ett täck över filtret.

3. Generera Mikrobiell Metagenome

  1. Framställning av buffertar och lösningar
    1. Bered 50 ml 1x DNas buffert: 50 mM NaAc, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2; justera pH till 6,5. Filtersterilisera (0,22 ^ m) och lagravid rumstemperatur.
    2. Förbered DNas I enzym till 1000 U / l (i molekylär kvalitet vatten) från frystorkat bovint pankreas DNas I enlighet med den verksamhet som definieras av Dornase enhet / mg torrvikt.
    3. Bered 100 ml av SE-buffert: 75 mM NaCl, 25 mM EDTA; justera pH till 7,5. Filter sterilisera (0,22 um) och förvara i rumstemperatur.
  2. Prov Förbehandling Före DNA Extraction
    1. Späd blandningen med tillsats av 5 volymer av 0,22 ^ m-filtrerad 1 x PBS. Till exempel, tillsätt 10 ml 1x PBS i 2 ml prov.
    2. Lägg β-merkaptoetanol till 2% (volym / volym) slutlig koncentration. Vagga blandningen (i dragskåp) vid rumstemperatur under 2 h.
    3. Spin provet vid 10 ° C och 3056 x g under 15 min och kassera supernatanten.
    4. Återsuspendera pelleten i 10 ml av molekylärbiologisk kvalitet vatten (eller 0,22 | im filtrerat vatten) och inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
    5. Upprepa steg 3.2.3 och 3.2.4 gång.
    6. SpiN vid 10 ° C och 3056 x g under 15 min och kassera supernatanten.
    7. Återsuspendera pelleten i 5 ml 1x DNas buffert och tillsätt 15 | il DNas I (1000 U / ^) per ml av provet.
    8. Inkubera vid 37 ° C med upprepad blandning under 2 h.
    9. Inaktivera DNas aktiviteten vid 65 ° C i 15 minuter.
    10. Spin vid 10 ° C och 3056 x g under 15 min och kassera supernatanten. Suspendera pelleten i 10 ml SE buffert.
    11. Upprepa steg 3.2.10.
    12. Spin vid 10 ° C och 3056 x g under 15 min och kassera supernatanten.
    13. Suspendera pelleten i 2 ml SE buffert, och överför till två mikrofugrör.
    14. Pellets cellerna i mikrofugrör. Snurra rören vid 16.100 xg vid rumstemperatur under 15 min.
    15. Avlägsna supernatanten och extrahera DNA från de pelleterade celler med användning av ett genomiskt DNA-extraktion kit, Grampositiva variationsprotokoll.

4. Generera Metatranscriptome

  1. Prov Pre-Behandling
    1. Utför mekanisk lys av celler genom pärla slå i GITC-lyseringsbuffert omedelbart efter provtagning och homogenisering. Se steg 1.4.
    2. Snurra blandningen vid 4 ° C och 600 xg under 5 minuter för att pelletisera kiseldioxidpärlor.
    3. Överför supernatanten till ett nytt rör.
    4. Tillsätt 200 pl kloroform för varje 750 pl GITC-lyseringsbuffert används, skaka kraftigt för hand i 15 sek, inkubera vid rumstemperatur i 10 min, och centrifugera vid 4 ° C och 3056 xg under 15 min. Under denna 15 min spinn, förbereda för steg 4.2.
    5. Efter 15 min spinn (en klar åtskillnad mellan vattenfasen-inter-organiska fasen former), extrahera vattenfasen (utan att störa interfas) till nya RNas fria rör (s).
      OBS: Den vattenhaltiga fasen innehåller RNA. Håll rören på is fram till nästa steg.
  2. Utför total RNA-extraktion och rening med hjälp av kommersiellt tillgängliga kolumnbaserad RNA rening kit eller conventional isopropanol baserade RNA nederbörd.
    1. Kiseldioxidkolonn-baserade RNA Rening
      1. Mät den totala volymen av den vattenhaltiga fraktionen erhålles.
      2. Lägg lämplig volym av RNA-bindande buffert till prov och blanda väl.
      3. Justera blandning till lämpliga bindande villkor enligt tillverkarens protokoll. Blanda väl och gör en kort centrifugering.
      4. Ladda blandningen i RNA-kolumnen. För en stor volym prov, använda flera lastning och ladda varje kolumn upp till 4x. Annars överväga att använda flera kolumner för varje prov.
      5. Tvätta kolonnen lämpligt enligt tillverkarens protokoll.
      6. Eluera RNA med åtminstone 30 ^ il RNas-fritt vatten. Dubbel eluering kommer något öka utbytet av RNA. Detta kommer dock att späda ut RNA-koncentration.
      7. Mät RNA-koncentrationen och gå direkt till DNas I-behandling. Använd Bioanalyzer att kontrollera kvaliteten hos RNA (rekommenderas).
      8. RNA Utfällning
        1. Tillsätt en lika stor volym isopropanol (t.ex., 500 | il isopropanol till 500 ul av vattenhaltig fraktion) och 2 ul av 10 ug / ul RNas-fri glykogen till provet.
        2. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 10 min.
        3. Centrifugera vid 12000 xg och 4 ° C under 15 min.
        4. Ta försiktigt bort supernatanten, tillsätt 1 ml RNas-fri 75% etanol. Snurra blandningen vid 7500 xg och 4 ° C under 5 min för att se till att pelleten är intakt.
        5. Försiktigt bort etanolen.
        6. Upprepa steg 4.2.2.4 och 4.2.2.5 gång.
        7. Lufttorka pelleten i 10 min.
        8. Rehydrera pelleten i 50 | il RNas-fritt vatten, inkubera vid 55 ° C under 5 min och fortsätta direkt till DNas-behandling. Använd Bioanalyzer att kontrollera kvaliteten av RNA (rekommenderas).
        9. Store RNA i portioner vid -20 ° C eller -80 ° C för långtidsförvaring.

Representative Results

Virala Metagenomes

CF sputum är exceptionellt viskös och innehåller en stor mängd mucin och fri DNA (Figur 2A); densitetsgradientlösningen ultracentrifuge underlättar elimineringen av värdhärledda DNA (figur 2B). Resultaten från en tidigare studie 9 visar åtta viromes genereras från den presenterade arbetsflöde sammanfattas här (tabell 1). Sju prover (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, och CF5-B, Tabell 1) bearbetades såsom beskrivits i avsnitt 2. De genererade viromes innehöll lite (0,02 % -3.7%) mänskligt ursprung sekvenser med ett enda undantag (70%). CF4-A utelämnades från densitetsgradient ultracentrifuge steg (CF4-A) och virome genereras från detta särskilda prov innehöll> 97% sekvenserna mänskliga härledda (tabell 1). Figur 2 visar ett exempel på den epifluorescensmikroskopi bilden av en typisk CF sputum provet före (Figur 2A) och efter (figur 2C) densitetsgradient ultracentrifuge. Tydliga viruslika partiklar (VLP) observerades i mikrofotografier utan stora partiklar efter densitetsgradient separation. Efter VLP DNA-extraktion, är bakteriell kontamination ofta testats med hjälp 16S rDNA förstärkning innan sekvensering av VLP-DNA.

Microbial Metagenomes

Sju sputumprover presenteras här samlades in från en enda CF-patient över sju dagar i följd. Patienten började på oral antibiotika (Ciprofloxacin och doxycyklin) på dag 3 efter sputum samlades. Volymen för varje upphostningsprov uppsamlas från denna patient var 15 ml under de 7 dagarna; Därför, PBS inte lagt till provet. Målet med denna provtagning händelsen var att utvärdera de protokoll som presenteras i detta arbetsflöde genom (i) utvärdera den dagliga fluktuationer i mikrobiell samhällsstruktur, och (ii) jämförden mikrobiella samhällsstrukturen och upplösning mellan metagenomik och 16S rDNA sekvensering. Därför var totalt DNA och HL-DNA som extraherats från varje prov.

HL-DNA-koncentration av varje upphostningsprov efter DNA-extraktion presenteras i tabell 2. Det totala utbytet av HL-DNA varierade från 210 ng till> 5 ^ g. Illumina sekvense bibliotek alstrades med en total utgångsmaterial av en ng för varje prov (Figur 3). Egenskaperna hos metagenomiken data presenteras i tabell 2. Alla utom en biblioteket gav mer än 1 miljon sekvenser och mer än 85% av hög kvalitet sekvenser behölls på data förbehandling med hjälp av PRINSEQ 29 programvaran. Samtliga datamängder först förbehandlas för att ta bort dubbletter och sekvenser av låg kvalitet (lägsta kvalitets poäng av 25), följt av ytterligare screening och borttagning av humant ursprung sekvenser med hjälp DeconSeq 30. Mängden människa-derived kontamination sekvens är starkt beroende av provegenskaperna. Här, den totala mängden humant ursprung sekvenser varierade från 14 till 46% (tabell 2). De förbehandlade sekvenser sedan kommenterad använder Metaphlan 31 rörledningen samt MG-RAST 32 server.

Förutom metagenomes ades 16S rDNA amplikon bibliotek genereras från både det totala DNA och HL-DNA via primrar inriktade approximativt 300 bp av V1-V2 variabel region i 16S rRNA-genen 33,34. PCR-produkter från enskilda prover normaliserades och samman för sekvense använder Illumina 500-cykel parade slut sekvense utförs på MiSeq plattformen. Kopplade-end 16S rDNA amplikon sekvenser sorterade prov via streckkoder med hjälp av en python skript och de parade läser monterades med hjälp phrap 35,36. Monterade sekvens ändar trimmas tills den genomsnittliga kvalitet poäng var ≥20 använder en 5 nt fönster. Potentiella chimärer varn avlägsnas med hjälp Uchime 37 mot en chimär fritt delmängd av SILVA 38 referenssekvenser. Taxanomy tilldelades till den höga kvaliteten läser med SINA 39 (version 1.2.11) med hjälp av 418497 bakteriella sekvenserna från SILVA 38 databasen. Sekvenser med identiska taxonomiska uppdrag har klustrade att producera Operativa Taxonomiska Units (Otus). Denna process genererade 1.655.278 sekvenser i 16 prover (genomsnittlig storlek: 103.455 sekvenser / prov, min: 72.603; max: 127.113). Median Varor täcknings poäng, ett mått på fullständighet sekvense, var ≥ 99,9%. Programpaketet Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) användes för analys och figur generation. Alfa-mångfald (intra-prov) och beta-mångfald (inter-prov) beräknades i Explicet vid förtunning punkten 72.603 sekvenser med 100 bootstrap åter provtagningar.

Den första frågan föremål för denna studie var om hypoton lys preferentiallierad väljer för (dvs, företrädesvis behåller eller lyserar) särskilda grupper av mikrober. Efter den första hypotonisk lys, re-suspenderade pelleterade cellerna delsamplas från de två första proverna (CF1-1A * och CF1-2A *) att jämföra med samma prover efter den andra hypotonisk lys (CF1-1and CF1-2). Samtliga prover behandlas lika, dvs behandlas med DNas före DNA-extraktion, följt av DNA-extraktion och sekvense pipeline. Såsom visas i fig 4, de mikrobiella profilerna av delprov är mycket lika med proverna efter två hypotona lyseringsbehandlingar. Dessutom ökar det andra hypotonisk lys fraktionen av icke-humana sekvenser genom 6-17% inom de metagenomes (tabell 2).

För att testa för skillnader i mikrobiell sammansättning mellan metagenomic- och 16S rDNA-baserade profilering, och för ändringar före och efter hypotonisk lys som skulle kunna förklara skillnaderna tidigare sett mellan vårt studtalet och andra, var bakteriella 16S rDNA sekvensebibliotek genereras från både den totala DNA och HL-härledda DNA (Figur 4B). På släktet nivå, de taxonomi profilerna för de gemensamma CF-associerade bakterier såsom Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella och Streptococcus var mycket likartad mellan 16S rDNA bibliotek och metagenomes genererade från HL-härledda DNA. Men Rothia upptäckt i 16S rDNA biblioteken var inte lika riklig som med metagenomic biblioteken. När man jämför 16S rDNA taxonomiska profiler som genereras från total DNA och HL-härledda DNA, Pseudo var differentiellt representerade i det totala DNA jämfört med HL-härledda DNA start från dag 3.

Metatranscriptomes

Typiskt är den totala RNA extraherat från CF-sputum delvis försämrat och storleken varierar från 25-4,000 bps (fig 5A och et al. 2012 9. Fraktionen av rRNA inom de icke-utarmat metatranscriptomes varierar 27-83%, och den relativa förekomsten av rRNA varierade mellan prover (tabell 3, uppgifter som hämtas från Lim et al 9.). Emellertid utarmning med Ribo-Zero-kit minskade rRNA relativa förekomsten av rRNA till 1-5%, med undantag för provet CF1-F. Variationen i effektivitet rRNA borttagning kan återspegla kvaliteten på extraherade RNA, eller skillnader i den mikrobiella miljön närvarande och därmed tillgängligheten till rRNA för sonder hybridisering 9. De elektroferogrammen för en framgångsrik (Figur 5B) och misslyckade (figur 5D) rRNA borttagning proceduren med Ribo-Zero rRNA demonteringssats skiljer, där rRNA toppar är synliga i den förlorande borttagning.

Storleksintervallet av cDNA-bibliotek GEnerated reflekterar ofta storleksintervallet av utgångs RNA-provet. Biblioteken cDNA presenteras här genererades med en hel transkriptom förstärkning kit (WTA2) vid rRNA utarmning följt av Roche-454 sekvensebiblioteks förberedelse 9. CDNA genererade innehåller fragment som sträcker sig från 50-4,000 bps (Siffrorna 5E och 5F) och är mycket konsekvent mellan prover (Lim et al. 2012) 9. Tillgången till andra plattformsspecifika RNA-Seq beredning bibliotek kit för närvarande erbjuda fler alternativ för en att kombinera cDNA-syntes och förberedelse sekvensebibliotek under optimala förhållanden. Ett rekommenderade alternativet hittills är ScriptSeq Komplett Guld Kit kombinerar rRNA borttagning reagens rekommenderas ovan och RNA-Seq förberedelse biblioteks kit.

Figur 1
Figur 1: Arbetsflöde för prepdelser av värdassocierad prover, såsom upphostningsprov, för virome, microbiome och metatranscriptome sekvensering.

Figur 2
Figur 2: Cesiumklorid densitetsgradienter ultracentrifuge underlättar elimineringen av extracellulärt DNA och stora partiklar (A), och medge optimal isolering av viral-liknande partiklar från CF sputum. En milliliter av varje lutning skiktas ovanpå varandra före laddning det förbehandlade provet (B). Efter partiklar isolering och rening, epifluorescensmikroskopi med nukleinsyra färgämnen såsom SYBR Guld används för att verifiera närvaron och renheten av viruspartiklar i prover. Tydliga viruslika partiklar (C; vit pil) observerades efter den densitetsgradient separation av CF-upphostningsprov.


Figur 3:. Exempel på storleksfördelningen av NextEra XT biblioteken genereras från 1 ng HL-DNA som resulterade i CF sputum microbiomes Bibliotek normalisering, pooling, och lastning beloppet gjordes enligt beskrivningen i tillverkarens protokoll utan någon avvikelse.

Figur 4
Figur 4: Taxonomisk analys av mikrobiella samhällen i nio prover som tagits i längdriktningen från en CF-patient (A) Microbial profiler baserade på de metagenomic biblioteken genereras från hypotonisk lysmetoden-baserad DNA.. Arten uppdraget baserades på Metaphlan rörlednings följande data förbearbetning som tar bort dubbletter och sekvenser med låg kvalitet och humana sekvenshomologi. I syfte att visa att två-steps hypoton lys inte företrädesvis väljer för specifika grupper av mikrober, delprov (*) efter den första hypotonisk lys ingick. (B) Microbial profiler baserade på V1V2 region 16S rRNA genen sekvense från total DNA (T) och hypoton lys metod -baserad DNA (HL). Dessa uppgifter har inte tidigare publicerats.

Figur 5
Figur 5: Exempel på Agilent 2100 Bioanalyzer elektroferogram av RNA (AD) och cDNA (EF) genereras för de metatranscriptomic biblioteken, med hjälp av RNA-pico och högkänslig dsDNA chips respektive. (A) och (C) visar exemplen i elektroferogrammen före rRNA reningssteg. De elektroferogrammen för en framgångsrik (B) och misslyckad (D) rRNA borttagning förfarande som använder totalt rRNA borttagning kit skiljer sig något, ent som rRNA toppar är synliga i den förlorande borttagning. Storleken utbud av cDNA (EF) genereras med hela-transkriptom förstärkning kit (Sigma-Aldrich) liknar den storleksintervall av utgångs rRNA-utarmat RNA, och mycket konsekvent över de två olika prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
Totalt antal läser 224859 87891 106189 93301 140020 1558 272552 217438
Förbehandlas läser en 109389 73624 67070 82011 68617 1137 215808 158432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
Antal baser 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
Medelvärde läslängd 432 453 431 337 428 215 441 439
Värd sekvenserna b 240 526 28 79774 13 797 585 5859
0,21% 0,71% 0,04% 97,27% 0,02% 70,10% 0,27% 3,70%
Virala hits c 7214 23550 4070 737 4642 22 6466 5981
6,59% 31.99% 6,07% 0,90% 6,77% 1,93% 3,00% 3,78%
Unassigned Läser d 103888 60490 32780 1935 68440 311 105612 119551
94,97% 82,16% 48,87% 2,36% 99,74% 27,35% 48,94% 75,46%
a Läser efter data pre-förfassing av PRINSEQ 29.
b Human läser identifieras av DeconSeq 30 plus läser med en bästa BLASTN träff (NCBI nukleotid-databasen) till provinsen Chordata.
c tBLASTx slår mot interna virala genomet databas. Procent beräknades med det totala antalet förbehandlas läser.
d Läser utan BLASTN slog mot NCBI nukleotid databasen. Procent beräknades med det totala antalet förbehandlas läser. Vissa läser utan BLASTN slog mot NCBI nukleotid-databasen identifierades som viralt på proteinnivå i tBLASTx analysen.

Tabell 1:. Biblioteks egenskaper åtta viromes genereras från sputumprover använder presenterade arbetsflöde Denna tabell är hämtad från Lim <em> et al. (2012) 9. Sju prover (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, och CF5-B) bearbetades såsom beskrivits i avsnitt 2 och genererade viromes som innehöll lite (0,02% - 3,7 %) humanhärrörande sekvenser med ett undantag (70%). CF4-A utelämnades från densitetsgradient ultracentrifuge steg (CF4-A) och genererade virome som innehöll> 97% humana härledda sekvenser.

Prov Koncentration Totalt Utbyte Antal Läser Antal Läser (Bearbetade b) Icke-humana sekvenser
(Ng / ul) (Ng) (Raw a) (%)
CF1-1A * 2,3 1098454 937688 691541
74%
CF1-1 13 1300 2212756 1958910 1574520
80%
CF1-2A * 2,1 210 672878 588106 407530
69%
CF1-2 5,2 520 1944012 1697010 1455174
86%
CF1-3 28,8 2880 1048304 896756 560852
63%
CF1-4 24,1 2410 1154922 984702 621098
63%
CF1-5 33,6 3360 1029622 888630 481548
54%
CF1-6 43,2 4320 1434016 1256504 725858
58%
CF1-7 57,8 5780 1000174 872036 565376
65%
* 1 ml prov undersamplas från CF1 -1 Och CF1-2 efter den första hypotonisk lys steg (Steg 3.1.5) innan den andra hypotonisk lys förfarande. Cellerna centrifugerades ned enligt beskrivningen i 3.1.7 och gå igenom den återstående protokollet utan några ändringar.
en Obearbetad Illumina läser ur en 2 x 300 bp MiSeq sekvensekörning.
b Läser bedömdes, trimmas, och tas bort utifrån kvalitet och långa i diskussionen.

Tabell 2:. Kännetecken för microbiomes genereras från sputumprover använder presenterade arbetsflöde DNA Koncentrationen av varje prov i 100 pl elueringsbuffert (5 mM Tris / HCl, pH 8,5) och egenskaperna hos sekvensdata presenteras. Totalt 1 ng användes för att generera individuella bibliotek använder NextEra XT biblioteket förberedelse kit.

0 "fo: keep-together.within-page =" always "> Prov CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Behandling Inget Ribo-Zero Inget Ribo-Zero Inget Ribo-Zero Inget Ribo-Zero Förbehandlade läser 2088 1991 40876 25238 19728 32737 31791 36172 Medelvärde läslängd 275 245 262 270 233 259 240 267 Totalt rRNA läser 1737 91 29499 17267 5285 291 16371 1761 83,20% 4,60% 72.20% 68,40% 26,80% 0,90% 51,50% 4,90% Mikrobiell rRNA 1414 32 19978 12035 23 227 6916 1076 67,70% 1,60% 48,90% 47,70% 0,10% 0,70% 21,80% 3,00% Eukaryota rRNA 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15,50% 3,00% 23,30% 20,70% 26,70% 0,20% 29,70% 1,90% % RRNA avlägsnas * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% Icke-rRNA läser 351 (16,8%) 1900 (95,4%) 11.377 (27,8%) 7971 (31,6%) 14443 (73,2%) 32446 (99,1%) 15420 (48,5%) 34411 (95,1%) Totala NR träffar 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3327 (8,1%) 2857 (11,3%) 4938 (25,0%) 10751 (32,8%) 5905 (18,6%) 15766 (43,6%) Eukaryot 74 407 2790 2524 4614 10227 4553 8274 Bakteriell 26 283 520 312 287 471 1326 7442 Unassigned läser 249 (11,9%) 1209 (60,7%) 8050 (19,7%) 5114 (20,3%) 9505 (48,2%) 21695 (66,3%) 9515 (29,9%) 18645 (51,5%) * Mängden rRNA avlägsnade uttryckt i procent av den mängd som är närvarande i den icke-utarmade alikvot.

Tabell 3:. Biblioteks egenskaper metatranscriptomes med och utan rRNA utarmning Datan heras från Lim et al (2012) 9, som har ytterligare jämförelse av andra rRNA borttagning kit och effekten av cDNA nebulisering före beredning sekvense bibliotek..

Discussion

Virala metagenomiken

Viruspartiklar är koncentrerade använder polyetylenglykol (PEG) utfällning eller små volym koncentratorer. I vissa fall kan koncentrationen inte behövas, men pre-filtrering eller låghastighetscentrifugering steg används för att avlägsna eukaryota och mikrobiella celler. Viral lysat kommer ytterligare berikas och renas med hjälp av densitetsgradient ultracentrifuge 9,41 eller mindre storlek filter (t.ex. 0,45 pm) för att ta bort eukaryota och stora mikrobiella celler 25. Densitetsgradient-ultracentrifugering utförs typiskt med täta men inerta lösningar såsom sackaros eller cesium-klorid för att isolera och koncentrera virala partiklar 41. Fysisk separering är baserad på storleken och flytdensitet av virala partiklar. Därför lämpligt val av filter porstorlek och den rigorösa framställning av gradienter är väsentliga för att isolera specifika virala samhällen, eftersom framgången för fysiska återhämtningVLP bestämmer samhället isolerade 41 (dvs viruspartiklar som inte passerar genom filtret eller faller inom utvinning tätheten kommer inte upptäckas i metagenome). Efter viral isolering och koncentration, kan det finnas kontaminerande icke-viralt genomiskt material som är närvarande i provet, både i form av fria nukleinsyror och mikrobiell och eukaryota celler. Därför, är det kritiskt att kontrollera renheten av virala partiklar i prover (figurerna 1A och 1B). En kloroformlösning behandling är vanligen används för att lysera återstående cellerna, följt av nukleasbehandling att nedbryta fria nukleinsyror före nukleinsyra extraktion.

En varning till den presenterade arbetsflödet var användningen av densitetsgradienten separation för att isolera viruspartiklar som det kan utesluta omhöljda viruspartiklar som kan vara för stark för att komma in i CsCl lutning. Ett alternativ "catch-all" metod är att utelämna densitetsgradienten separation och isolera samhället DNA från de 0,45 um - filtrat behandlades med kloroform och DNas I. Detta tillvägagångssätt är också lämpligt att rymma små provvolymer som de från Toppar eller blodplasma. Detta kan dock resultera i kloroform resistenta bakteriekontamination och högre mängd DNas I-resistenta extracellulärt DNA.

Aktuella sekvense protokoll kräver 1 ng till 1 pg av nukleinsyror för förberedelse sekvense bibliotek vari högre DNA avkastning ger ett större utbud av sekvense alternativ. Den DNA-koncentration av genererade viromes varierar ofta från under detektionsgränsen till mer än 200 ng / l. Mängden av virala nukleinsyror återvunna kan vara otillräckligt för direkt sekvensebiblioteks förberedelser. I sådana fall är nukleinsyraamplifiering väsentlig. Linker förstärknings hagelgevär bibliotek (LASLs) 2,42,43 och hela genomet förstärkning baserad på flera förskjutningsförstärkning (MDA) är de tvåmetoder som används oftast för att generera tillräckligt med DNA för sekvensering. MDA metoder såsom de som baseras på Phi29 DNA-polymeras är kända för att lida av förstärknings fördomar, och kan företrädesvis förstärka ssDNA och cirkulärt DNA, vilket resulterar i icke-kvantitativa taxonomiska och funktionell karakterisering 44,45. En optimerad version av LASLs tillvägagångssätt har visat att införa endast minimala fördomar, främjar högre känslighet (för små mängder av utgångsmaterial), och är lätt anpassas för olika sekvense plattformar 43. Emellertid har det tillvägagångssätt många steg, kräver specialiserad utrustning för att minimera DNA-förlust, och är begränsad till dsDNA mallar. I vårt laboratorium, har detta tillvägagångssätt varit framgångsrikt anpassat att förstärka detekterbara och omätbara mängd DNA extraherat från bronkoalveolär lavage-, coral- och havsvatten-härledda VLP (opublicerade och et al. Hurwitz 46).

Utveckla dataanalys rörledningar har classically varit en av de mest utmanande aspekterna av viral metagenomik analys på grund av den mycket skiftande och till stor del okända arten av de virala samhällen. Även om det finns uppskattningsvis 10 8 virala genotyper i biosfären hittills nuvarande virusdatabaser innehåller ~ 4000 virala genom, vilket är ungefär 1 / 100.000: i denna ungefärliga totala viral mångfald. Därför likhet baserade sökningar (t.ex. BLAST 47) för taxonomiska och funktionell uppdrag i virus metagenomes besitter inneboende utmaningar. Många sekvenser inte har betydande likheter med genomen i databasen, och därför klassificeras som okända. Även om homologisbaserade sökningar är de viktigaste applikationer för att tilldela taxonomi och funktion för att sekvensdata, har alternativa metoder baserade på databas-oberoende analys utvecklats 48- 50. Fancello et al., 51 ger en fullständig översyn av beräkningsverktyg och algoritmer som används i viral metagenomiken.

Mikrobiell metagenomiken

Typiskt, den totala mängden DNA som extraherats från hypotona lys behandlade mikrobiella samhällen (HL-DNA) sträcker sig från 20 ng till 5 mikrogram. Utbytet är i hög grad beroende på patientens hälsotillstånd och mängden upphostningsprov uppsamlades, vilket förklarar variationerna som ses i det totala utbytet av HL-DNA som extraherats i denna studie (tabell 2). De kritiska steg att generera sekvensdata av god kvalitet är beroende av kvaliteten på sekvensebibliotek genereras. Figur 2 visar en typisk storleksintervall för sekvense biblioteken genererade från CF slem-härledda mikrobiell DNA med hjälp av en enzymatisk-baserad DNA fragmentering förfarande. Den optimala biblioteksstorleken beror på valet av sekvense plattform och tillämpning, och därför kan det fragmenteförfarandet optimeras, om nödvändigt, genom alternativa metoder såsom ultraljudsbehandling och nebulisering. Förutomde presenterade representativa resultat, är framgången för den presenterade metoden på CF slem samlas in från flera patienter över flera tidpunkter illustreras också i Lim et al. (2012) 9 och Lim et al. (2014) 10.

Tidigare studier 9,10 tyder på att varje patient hyser en unik uppsättning av mikrobiell gemenskap som skiftar över tiden, vilket återspeglar uthållighet av de större aktörerna i samhället medan fluktuationer är sannolikt på grund av störningar såsom antibiotikabehandlingar. Huruvida dessa fluktuationer sker dagligen även utan yttre störningar eller på grund av provtagningsförfarandet och provbearbetning, är fortfarande i fråga. Baserat på HL-DNA metagenomic och 16S rDNA amplikon analys, visar 7-dagars längd provtagning att den dagliga fluktuationer i mikrobiella profiler utan antibiotika störning (Dag 1, 2, och 3) var minimala (Figur 3A och 3B). Upon introproduktion av orala antibiotika direkt efter Dag 3 provtagning, förändringar i samhället profilen blev uppenbart på dag 4. Medan antibiotikumet ciprofloxacin riktar ett brett spektrum av kända bakteriella patogener såsom P. aeruginosa, Staphylococcus aureus och Streptococcus pneumonia, ökade behandlingen den relativa förekomsten av P. aeruginosa samtidigt minska Streptococcus spp. och P. melaninogenica. Genom Dag 6, samhället återhämtade långsamt till den ursprungliga startsamhällsstruktur. Resultaten tyder på att fluktuationer i mikrobiella profiler inom en enda patient är mer sannolikt på grund av samhälls störningar i luftvägarna.

Med tanke på överensstämmelse mellan de mikrobiella profiler av 16S rDNA bibliotek och metagenomes från HL-härledda DNA, vi uteslutit de fördomar som härrör från 16S rRNA primers som används i denna studie. En möjlig förklaring till skillnaderna ses över 16S rDNA taxonomiskal-profiler som genereras från total DNA och HL-härledda DNA (Figur 3B) kan vara förekomsten av höga halter av Pseudomonas spp. extracellulärt DNA efter antibiotikabehandling. Detta stöds av resultaten att dessa skillnader var mest uppenbara vid Dag 7, tre dagar efter antibiotikabehandling, som riktar Pseudomonas spp. utöver andra. Ciprofloxacin används ofta som den första linjens behandling av patienter med CF och kronisk P. aeruginosa-infektion även om dess aktivitetsspektrum omfattar de flesta CF-associerade patogener. Vi antog att den antibiotikabehandling utrotar mottagliga samhällen inklusive Streptococcus spp. och därmed skapa en nisch fylld av resistenta P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kan få motståndet genom att öka sina biofilm samhällen och extracellulärt DNA har visat sig vara den viktigaste strukturella stöd för sin biofilm arkitektur 52. Även som tHan återhämtade samhällsstrukturen, extracellulärt DNA kan ha kvar i CF slem. Därför är dessa data tyder på att hypoton lysering och tvättsteg som presenteras i detta arbetsflöde potentiellt gynnas inte bara ta bort DNA humanhärrörande, men också mikrobiell härledda extracellulärt DNA som kan förvränga den verkliga mikrobiella profilerna.

Metatranscriptomics

En hög kvalitet metatranscriptome bör innehålla relativt få ribosom RNA (rRNA) sekvenser och representerar en opartisk provtagning av de gemensamma avskrifter (mRNA). På grund av den korta halveringstiden och begränsad mängd mRNA, är det viktigt att protokollet, som presenteras här, minimerar provhantering för att maximera antalet utskrifter återvunna.

Under senare år har flera metoder för rRNA utarmning utvecklats och anpassats i kommersiellt tillgängliga kit. Dessa inkluderar Microb Enrich, Ribo-Zero, och prov specifik subtraktiv hybridizations 53 som är baserade på oligonukleotidhybridisering, och mRNA-ONLY kit som bygger på exonukleas enzymatisk aktivitet targeting RNA innehållande en 5 'monofosfat. Dessutom har flera metoder för mRNA anrik såsom MessageAmp II-Bakterier Kit som företrädesvis polyadenylates och förstärker linjärt RNA finns också. Vissa av dessa metoder (t.ex. mRNA-ONLY, Microb E xpress och MessageAmp) används samtidigt för optimal effektivitet. Men effekten av alla dessa metoder begränsad, speciellt vid arbete med delvis försämrad rRNA, som ofta observeras i totalt RNA extraherat från CF prover. Polyadenylering-beroende RNA-amplifiering kan inte användas för att generera metatranscriptomes bestående av både eukaryot och prokaryot mRNA. Dessutom, poly (A) svansen sattes till sekvenserna får reducerar mängden användbara sekvensdata. Regioner med homo sträckor tenderar att ha lägre kvalitetsresultat, causing ett betydande antal läser som ska filtreras genom sekvensering och eftersekvense mjukvara, och den genomsnittliga nyttjande lästa längd efter trimning av poly (A) svansar kommer att minska avsevärt 54.

Att handskas med komplexa CF mikrobiella samhällen och delvis försämrat RNA (figur 4A och 4C), visade vår tidigare studie att hybridisering-fångstmetod av Ribo-Zero Gold kit var effektivare i att ta bort både mänskliga och mikrobiell rRNA jämfört med de kombinerar behandlingar med andra kit 9 (tabell 3). Den resulte uppgifter möjliggör samtidig analys av både mänsklig värd och mikrobiella avskrifter. Beroende på avkastning och kvalitet av RNA, liksom ultimata valet av sekvense plattform, många av dessa processer, inklusive cDNA syntessteget kan effektiviseras med sekvensebiblioteksgenerering. Till exempel kan Ribo-Zero behandlat RNA användas för att göra metatranscriptome sekvense librarier använder ScriptSeq RNA-Seq Library Förberedelser kit.

Metagenomic analys av djurrelaterade samhällen ger en övergripande presentation av det övergripande funktionell enhet som innehåller värden och dess tillhörande samhällen. Arbetsflödet som presenteras här är anpassningsbara till en mängd komplexa djurassocierade prover, speciellt de som innehåller tjockt slem, höga mängder av celldebris, extracellulär DNA, protein och glykoprotein-komplex, såväl som värdceller i tillägg till den önskade virala och mikrobiella partiklar. Även om virala och mikrobiella partiklar kan förloras vid varje steg, partiklar isolering och rening är viktigt att minimera mängden av värd-DNA. Medan uppgifterna metagenomik ger metabola potentialer hos de undersökta samhällen, metatranscriptomics komplettera detta genom att avslöja differentialuttryck av kodade funktioner 9. En omfattande utvärdering av genomik och avskrifter data har gett nya insights till dynamiken i samhällsinteraktioner och underlättar utvecklingen av förbättrade terapier 9,10,55.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) delas Forest Rohwer. Vi tackar Epicentrum, ett Illumina bolag för att ge tidig tillgång till Ribo-Zero Epidemiologi kit. Vi tackar Mark Hatay för design och produktion av ultracentrifugeröret innehavaren. Vi tackar Andreas Haas och Benjamin Knowles för kritiska läsningar och diskussioner av manuskriptet, och Lauren Paul för att bistå filmandet processen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65, (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10, (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184, (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7, (10), e47305 (2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245, (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40, (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7, (9), e45001 (2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12, (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52, (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38, (22), e200 (2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23, (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87, (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3, (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67, (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67, (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23, (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2, (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67, (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4, (10), e7370 (2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1, (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2, (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12, (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8, (3), e58404 (2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56, (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44, (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, Forthcoming.
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27, (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6, (3), e17288 (2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9, (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9, (1), 386 (2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189, (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339, (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8, (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8, (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27, (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28, (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29, (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4, (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5, (2), e9083 (2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14, (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7, (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -H., Bae, J. -W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77, (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15, (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6, (1), 41 (2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5, (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28, (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434, (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59, (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4, (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8, (5), e64285 (2013).

Comments

5 Comments

  1. Hi, when generating the microbial metagenome: are you sure you are using DNase I at 1,000 U/µl concentration?

    I think it must be 1,000 U/ml instead of 1,000 U/µl

    Thanks in advance,
    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 16, 2015 - 6:42 AM
  2. Hi Galo,

    Yes to your question. We are using extremely high concentration of the DNase I (1000U/µl) to ensure all extracellular DNA are digested while not adding too much volume to the sample. The amount of extracellular DNA in CF sputum is high. If you were to use this protocol for other samples that do not have that much extracellular DNA, you can definitely adjust the amount of DNase I. The high concentration of DNase I can be prepared from the lyophilized DNase I. The catalogue number is in the materials table.

    Please let me know if you have any other questions.

    Yan Wei

    Reply
    Posted by: Yan Wei L.
    September 16, 2015 - 12:53 PM
  3. In that case I think I had to use that high concentrations of DNase since, although I don't work with CF, my samples are sputum too.

    Thank you very much!

    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 17, 2015 - 4:15 AM
  4. Actually I have another question I cannot answer from internet.

    Normally I use DTT in order to liquefy sputum samples. In your paper you use DTT for the viral extraction, but B-mercaptoethanol for the microbial one instead.

    I don't know if it really makes any difference or there is any reason to use one or another in microbial extracion.

    Thanks again,

    Galo

    Reply
    Posted by: Galo G.
    September 17, 2015 - 5:47 AM
  5. Hi Galo,

    Many has tried and used DTT. Our group didn't see any differences. However, since we are modifying the protocol described by Breitenstein et al. (1995) and they used B-mercap, we decided to stick to B-mercap.

    Yan Wei

    Reply
    Posted by: Yan Wei L.
    September 17, 2015 - 12:46 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics