La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

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Bioengineering

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Knight, G. T., Klann, T., McNulty, J. D., Ashton, R. S. Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-µCP) and Sequential Nucleophilic Substitution. J. Vis. Exp. (92), e52186, doi:10.3791/52186 (2014).

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Abstract

Introduction

La capacidad de las superficies injertados con PEG para mostrar ligandos bioquímicos covalentemente unidos, manteniendo al mismo tiempo inherentes propiedades no-fouling ellos una opción ideal para entornos de ingeniería de microescala personalizados sobre sustratos de cultivo 1,2,3 hacer. Las interacciones bioespecíficas mediados por ligando conjugado de PEG cepillos permite el análisis reduccionista de los efectos de señales bioquímicas que se encuentran dentro del complejo en microambientes de tejido in vivo en fenotipos de células individuales. Además, las químicas "clic" bio-ortogonales se pueden utilizar para facilitar la inmovilización de ligandos direccional de modo que se presentan en conformaciones nativas 4-6. Por lo tanto, el patrón espacial microescala de PEG cepillos es una herramienta versátil para crear diseñador en nichos vitro para investigar la señalización celular inducida por señales bioquímicas inmovilizados 6,7.

Un método común para la generación de patrones espaciales de cu bioquímicaES conlleva sustratos recubiertas de oro (μCP) de impresión por microcontacto con patrones de PEG alcanotioles conjugados. Entonces, las monocapas auto-ensambladas (SAMs) micropatterned de alcanotioles ylated-PEG restringe la adsorción física de las moléculas bioquímicas, por ejemplo, proteínas, sólo para regiones no modelada del sustrato 8,9. Sin embargo, las SAMs generados por esta técnica son sensibles a la oxidación en medios de cultivo celular a largo plazo. Por lo tanto, μCP'd alcanotiol SAMs son a menudo más injerta con cepillos de polímero de PEG mediante transferencia atómica iniciada por superficie polimerización radical (SI-ATRP) para aumentar la estabilidad 10 no ensuciamiento de la región. Específicamente, μCP del iniciador de polimerización alcanotiol, bromoisobutirato ω-meraptoundecyl, sobre superficies recubiertas de oro seguido por SI-ATRP de poli (etilenglicol) metacrilato de metilo éter (PEGMEMA) monómeros genera superficies con microestructurada a largo plazo, estable, y no ensuciamiento PEG cepillos. Además, estos son capaces de ser modificados aún más para presentar restos diversa químicos 11.

Aprovechando esta propiedad, Sha et. al. desarrollado un método para diseñar sustratos de cultivo con cepillos PEGMEMA multicomponentes que presentan ortogonales químicas "clic". En este método, que utilizan una serie de pasos μCP / SI-ATRP intercalados con azida de sodio secuencial, etanolamina, y propargilamina sustituciones nucleófilas para crear sustratos de cultivo a microescala que presentan patrones de múltiples ligandos inmovilizados 6. Mientras que el potencial del uso de tales químicos en conjunción con μCP manual para diseñar nuevos sustratos de cultivo es inmenso, que está limitado por la precisión y la exactitud con la que múltiples pasos μCP se pueden alinear en un único sustrato. Un alto nivel de precisión y exactitud estaría obligado a fabricar de forma reproducible complejo en nichos in vitro utilizando estas técnicas versátiles.

e_content "> Para hacer frente a esta limitación, se han generado varios sistemas automatizados μCP y semi-automatizado. Chakra et. al. desarrollado un sistema en el que μCP sellos personalizados se colocan en un sistema ferroviario y ponen en contacto conforme con diapositivas recubiertas de oro que utilizan un accionador neumático controlado por ordenador. Sin embargo, este método requiere la fabricación precisa de sello diseños personalizados e informa de una precisión de 10 micras con ningún informe de la precisión alcanzada cuando se realizan múltiples pasos μCP 12. Más recientemente, un método que utiliza un sistema de acoplamiento cinemático integrada precisión reportada por debajo de 1 m utilizando un único patrón, pero no fueron capaces de alinear con precisión múltiples patrones debido a la falta de un control preciso de las características sello de molde para moldear 13. Además, ambos de los métodos anteriores requieren el sustrato para permanecer fijo entre los pasos de modelado , lo que limita significativamente la diversidad de químicas de modificación de la superficie que pueden serutilizado. A continuación, describimos un sistema R-μCP automatizado capaz de alineamiento exacto y preciso de múltiples pasos μCP al tiempo que permite la máxima flexibilidad en el diseño del sello y de la fabricación. Además, los sustratos estructurados pueden eliminarse repetidamente desde el sistema entre estampados, permitiendo así el uso de diversas composiciones químicas de modificación de sustrato, incluyendo las sustituciones nucleófilas secuenciales. Sustratos de ingeniería uso de tales químicos han sido utilizados para el cultivo celular previamente por tanto nos 6,14 7 y otros. Por lo tanto, hemos fusionado R-μCP y reacciones de sustitución nucleófila secuenciales para desarrollar un método para la fabricación escalable de sustratos de cultivo con señales bioquímicas complejas y micropatterned.

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Protocol

1. Generación de Sellos elastoméricos

  1. Para generar maestros de silicio de la estampillas PDMS, diseñar patrones de características de la fotomáscara el uso de software de diseño asistido por ordenador.
    1. Diseñar el primer patrón como una matriz de 20 x 20 de los anillos con 300 m de diámetro interior (ID) y 600 OD m con 1.200 m separación de centro a centro.
    2. Diseñar el segundo patrón como una matriz de 20 x 20 con anillos de 600 micras ID y OD 900 m con 1200 micras separación de centro a centro.
    3. Además, colocar 1 x 1 mm 2 marcas de referencia cuadrados en las cuatro esquinas de cada gama de diseño espaciados 1.200 m de centro a centro del patrón de esquina en un ángulo de 45 °.
    4. Fabricar los maestros de silicio para su uso en este experimento con 1: 1 relaciones de aspecto, correlacionando a una profundidad característica de 300 micras usando técnicas de litografía estándar detallados en otra parte 15 o en colaboración con una fundición de microfluidos.
      NOTA: Característica profundidades inferiores a 100 micras pueden conducir a la deformación anormal de sellos antes de ponerse en contacto con superficies de sustrato.
      NOTA: Este protocolo comienza con tener maestros de silicio ya obtenidos con los patrones descritos de resina fotosensible, lo que requiere equipo especializado y habitaciones limpias para crear. Lo mejor es consultar con una instalación de fabricante o núcleo para crear estos maestros estampados.
  2. Maestros de silicio silanizar O / N de incubación con (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapor de triclorosilano.
    NOTA: Silano vapor es altamente tóxico y sólo debe ser manejado en una campana de humos química.
  3. Crear réplicas inversa de los maestros de silicio por la curación de una proporción de 10: 1 de PDMS pre-polímero y agente de PDMS en la parte superior de los maestros de silicio silanizadas curado en un plato de Petri S / N a 60 ° C.
  4. Retire los sellos de PDMS de los maestros de silicio, y unir los sellos a acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) soportes o cualquier otro material rígidos mediante pegamento.
    NOTA: El material de elección no tiene que ser transparente o biocompatible. Sin embargo, debe proporcionar una superficie plana para la interfaz con el utillaje robótico y una mayor rigidez que PDMS.

2. Preparación de cubreobjetos

  1. Cubreobjetos de microscopio de enjuague (24 mm x 50 mm # 1) en tolueno, metanol y se somete a ultrasonidos en acetona durante 1 min antes de enjuagar con etanol y secado bajo una corriente suave de nitrógeno.
    NOTA: Manejar tolueno y acetona sólo en una campana de humos química.
  2. Cubreobjetos Coat con ~ 3.5 nm de titanio (Ti), seguido de 18,0 nm de oro (Au) usando un evaporador de haz de electrones focalizado.
    NOTA: Este procedimiento es compatible con una variedad de sustratos recubiertos de oro como el silicio y el poliestireno. Mientras que es posible para generar estos en el sitio, los sustratos recubiertos de oro también están disponibles a través de proveedores comerciales.
    NOTA: Las capas de Ti debe ser al menos de 3 nm de espesor, mientras que las capas de Au sobre sustratos deben ser unt menos 5 nm de espesor y puede oscilar hasta el final a 1 mm de espesor dependiendo de las propiedades ópticas ideales del sustrato final 16,17. Sustratos no están obligados a ser ópticamente claro para la fabricación; sin embargo, se facilita el análisis microscópico de sustratos fabricados.
  3. Enjuague cubreobjetos recubiertos de oro con etanol y se seca bajo nitrógeno suave inmediatamente antes del uso.

3. R-μCP de externo del anillo

  1. Antes de la I-μCP con el sistema de forma selectiva conforme brazo robot articulado (SCARA), calibrar los efectores de herramientas robóticos y sistemas de doble cámara de acompañamiento utilizando el software del sistema.
    NOTA: Estos implementos se representan en la Figura 1.

Figura 1
Figura 1. Sistema μCP R y Brazo robótico de herramientas. (A) vista a gran escala de sistema R-μCP con todas las herramientas y accesorios, (a) de la tirada de vacío, (b) Baño de reactivo, (c) hacia abajo de la cámara, (d) fijación de anidación sello, (e) robótica herramienta. (B) Herramientas robóticas Robótica que representa (f) herramienta de grabado con punta de diamante y (g) la herramienta de succión neumática celebración de una (h) ABS respaldados por el sello PDMS.

  1. Colocar manualmente un sello PDMS con 600 ID micras y 900 micras OD sobresale anillos boca abajo en el accesorio de anidación sello. Colocar manualmente un coverslide recubierto de oro recién limpiada en la parte superior del mandril de vacío, que se muestra en la Figura 1A, e inmovilizarlo utilizando el vacío de laboratorio conectado.
  2. Uso de los controles de robot, alinear la cámara que mira hacia abajo sobre el punto de centro de la coverslide recubierto de oro, como en la Figura 2A.
    NOTA: Este punto inicialmente se puede definir mediante una inspección visual y no requiere de una gran precisión, ya que el sello de PDMS es mucho larger que el portaobjetos recubierto de oro.
  3. Instruya al brazo robótico para grabar cuatro de referencia "X" marcas en los vértices de un cuadrado con dimensiones de 3,8 mm por 3,8 mm se centraron en la coverslide recubierto de oro con la función de grabado con punta de diamante unido al brazo robótico. (Representado en la figura 2B; proceso automatizado)
    NOTA: Esto asegura las cuatro marcas de referencia están dentro de un marco visual de la cámara hacia abajo.
  4. El uso de los robots de herramientas de succión neumática, pick-up y sostienen el PDMS sello 1 mm por encima del accesorio de anidación sello como en la figura 2C. (Proceso automatizado)
  5. Uso de la cámara que mira hacia arriba y anillo de iluminación LED en la foto en la Figura 2D y E, visualizar marcas de referencia la plaza de la estampillas e identificarlas con el software de la cámara 10 veces con el fin de determinar X promedio del sello, Y y angular desplazamiento desde el centro de la eje de mecanizado del robot. (Proceso automatizado)
  6. Como en NOTA: Un cálculo interno se lleva a cabo por el software del sistema robótico para alinear con precisión el cubreobjetos de X, Y y ubicaciones de los centros compensaciones angulares en los futuros pasos R-μCP de sello y.
  7. 3.8) Coloque el sello en un baño de alcanotiol iniciador de ATRP, bromoisobutirato ω-mercaptoundecyl (2 mM en etanol) como se muestra en la Figura 2F. (Proceso automatizado)
  8. Retire el sello de la solución alcanotiol y colóquelo sobre una corriente de nitrógeno presurizado a 0,48 bar (5 psi) para evaporar el etanol como en la figura 2G. Después de 1 min aumentar la presión de la corriente de nitrógeno es de 1,03 bar (15 psi) para asegurar la sequedad uniforme. (Proceso automatizado)
    NOTA: secado incompleta dará lugar a la pérdida total o parcial del patrón de fidelidad.
  9. Después del secado, mover el sello sobre la posición del centro calculado de la diapositiva recubierto de oro y lo baja a 100 micras incrementos mientras se controla la fuerza del motor del eje Z como se representa en la figura 2H.
    NOTA: Este es comunicada como par experimentado por el motor del eje Z y que se muestra en el software de guiado de robots. (Proceso automatizado)
  10. Detener la reducción del sello una vez que se ha alcanzado la presión predeterminada de 79,2 kPa, y mantener contacto con el portaobjetos recubierto de oro durante 15 s. (Proceso automatizado)
    NOTA: Los valores de la presión aquí están optimizados para la altura de diseño de sellos y función actual. Si el diseño del sello se cambia, específicamente para sellos de alta relación de aspecto, sintonizar estos en consecuencia de un proceso de ensayo y error.
  11. Retire lentamente el sello de la diapositiva recubierto de oro y colocar el sello de nuevo en el partido de anidación sello. (Proceso automatizado)
  12. 4. SI-ATRP de PEGMEMA en micropatterned cubreobjetos

    1. Suelte la presión de vacío que sostiene la coverslide microestructurada, y transferirla a un matraz Schlenk de 50 ml. Seal y desgasificar el matraz Schlenk utilizando una bomba de vacío.
    2. Añadir 5,5 ml de mezcla de reacción que contiene el macromonómero ATRP PEGMEMA (208,75 mmol), agua (34,4 ml), metanol (43,8 ml), cobre (II) bromuro de (1 mmol), y 2 ', 2-bipiridina (3 mmol) de el matraz de Schlenk.
    3. Añadir 0,5 ml de ascorbato L-sodio (454,3 mM) en agua para iniciar la reacción, y permita que se continúe durante 16 horas a temperatura ambiente en atmósfera de gas inerte.
      NOTA: Después de la adición de ascorbato L-sodio, color de la reacción se desplazará desde el verde claro al marrón oscuro, como se muestra en la Figura 3A-B.
      NOTA: La reacción puede continuar más allá de 16 horas, pero no va a aumentar de manera significativa la duración de los cepillos de PEG.

    Figura 3. Inicio de SI-ATRP. (A) Iniciación de la reacción y (B) posterior cambio de color después de la adición de ascorbato de L-sodio. Imagen (C) Microscopio de superficie coverslide microestructurada siguiente procedimiento SI-ATRP. Barra de escala 1 mm.

    1. Retire la coverslide microestructurada del matraz Schenk y enjuagar con etanol, agua, y etanol y se seca bajo una corriente suave de nitrógeno.
      NOTA: Después de SI-ATRP, modificaciones de la superficie debe ser visible para el ojo y puede ser fotografiado y analizado bajo un microscopio como en la Figura 3C.
      NOTA: Este es el método más simple para probar la precisión del ensayo, ya que evita la necesidad de inmunotinción los sustratos.

    5. La funcionalización azida de Cadenas micropatterned PEGMEMA

    1. Coloque el coverslide microestructurada en un vial de 20 ml de reacción de vidrio.
    2. Añadir 6 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) que contiene 100 mM de azida de sodio al vial de reacción. Mantener esta reacción a 37 ° C durante 24 hr.
      NOTA: Manejar DMF sólo en una campana de humos química. Tenga precaución al pesando azida de sodio.
    3. Al terminar, quitar el coverslide microestructurada del vial de reacción y enjuagar con etanol y después agua y se seca bajo una corriente de nitrógeno.

    6. La pasivación de Cadenas bromo funcionalizado PEGMEMA

    1. Coloque coverslide micropatterned en 20 ml viales de reacción de vidrio.
    2. Añadir 6 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) que contiene etanolamina 100 mM y trietilamina 300 mM al vial de reacción. Mantenga esta reacción a 40 ° C durante 24 horas.
      NOTA: Manejar DMSO, etanolamina, trietilamina y sólo en una campana de humos química.
    3. Al finalizar eliminar el coversl microestructuradaide desde el vial de reacción, lavar con etanol y después agua y se seca bajo una corriente de nitrógeno.

    7. R-μCP del anillo interiores y SI-ATRP de PEGMEMA

    1. Llevar a cabo los pasos R-μCP como se describió anteriormente en los pasos 3.2 y 3.6 a 3.12, la sustitución de un sello de PDMS con 300 micras y 600 micras ID anillos OD que sobresale, de manera que los anillos con las características más pequeños se colocan en el interior de los anillos previamente micropatterned.
      NOTA: El umbral de presión para este sello es 132,0 kPa. Como se mencionó anteriormente, estos ajustes de presión están optimizados para las características de cupones se utilizan en este experimento.
    2. Llevar a cabo los pasos SI-ATRP como se ha descrito anteriormente en los pasos 4.1 a 4.4.

    8. El acetileno funcionalización de Cadenas micropatterned PEGMEMA

    1. Coloque coverslide microestructurada en un vial de 20 ml de reacción de vidrio.
    2. Añadir 6 ml de DMSO que contiene 100 mMpropargilamina al vial de reacción. Mantener esta reacción a TA durante 24 h.
      NOTA: Manejar DMSO y propargilamina sólo en una campana de humos química.
    3. Al finalizar eliminar el coverslide microestructurada del vial de reacción y enjuagar con etanol y después agua y se seca bajo una corriente de nitrógeno.

    9. Cobre catalizada "Haga clic en" Biotinilación de acetileno Terminado Cadenas PEGMEMA

    1. Coloque coverslide microestructurada en un vial de 20 ml de reacción de vidrio.
    2. Añadir 6 ml de sulfato de cobre (15 mM) / Tris [(1-bencil-1 H -1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v de agua / DMF) que contiene 562 mM de azida-PEG 4-biotina conjugado al vial de reacción. Añadir 1,2 ml de ácido L-ascórbico (0,15 mM) en agua a la mezcla para inicializar la reacción.
    3. Burbujear nitrógeno a través de la solución de reacción durante 10 seg, sellar el vial con Parafilm, y hacer reaccionar durante 24 horas a RT.
    4. Al completion eliminar coverslide microestructurada del vial de reacción, enjuague con agua y colocarlo en una placa de poliestireno de 12 pocillos.

    10. Detección de inmunofluorescencia de Biotinylated acetileno Grupos

    1. Bloquear coverslide microestructurada en DPBS (3% burro suero) durante 1 hora a RT. Mancha para grupos de acetileno biotinilados con estreptavidina-546 conjugado (2 mg / ml) en los subproductos de desinfección (3% burro suero en PBS) durante 2 horas a RT.
    2. Enjuague coverslide microestructurada 5 veces con DPBS durante 10 min con agitación suave.
      NOTA: La Figura 4B representa una imagen de la corredera después de que se ha completado este paso.

    11. Cobre-libre "Haga clic en" Biotinilación de azida Terminado Cadenas PEGMEMA

    NOTA: Si se desea, esta etapa de modificación del sustrato se puede realizar in situ durante el cultivo celular.

    1. Deja coverslide microestructurada en 12 pocillos pplato olystyrene siguiente DBPs enjuaga.
    2. Añadir 2 ml de DBP (o medios de cultivo celular) que contiene 20 mM DBCO-PEG 4-biotina, y permitir que esta reacción continúe durante 24 horas a temperatura ambiente (oa 37 ° C en una incubadora).
    3. Al terminar, enjuague coverslide microestructurada 5 veces con DPBS (o, simplemente, realizar un cambio de los medios de comunicación).

    12. Detección de inmunofluorescencia de Biotinylated azida Grupos

    1. Mancha para grupos azida biotinilados con estreptavidina-488 conjugado (2 mg / ml) en 2 ml de DPBS (3% burro suero) durante 2 horas a RT.
    2. Enjuague coverslide microestructurada 5 veces en DPBS durante 10 min con agitación suave.
    3. Imagen micropatterned coverslide utilizando microscopio de fluorescencia confocal. Figura 4A-C representa las imágenes de la diapositiva después de que se complete este paso.
      NOTA: Cuando se utiliza sustratos para ensayos de cultivo de tejidos, omita las secciones 10 y 12 del presente protocolo. Después de la deseada degree de funcionalización, esterilizar el coverslide ingeniería enjuagando ambos lados con etanol al 100% y secado bajo una corriente de nitrógeno. Transferir el portaobjetos a una cabina de seguridad biológica estéril y enjuague el portaobjetos con PBS cinco veces antes de proceder a la siembra y cultivo de células.

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Representative Results

El uso de técnicas μCP alineación manuales para diseñar sustratos de cultivo con matrices de cepillos injertados con PEG funcionalizados con ortogonal "clic" químicas se ha demostrado en trabajos previos 6. Sin embargo, esto ofrece un control mínimo de la orientación de patrón y, a menudo resulta en superposición de áreas funcionalizados. Aquí, un novedoso sistema R-μCP se utiliza para superar esta limitación, y su capacidad de precisión patrón de una matriz de PEG cepillo de anillos con 300 micras y 600 micras ID OD presentar grupos alquino terminal dentro de una matriz separada de PEG cepillo de anillos con 600 micras Identificación y 900 micras OD presentando grupos azida terminales se demuestra 14. Después de la reacción de alquino presentar PEG cepillos con azida de PEG-3-biotina y la reacción de azida de presentación de PEG cepillos con DBCO PEG-4-biotina, el sustrato se inmunotiñó con sondas fluorescentes y fotografiado usando un microscopio confocal (Figura 4). El análisis de estas imágenes usando un programa personalizado MATLAB calculado que las dos matrices de cepillo de PEG fueron alineadas con exactitud sub-10 micras, es decir, X ~ 6,4 m, Y ~ 1,7 m, y θ ~ 0,02 °, que está en el fabricante del citado límite de nuestro modelo SCARA (es decir, ~ 10 micras) e indicativo del desempeño previo del sistema R-μCP 14. Por lo tanto, creemos que el uso de SCARAs de gama más alta en este sistema proporcionaría incluso menor, la resolución de sub-micras. Estos resultados demuestran las capacidades de ingeniería sustrato versátiles habilitados por el uso combinado del sistema R-μCP y reacciones de sustitución nucleófila secuenciales. La reactividad cruzada mínima evidenciado por el marcaje fluorescente de la química de superficie ortogonales sirve para ilustrar el potencial de este sistema para la inmovilización precisa de señales bioquímicas para generar sustratos de cultivo complejos para aplicaciones de ingeniería de tejidos. </ P>

Figura 2
Figura 2. Esquema de Proceso R- μCP. (A) hacia la cámara hacia abajo visualizar diapositivas recubierto de oro inmovilizado, marcas (B) de referencia de grabado en coverslide recubierto de oro, (c) eliminar sello PDMS del accesorio de anidación sello, (D - E) visualización de marcas de referencia de sello PDMS con hacia arriba de la cámara , (F) la colocación de sello de PDMS en alcanotiol baño de iniciador, (G) de secado alcanotiol iniciador disolvente sobre las corrientes de nitrógeno, y (H) de estampado alcanotiol recubierto sello de PDMS en coverslide recubierto de oro.

Figura 4
Figura 4. inmunotiñeron Imágenes de micropatterned diapositiva. (A) de azida y (B) grupos alquino, biotinilado utilizando clic química libre de cobre y cobre mediada, y se detectó con estreptavidina-488 y -546 respectivamente. (C) Superposición de los dos canales fluorescentes. Todo escala Barras 500 micras.

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Discussion

Sustratos ideales para la ingeniería de tejidos se recapitulan Bioinspirada y por lo tanto la distribución espacial de los ligandos bioactivos críticos que se encuentran dentro de los tejidos nativos. Ellos también poseer propiedades dinámicas que permiten ajustes temporales de los ligandos y los patrones espaciales en el que se presentan para permitir la morfogénesis de tejidos dirigida y espacialmente restringidas inducción de destino de la célula. La fabricación de este tipo de sustratos requiere la inmovilización de múltiples señales bioquímicas en orientaciones complejas y altamente ordenadas sobre sustratos. Mientras que la simulación de todos los factores endógenos de nicho de una célula in vitro no es razonable, el sistema R-μCP aquí descrito permite la inmovilización de múltiples regiones de químicas bioactivas ortogonales con control de microescala de la orientación espacial.

La utilidad de estos sustratos se incrementa aún más cuando se considera que, si bien las matrices de cepillo de PEG unido con ligandos inmovilizadospuede provocar interacciones bioespecíficas, cepillos de PEG no unidos permanecen resistentes a la adsorción de proteínas y por lo tanto pueden servir para controlar la adhesión celular y la migración. Aunque pasiva de adsorción, microestructurada de la matriz extracelular (ECM), las proteínas o conjugados de polímero de PEG es un método más simple para el control de la adhesión celular y la migración, estas técnicas sólo proporcionan un control transitorio como la adsorción es un proceso reversible 11. Además, las moléculas se adsorben a las superficies en orientaciones impredecibles y en concentraciones aleatorias, limitando así la fidelidad y el control de las interacciones bioespecíficas. Además, los compuestos utilizados típicamente para crear regiones no incrustantes, tales como albúmina de suero bovino o Pluronic F127, no poseen sitios reactivos designados para funcionalización adicional limitando post-adsorción en modificaciones in situ. SAMs de alcanotioles puede ser generada con dichos grupos reactivos para la modificación de la superficie adicional, pero ellos también tienen una durabilidad limitada en cultivo de tejidos Conditiones debido a la falta de blindaje oxidativo ofrecida por injertado PEG cepillos 10,11. Por el contrario, la fusión de nuestras plataformas R-μCP con injerto de PEG-cepillo y reacciones de sustitución nucleófila secuenciales proporciona la capacidad de diseñar sustratos con regiones cytophobic duraderos, a microescala que se pueden modificar a priori o in situ con todas las funciones bio-ortogonal. Esto permitirá un mayor control de las interacciones bioespecíficas que pueden regular en la morfología del tejido in vitro y el crecimiento.

Una fortaleza clave de R-μCP comparación con otros sistemas para alinear impresiones por microcontacto secuenciales es la capacidad de eliminar el sustrato del sistema entre estampados repetidas mientras que todavía mantiene una alta precisión de alineación 12,13. Esto permite una mayor diversidad en los tipos de químicas de superficie que se pueden aplicar, y la duración de reacciones de modificación de la superficie se puede variar para ajustar las densidades de im posteriormenteligandos movilizados 6. Por lo tanto, R-μCP se puede utilizar para establecer gradientes de concentración de actividad en las señales bioquímicas que median las interacciones bioespecíficas 14. Con la capacidad de controlar con precisión tanto la ubicación y el grado de interacción bioespecíficas, el sistema R-μCP ofrece un método único para la investigación de los roles de los ligandos bioactivos en la morfogénesis de tejidos y establece un sistema robusto para la generación de sustratos de cultivo que simulan la presentación de señales biológicas en el nicho en vivo.

Un aspecto crítico de nichos celulares, específicamente en el desarrollo, es la modulación espacio-temporal de la señalización de los factores 18. Aunque las señales bioquímicas solubles se pueden añadir al medio de cultivo de una manera temporal definido, no se limita el control espacial sobre el cual las células se encuentran con estas señales. Con el sistema R-μCP descrito aquí, es posible construir los sustratos de cultivo con micropatterned functionaliz terminalesed PEG cepillos presentar grupos funcionales azida que no tienen ningún efecto sobre el destino de las células en cultivo. Mientras que los grupos de azida son capaces de experimentar reacciones de cobre catalizada "clic" con moléculas que presentan alquino, esto no se puede realizar en la presencia de células en cultivo Dada la toxicidad del cobre. Sin embargo, las moléculas de alta tensión como dibenzocyclooctyne (DBCO) se someten a una azida-alquino reacción de cicloadición sin cobre altamente selectivo y biocompatible 19,20. A través de la conjugación de enlazadores que contienen DBCO, sustratos de cultivo micropatterned pueden ser modificadas in situ con nuevos ligandos biológicos 21. Con la capacidad de hacer que las regiones cytophobic cytophilic o añadir diferentes señales bioquímicas para su uso en los procedimientos de señalización de pasos múltiples, sustratos de cultivo generadas con este método tienen nuevas capacidades de adaptación y por lo tanto ofrecen un sistema más robusto para instruir a la morfogénesis de tejidos in vitro.

A pesar de la olla inmensacial y la utilidad de la plataforma R-μCP, tiene ciertos inconvenientes. El uso de numerosos pasos SI-ATRP para generar sustratos injertados con PEG aumenta en gran medida el tiempo de fabricación en comparación con los métodos que implican la impresión de inyección de tinta o deposición de microgotas de las proteínas de ECM. Mientras que la precisión de las técnicas de impresión de inyección de tinta rivaliza con la de la corriente del sistema R-μCP, la adsorción de proteínas ECM es reversible proporcionando de ese modo un menor control de las interacciones proteína-célula. Además, los sustratos generados a través de técnicas de impresión de inyección de tinta no se pueden quitar durante la fabricación, lo cual se impide el uso de diversas composiciones químicas de modificación de sustrato que permitan, por ejemplo, espacialmente restringidas en modificaciones de sustratos situ 22. Debido a estas limitaciones técnicas de inyección de tinta son más adecuados para la rápida generación de sustratos de cultivo principalmente preocupados con corta duración, arreglos estáticos de biomoléculas y tipos de células 23, mientras que el sistema R-μCP es mucho better adecuado hacia la generación de sustratos de múltiples facetas diseñada para exponer a largo plazo, control dinámico sobre ambas interacciones celulares espaciales y temporales en 2D con diversos ligandos biológicos.

La impresión por microcontacto permite la rápida deposición de nano-a microescala 'tinta' cuenta con más de áreas de superficies grandes, pero siempre ha habido una heterogeneidad significativa en la concentración de sustancias 'tinta' depositados. Esta es también una limitación de corriente de la plataforma R-μCP como se puede observar en la Figura 4. Se postula que la heterogeneidad en la modificación fluorescente de la PEG cepillos es debido a la aplicación del robot de una fuerza normal desigual sobre toda el sello PDMS, que También es probable que no perfectamente planas. Esto resulta en una presión de contacto no uniforme entre todas las regiones del sello y del sustrato causando con ello la deposición desigual del iniciador de alcanotiol y posterior espesor del cepillo PEG injertado. EnPara fabricar sustratos injertados con PEG con la deposición uniforme de alcanotioles y de ese modo la funcionalidad de superficie, tendrá que ser optimizado el diseño de la herramienta de estampación para aplicar una fuerza normal distribuida y uniforme sobre toda el sello PDMS. Esto facilitará el contacto uniforme con las diapositivas recubiertas de oro en toda la interfaz independiente de las imperfecciones de sellos. Además, en la Figura 4B, se puede observar una ligera contaminación cruzada de los grupos de acetileno en la azida terminado cepillo de PEG. Mientras que la densidad superficial de ligandos inmovilizados debido a la contaminación cruzada es mínima en comparación a la de la PEG-cepillo prevista, esto se puede reducir a casi cero al aumentar la duración de la reacción de pasivación etanolamina (véase la Sección 6) como se ha demostrado previamente 6.

La principal aplicación del sistema R-μCP se describe aquí es para la fabricación de sustratos de cultivo de tejidos complejos que podrían ser utilizados para ejercer el control espacial y temporal odestino de la célula f. Sin embargo, la alta precisión y exactitud de la plataforma R-μCP hace que sea un método atractivo para otras aplicaciones también. La capacidad de patrón de áreas citofílicos con las químicas del ligando diferenciales seguido por modificación in situ de las regiones previamente inertes, cytophobic permite co-cultivo de múltiples líneas celulares con un estricto control sobre su orientación espacial. Esto, junto con la naturaleza inherente de alto rendimiento de micropatterning presentar una alternativa a los métodos actuales para el cribado de alto rendimiento de ambas células individuales y combinaciones de multi-celda 24. Mientras que el sistema R-μCP tiene un gran potencial en el campo de la biología, sino que también podría ser aplicada al campo de los sistemas microelectromecánicos (MEMS). En la fabricación de MEMS, es deseable para transferir componentes de MEMS con alta precisión y exactitud para la producción masiva. Con nuevas técnicas de estampación cinéticos, el sistema R-μCP aquí descrito podría ser adaptado para imprimir eficazmente Components de silicio o de nitruro de galio sobre obleas de silicio para su uso en la generación de MEMS 25. Por lo tanto, la plataforma R-μCP podría ser utilizado para una amplia gama de aplicaciones potenciales.

En conclusión, el uso del sistema R-μCP para generar PEG injertados a sustratos de cultivo ortogonalmente funcionalizados usando reacciones de sustitución nucleófila secuenciales presenta no sólo una plataforma ideal para el control de la morfología del tejido potencialmente y el crecimiento in vitro, pero un excelente sistema para investigar los papeles de múltiples ligandos bioactivos sobre el destino celular. La capacidad de patrón de múltiples señales bioquímicas en distintos patrones altamente ordenados y establece las bases para la construcción de sustratos de cultivo capaces de instruir a la formación de estructuras de tejido con múltiples tipos de células organizadas en la escala del micrón. Esto, junto con la capacidad de modificar los sustratos micropatterned in situ, podría permitir un control sin precedentes de la morfogénesis de tejidos y cell Destino en la cultura. Las técnicas de modelado descritas aquí proporcionan un sistema versátil para la fabricación de sustratos de cultivo que un día podrían facilitar la producción racional y reproducible de estructuras de tejidos organotípicos in vitro.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SCARA  Epson LS3-401ST Higher end models with increased precision are available if desired. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane Gelest SIT8174.0 CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesive Co NC9020938 Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides Fisher Scientific 48393106 These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator Telemark SEC-600-RAP Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA EPSON LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate Prochimia FT 015-m11-0.2 Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. 
Schlenk Tube Flask 50 ml Synthware 60003-078 Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate Sigma Aldrich 447943 Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS) Fisher Scientific A412-4 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide Sigma Aldrich 437867 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2,2'-Bipyridine Sigma Aldrich D216305 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich A4034
20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-340-4E
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide Sigma Aldrich 227056 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine Sigma Aldrich 398136 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine Sigma Aldrich T0886 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich 276855 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine Sigma Aldrich P50900 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol University of Wisconsin Material Distribution Services 2292 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin ClickChemistryTools AZ104-100 Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate Sigma Aldrich C1297 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich A7506
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190144
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663 Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate Thermo Scientifit - NUNC 07-200-81 Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin Clickchemistytools A105P4-10 Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate Life Technologies S-11223 Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies S-11225 Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope Nikon Nikon Eclipse Ti, A1R An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.

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