सन के पुष्प डुबकी परिवर्तन (

Biology
 

Summary

यहाँ, हम पुष्प डुबकी के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन का उपयोग कर सन परिणत करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए सरल और सस्ता है, फिर भी सन परिवर्तन के लिए वर्तमान में उपलब्ध तरीकों की तुलना में एक उच्च परिवर्तन दर अर्जित करता है।

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Bastaki, N. K., Cullis, C. A. Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate. J. Vis. Exp. (94), e52189, doi:10.3791/52189 (2014).

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Abstract

पुष्प डुबकी के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन संयंत्र परिवर्तन के क्षेत्र में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है और कई प्रजातियों के पौधे के लिए सफल होने के लिए सूचित किया गया है। हालांकि, पुष्प डुबकी द्वारा सन (Linum usitatissimum) परिवर्तन नहीं बताया गया है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि एग्रोबैक्टीरियम स्थापित करने के लिए है और पुष्प डुबकी विधि ट्रांसजेनिक सन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम इस तकनीक, सरल, सस्ता, कुशल और अधिक महत्वपूर्ण बात, सन परिवर्तन की वर्तमान उपलब्ध तरीकों की तुलना में अधिक परिवर्तन की दर देता है कि पता चलता है।

2 मिनट - सारांश में, सन के पुष्पक्रम 1 के लिए एक द्विआधारी वेक्टर प्लाज्मिड (टी डीएनए टुकड़ा प्लस Linum निवेशन अनुक्रम, एलआईएस -1) ले जाने एग्रोबैक्टीरियम की एक समाधान में डूबा रहे थे। पौधों में 24 घंटे के लिए उनके पक्ष में फ्लैट रखी थी। फिर, पौधों अगले उपचार जब तक सामान्य वृद्धि की शर्तों के तहत बनाए रखा गया। प्रक्रियासूई के बीच 14 दिन के अंतराल - लगभग 10 के साथ 3 बार, - सूई के एस 2 दोहराया गया था। T1 के बीज एकत्र की है और धरती पर अंकुरित कर रहे थे। लगभग दो सप्ताह के बाद, इलाज संततियों प्रत्यक्ष पीसीआर द्वारा परीक्षण किया गया; 2-3 पत्तियों संयंत्र प्लस उपयुक्त टी डीएनए प्राइमरों प्रति इस्तेमाल किया गया। सकारात्मक transformants चयनित और परिपक्वता के लिए बड़े हो रहे थे। सकारात्मक transformants जा रहा है इलाज किया पौधों से बीज के 60% - परिवर्तन की दर 50 से अप्रत्याशित रूप से उच्च था। इस Arabidopsis thaliana और पुष्प डुबकी परिवर्तन का उपयोग अन्य प्रजातियों के पौधे, के लिए रिपोर्ट में उन लोगों की तुलना में अधिक परिवर्तन की दर है। यह परिवर्तन के लिए अन्य तरीकों का उपयोग सन परिवर्तन के लिए, यह भी अब तक सूचित किया गया है, जो सबसे ज्यादा है।

Introduction

सन (Linum usitatissimum) ने अपने फाइबर और तेलों के लिए व्यापक रूप से उगाया एक महत्वपूर्ण फसल है। सन जीनोम के परिवर्तन ऐसे लोग घायल हो गए, एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण, और टिशू कल्चर में सह खेती, उत्थान द्वारा पीछा biolistic कणों या अल्ट्रासाउंड sonication के आवेदन के रूप में तकनीक के साथ संभव है। हालांकि, इन तकनीकों कई उत्परिवर्तनीय घटनाओं के लिए झुकाव और ट्रांसजेनिक लाइनों प्राप्त करने के लिए एक विस्तारित समय सहित कई नुकसान है। इन तरीकों में से कुछ भी महंगा हो सकता है और कम वसूली अंकुरों में जिसके परिणामस्वरूप, उपकरणों के कुशल और कुशल हेरफेर की आवश्यकता होती है सकते हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, इन तकनीक अक्सर कम परिवर्तन दरों 2,6 में परिणाम।

पुष्प डुबकी के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन ट्रांसजेनिक पौधों उत्पन्न करने के लिए एक सरल और कारगर तरीका है। यह नियमित रूप से और सफलतापूर्वक ऐसी एराबिडोप्सिस thalian के रूप में कई प्रजातियों के पौधे के लिए इस्तेमाल किया गया हैएक 1,4, Medicago truncatula 11, टमाटर 12, गेहूं 13 और मक्का में 10। हालांकि, यह कारण इस तरह सन द्वारा उत्पादित फूलों की कम संख्या के रूप में कई कारकों को सन परिवर्तन के लिए एक व्यवहार्य तकनीक के रूप में के बारे में सोचा नहीं किया गया है, प्रत्येक फूल, बड़े बीज आकार, और मोटी कोट से प्राप्त बीज की सीमित संख्या, भी इस तरह के आनुवंशिक परिवर्तन की प्रक्रिया के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है। संततियों गैर तब्दील या तो उगना या उगना लेकिन ब्लीच नहीं है, जबकि इसके अतिरिक्त, पुष्प डुबकी तकनीक का चयन खंड, उगना और हरे रहने के लिए अपनी क्षमता के आधार पर प्रतिष्ठित तब्दील संततियों के साथ एक एंटीबायोटिक, जिसमें एक संयंत्र मीडिया पर तब्दील बीज germinating की आवश्यकता है जल्दी बाहर और मर जाते हैं। वर्तमान साहित्य में, यह जंगली प्रकार सन आधारित झूठी सकारात्मक परिणामों के उत्पादन, और T1 संततियों का चयन कर रही है, एंटीबायोटिक चयन के उच्च एकाग्रता से बचने के लिए जाता है कि उल्लेख किया गया हैएंटीबायोटिक प्रतिरोध पर 6,14 अधिक मुश्किल है। एंटीबायोटिक के एक उच्च एकाग्रता चयन माध्यम से जोड़ा गया था इसके अलावा, जब मनाया परिवर्तन की दर नाटकीय रूप से 9 गिरा दिया।

इस प्रोटोकॉल में, हम अपने जीनोम 3,5 बदलकर माहौल में तनाव के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है, जो फाइबर सन, Stormont सिरस (संवेदनशील और प्लास्टिक), की एक लाइन को बदलने के लिए एग्रोबैक्टीरियम और पुष्प डुबकी विधि का इस्तेमाल किया। एंटीबायोटिक भागने समस्या को दूर करने के लिए, हम संयंत्र मीडिया के लिए एंटीबायोटिक जोड़कर बजाय चयन की, T1 के पत्तों से डीएनए के प्रत्यक्ष पीसीआर परीक्षण करने के लिए चुना है। हम उपचार के समय में विशिष्ट फूल ट्रैक करने के लिए सन की साधारण शरीर रचना विज्ञान का फायदा उठाया। यह ट्रैकिंग प्रणाली एंटीबायोटिक जोड़ने के बिना धरती पर विशिष्ट फूल और अंकुरण से बीज के चयन की अनुमति दी। सकारात्मक transformants बस डीएनए तेजी से और कारगर तरीका ओ का उपयोग कर के पत्तों से प्राप्त परीक्षण द्वारा की पहचान की गईएफ प्रत्यक्ष पीसीआर। हमारे परिणाम पुष्प डुबकी विधि सन की इस पंक्ति में बहुत अच्छी तरह से काम किया है और आश्चर्यजनक रूप से एक बहुत ही उच्च परिवर्तन की दर में हुई दिखाना है कि - पहले होने की सूचना मिली थी जो Arabidopsis thaliana, के लिए मनाया उन लोगों की तुलना में अधिक है, (50 से 60%) 0.1-1 % 1, और अन्य प्रजातियों के पौधे 10,12 से भी अधिक है। हम यह भी अलसी (तेल सन) की एक और किस्म है, बिथयून का परीक्षण (स्थिर और गैर जिम्मेदार), और हमारे प्रारंभिक आंकड़ों पुष्प डुबकी भी सन की इस किस्म के लिए काम करता है कि इंगित करता है।

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एग्रोबैक्टीरियम और पुष्प डुबकी ट्रांसजेनिक सन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि दिखाने के लिए है। हम इस तकनीक को सरल, सस्ता, और सन परिवर्तन के अन्य तरीकों की तुलना में जल्दी है कि दिखा। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह सन परिवर्तन 2,6 के अन्य तरीकों की तुलना में एक बहुत अधिक परिवर्तन की दर में यह परिणाम है। कई शाखाओं और फूल है जो Arabidopsis thaliana का शरीर रचना विज्ञान, एमएKES यह मुश्किल डूबा हुआ है और एक ही पौधे पर फूल गैर डूबा भेद करने के लिए। इसलिए, बीज की बड़ी संख्या है, संयंत्र के अनुसार लगभग 20,000 बीज, सकारात्मक transformants 8 की पहचान के लिए जांच की जरूरत है। सन, दूसरे हाथ पर, यह संभव व्यक्तिगत फूल ट्रैक करने के लिए और इस प्रक्रिया स्क्रीनिंग के दौरान विशिष्ट बीज का चयन करने के लिए बनाता है, जो पौधों के अनुसार लगभग 100 बीज, उत्पादन कम शाखाओं (एक मुख्य शाखा और कुछ पक्ष शाखाओं) और कम फूल है।

हम पुष्प डुबकी सन के किसी भी संबंधित प्रजातियों, लगभग 200 प्रजातियों में से एक जीनस को बदलने के लिए एक लागू तरीका है कि प्रस्ताव। इस विधि सन परिवर्तन के अन्य तरीकों की तुलना में बहुत अधिक परिवर्तन की दर देता है। हम यह भी T1 के पत्ता डीएनए के प्रत्यक्ष पीसीआर स्क्रीनिंग अक्सर कई झूठी सकारात्मक पैदा करता है कि एंटीबायोटिक प्रतिरोध भागने की समस्या को दूर करने के लिए एक कारगर तरीका है कि प्रस्ताव कर रहे हैं। डायरेक्ट पीसीआर स्क्रीनिंग किसी भी अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए लागू किया जा सकता है और टी सीमित नहीं हैसन ओ। इस प्रोटोकॉल में कार्यरत साधारण बीज ट्रैकिंग तकनीक सन के समान शरीर रचना विज्ञान शाखाओं के साथ किसी भी अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए लागू किया जा सकता है।

Protocol

1. पौधों से बढ़

  1. छह सप्ताह पहले सूई के लिए, मिट्टी के साथ 5 इंच बर्तन भरने और सन बीज बोना ¼ (पॉट प्रति 4 बीज) मिट्टी में गहरी इंच। बीज के ऊपर मिट्टी दृढ़ करने के लिए सुनिश्चित करें। नियमित रूप से पौधों को पानी और लंबे दिन के उजाले (14 घंटा प्रकाश और 10 घंटा अंधेरे) में उन्हें बनाए रखने के।
  2. नियमित रूप से प्राथमिक पुष्पक्रम (फूल 'अंगों के समूहों) के लिए पौधों की जाँच करें। कलियों दिखाई दे रहे हैं और सिर्फ पुष्पक्रम (चित्रा 1 और 2) में गठन किया है, जब पौधों परिवर्तन के लिए तैयार हैं। कलियों को देखने यदि आवश्यक हो तो इसके चारों ओर पत्तियों में कटौती करने के लिए।
    नोट: सबसे अच्छा फूल मंच का उपयोग महत्वपूर्ण है और चर्चा में विस्तृत है।
    1. यह पक्ष शाखाओं से अधिक फूलों का उत्पादन के रूप में प्रयोगात्मक उपचार के लिए संयंत्र की मुख्य शाखा का प्रयोग करें। पक्ष शाखाओं या तो नियंत्रण के रूप में (डूबा होने की नहीं) या अन्य प्रयोगात्मक उपचार के लिए प्रयोग करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, के मुख्य और पक्ष शाखाओं का उपयोगएक ही प्रयोगात्मक उपचार के लिए संयंत्र और एक नियंत्रण के रूप में या अन्य प्रयोगात्मक उपचार के लिए एक और संयंत्र का उपयोग करें। अलग-अलग शाखाओं और तारीख और उपचार के प्रकार के साथ अलग-अलग फूलों चिह्नित करने के लिए लेबल का प्रयोग करें।

2. क्लोनिंग और परिवर्तन Escherichia कोलाई (ई कोलाई) कोशिकाओं को में

  1. टी-डीएनए को शरण देने के एक संयंत्र द्विआधारी वेक्टर के कई क्लोनिंग साइट में ब्याज का टुकड़ा / जीन क्लोन।
    1. एक या दो कदम चरणों में क्लोनिंग प्रदर्शन करते हैं।
      1. सीधे पौधे द्विआधारी वेक्टर में इस प्रोटोकॉल (~ 500 बीपी) में छोटे आवेषण क्लोन। इस प्रोटोकॉल में, संयंत्र द्विआधारी वेक्टर (PRI909) का उपयोग करें। अन्यथा, एक समान रणनीति में किसी भी अन्य संयंत्र द्विआधारी वैक्टर का उपयोग करें।
      2. वैकल्पिक रूप से, दो चरणों में बड़ी सम्मिलित करता है (≥6.5 KB) क्लोन: पहले (विशिष्ट संयंत्र नहीं), तो संयंत्र द्विआधारी वेक्टर में subclone एक सामान्य वाणिज्यिक क्लोनिंग किट का उपयोग कर।
  2. एक पीसीआर reac सेट करेंtion के हित के जीन बढ़ाना। (प्रयोग में संयंत्र द्विआधारी वेक्टर के कई क्लोनिंग साइट के अनुसार) 5 'अंत में प्रतिबंध साइटों के साथ डिजाइन प्राइमरों।
    1. निम्नलिखित साइकिल चालन की स्थिति के साथ एक मानक पीसीआर जीनोमिक सन डीएनए का उपयोग कर प्रदर्शन करना: 24 डिग्री सेल्सियस के एक प्रारंभिक पकड़, तो 5 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्रों के बाद 94 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, 15 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चितकालीन पकड़ द्वारा पीछा 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार कदम प्रदर्शन करते हैं।
    2. 1% Tris / Borate / EDTA (TBE) agarose जेल पर अलग पीसीआर उत्पादों, 1 घंटे के लिए 100 वी पर जेल चला रहे हैं। जेल से उत्पादों को शुद्ध और Nanodrop के माध्यम से यों।
  3. वाणिज्यिक क्लोनिंग वेक्टर में पीसीआर उत्पाद क्लोन करने बंधाव मिश्रण सेट करें। निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें।
  4. रासायनिक सक्षम में बंधाव मिश्रण रूपांतरण इस प्रकार के रूप कोलाई कोशिकाओं।
    1. चर्चा के एक शीशी में बंधाव मिश्रण के 2 μl जोड़ेंemically सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं। 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    2. हीट 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए कोशिकाओं शॉक (गर्मी झटका समय और तापमान का इस्तेमाल किया कोशिकाओं के प्रकार पर निर्भर करता है)।
    3. बर्फ पर सेते हैं और catabolite दमन (समाज) के माध्यम से आरटी सुपर इष्टतम शोरबा के 250 μl जोड़ें।
    4. ट्यूब टोपी और एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन में सेते हैं।
    5. 10 बिखरा हुआ है - ए (37 डिग्री सेल्सियस पर prewarmed) prewarmed लेग थाली + उपयुक्त चयनात्मक एंटीबायोटिक पर प्रत्येक परिवर्तन से 50 μl (इस्तेमाल वाणिज्यिक क्लोनिंग वेक्टर के प्रकार के आधार पर चुनिंदा एंटीबायोटिक का निर्धारण)। 37 डिग्री सीओ / एन प्लेटें सेते हैं।
  5. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर, ~ मिनी प्रस्तुत करने का प्लाज्मिड शुद्धि के लिए 10 कालोनियों उठाओ। मिनी प्रस्तुत करने का प्लाज्मिड शुद्धि आम तौर पर निम्नलिखित के रूप में किया जाता है।
    नोट: बफर नाम इस्तेमाल वाणिज्यिक किट के लिए विशिष्ट हैं लेकिन उनके सामान्य कार्यों के समान हैं।
    1. 2 में एकल कालोनियों टीका लगाना- (इस्तेमाल वाणिज्यिक वेक्टर के प्रकार के आधार पर निर्धारित) उपयुक्त चयनात्मक एंटीबायोटिक युक्त 5 मिलीलीटर लेग मध्यम।
    2. जोरदार झटकों (~ 300 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 8 घंटे के लिए सेते हैं।
    3. 10 मिनट के लिए 6000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल।
    4. 250 μl मेजबान बफर में गोली resuspend। मिक्स और भंवर पूरी तरह से गोली फैलाने के लिए।
    5. 6 बार - lysis बफर के 250 μl जोड़कर बैक्टीरियल कोशिकाओं lyse, ट्यूब 4 inverting द्वारा अच्छी तरह मिक्स।
    6. बेअसर बफर में lysate बेअसर और 4 पलटना - मिश्रण करने के लिए 6 बार। एक टेबल टॉप microcentrifuge पर ~ 17,900 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    7. एक स्पिन स्तंभ के लिए पिछले चरण से supernatants स्थानांतरण। अपकेंद्रित्र फिर 30 के लिए ~ 17,900 XG पर - 60 सेकंड।
    8. 60 सेकंड - 30 के लिए 0.75 मिलीलीटर धोने बफर और अपकेंद्रित्र जोड़कर स्पिन स्तंभ धो लें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    9. एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र रेमो कोअवशिष्ट धो बफर किया है। एक साफ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्पिन स्तंभ रखें। डीएनए elute करने के लिए, प्रत्येक स्तंभ के केंद्र के लिए 50 μl पानी जोड़ें। एक मिनट के लिए खड़े करते हैं, और एक मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।

3. 'सम्मिलित की उपस्थिति के लिए शुद्ध प्लास्मिड का विश्लेषण करें

  1. प्रतिबंध डाइजेस्ट:
    1. डालने क्लोन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रतिबंध एंजाइमों के साथ प्लाज्मिड पचाने द्वारा डालने की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक प्रतिबंध डाइजेस्ट सेट करें। के रूप में निम्नानुसार एक ठेठ डबल प्रतिबंध प्रतिक्रिया पचाने: शुद्ध प्लाज्मिड की एक माइक्रोग्राम प्रति, प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइमों की एक μl, 2 μl 10x प्रतिबंध (20 μl की कुल करने के लिए) बफर + 2 μl बीएसए (यदि लागू हो) पानी μl, एक्स पचाने
    2. धीरे मिक्स और सिफारिश के तापमान (एक एंजाइम से दूसरे को बदलता है) पर सेते हैं।
    3. प्रतिबंध 1 घंटे के लिए 100 वी पर चलाने के लिए, 1% TBE agarose जेल पर प्रतिक्रिया पचाने और उचित आकार के ड्रॉप आउट के लिए देखने का विश्लेषण करें।
  2. पीसीआर विश्लेषण:
    1. डालने या वेक्टर और डालने के बीच जंक्शन के अंदर बढ़ाना वाणिज्यिक वेक्टर क्षेत्र से प्राइमरों का उपयोग कर, शुद्ध प्लाज्मिड के साथ एक पीसीआर को निर्धारित करें। आम प्राइमरों M13 आगे और रिवर्स और T3 / T7 प्राइमरों हैं।
    2. इस प्रोटोकॉल में, निम्न पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति का उपयोग करें:, तो 5 सेकंड, 15 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर 18 चक्रों के बाद 94 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, और 72 डिग्री सेल्सियस से 24 डिग्री सेल्सियस के एक प्रारंभिक पकड़ 2 मिनट के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चितकालीन पकड़ द्वारा पीछा 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार कदम प्रदर्शन करते हैं।
    3. 1 घंटे के लिए 120 वी - एक 1% TBE agarose जेल पर लोड पीसीआर उत्पादों और 100 के लिए चला रहे हैं।
  3. अनुक्रमण:
    1. विश्लेषण और डालने की उपस्थिति की पुष्टि के लिए एक वाणिज्यिक अनुक्रमण सुविधा के लिए शुद्ध प्लाज्मिड भेजें।
    2. सही निर्माण प्राप्त हो जाने के बाद, (संयंत्र द्विआधारी वेक्टर में) क्लोनिंग के दूसरे चरण के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं।
      नोट: 2.3 कदम - 3.3क्लोनिंग एक कदम में पूरा हो गया है अगर समाप्त किया जा सकता है।

संयंत्र द्विआधारी वेक्टर (PRI909) और में 4. क्लोनिंग कोलाई परिवर्तन

  1. संयंत्र द्विआधारी वेक्टर linearize करने के लिए प्रतिक्रियाओं को पचाने में एक डबल प्रतिबंध सेट अप और प्राइमरों (2.2 कदम) को जोड़ा गया था कि एक ही प्रतिबंध एंजाइम साइटों का उपयोग कर पहले क्लोन डालने अलग।
  2. 2 घंटा - 1 के लिए 100 वी पर चलाने जेल वैद्युतकणसंचलन, का उपयोग प्रतिबंध हज़म का विश्लेषण करें। डालने और जेल से linearized संयंत्र द्विआधारी वेक्टर काटें।
  3. जेल के उत्पादों को शुद्ध करने के लिए एक वाणिज्यिक किट का प्रयोग करें। निर्माता की पुस्तिका का संदर्भ लें।
  4. संयंत्र द्विआधारी वेक्टर में डालने ligate करने के लिए एक बंधाव प्रतिक्रिया सेट करें। वेक्टर के अनुपात में डालने डालने के आकार और संयंत्र द्विआधारी वेक्टर पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल में LIS1 डालने 6.5 केबी था और संयंत्र द्विआधारी वेक्टर 9 KB था। वेक्टर अनुपात करने के लिए दो डालने: इसलिए, एक एक का उपयोग करें।
  5. 3 -> दोहराएँ 2.4 कदम। सही निर्माण (डालने + संयंत्र द्विआधारी वेक्टर) प्राप्त हो जाने के बाद, चरण 5 में electroporation के लिए आगे बढ़ें।

एग्रोबैक्टीरियम में 5. Electroporation विद्युत सक्षम कोशिकाओं tumefaciens

  1. एग्रोबैक्टीरियम की एक शीशी बर्फ पर विद्युत सक्षम कोशिकाओं tumefaciens गला लें।
  2. बर्फ पर, सक्षम कोशिकाओं के 20 μl द्विआधारी वेक्टर प्लास्मिड डीएनए के एक एनजी जोड़ें, और धीरे मिश्रण।
  3. बर्फ पर एक 0.1 सेमी electroporation क्युवेट टेंशन मत लो।
  4. Electroporation के cuvettes करने के लिए सक्षम सेल / डीएनए मिश्रण स्थानांतरण, और नीचे में मिश्रण इकट्ठा करने के लिए नल। Electroporator मशीन और नाड़ी में क्युवेट रखो (वोल्टेज और समय की स्थितियों क्युवेट के आकार और इस्तेमाल electroporator पर निर्भर करती है)।
  5. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को समाज मीडिया और हस्तांतरण कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. 28-30 में 1 घंटे के लिए सेते100 rpm पर मिलाते हुए, सी °। प्लेट 50 - लेग अगर + उपयुक्त चयनात्मक एंटीबायोटिक पर कोशिकाओं के 100 μl (संयंत्र द्विआधारी प्लाज्मिड और इस्तेमाल एग्रोबैक्टीरियम के तनाव पर निर्भर 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / केनामाइसिन और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने में।)।
  7. 30 डिग्री सेल्सियस - 28 में 48 घंटा अप करने के लिए प्लेटें सेते हैं।
  8. कॉलोनी के चयन और प्लाज्मिड शुद्धि के लिए दोहराएँ कदम 2.5।
  9. चरण 3 को दोहराएँ प्लाज्मिड का विश्लेषण करने के लिए और फूलों की सूई के लिए निर्माण का उपयोग करने से पहले डालने और टी डीएनए की अखंडता की जाँच करने के लिए। कदम 3.3 में के रूप में पूरे डालने के पूरे क्षेत्र में और टी डीएनए क्षेत्रों में और अनुक्रमण द्वारा कई पीसीआर प्राइमरों का उपयोग दोहराएँ कदम 3.2,।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में 4 अलग प्राइमरों टी डीएनए और डालने भर में 10 प्राइमरों भर में डिजाइन किए गए थे।
  10. मैं चयनित एग्रोबैक्टीरियम कॉलोनी में संयंत्र द्विआधारी प्लाज्मिड की उपस्थिति की पुष्टि हो जाने के बाद, जगह कोशिकाओं-80 डिग्री सेल्सियस पर एन 50% ग्लिसरॉल और दुकान। वे एक सप्ताह के सात भीतर इस्तेमाल हो रहे हैं अगर स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट पर कालोनियों शेष।

6. पुष्प की सूई

नोट: दो दिन पहले पुष्प सूई के लिए:

  1. तरल मीडिया में लेग + उचित एंटीबायोटिक दवाओं में - स्थिर चरण (स्वीकार्य है 1 600 0.5 के बीच ओवर ड्राफ्ट) को एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं को विकसित।
    नोट: ये संयंत्र द्विआधारी वेक्टर और इस्तेमाल एग्रोबैक्टीरियम तनाव के प्रकार के आधार पर, कदम 5.6 के रूप में ही एंटीबायोटिक हैं।
  2. एक साथ संस्कृति आरंभ: एक संतृप्त (5 एमएल) हे / एन संस्कृति की 100 dilutions और 24 के लिए बढ़ने - 150 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 28-30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा। संस्कृति midlogarithmic चरण पर पहुंच गया है चाहिए और अधिक होने की संभावना से आ रहा है या स्थिर चरण एक में किया जाएगा। लगभग 0.8 के आयुध डिपो (0.5 से 1 के बीच फिर से आयुध डिपो सब स्वीकार्य हैं) 8। 5000 एक्स पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिएआरटी पर जी।
  3. घुसपैठ मध्यम में कोशिकाओं Resuspend (5.0% सूक्रोज + .05-.003% Silwet एल-77)। सूई के पहले दौर के लिए, 0.05% Silwet-77 का उपयोग करें। दूसरे और तीसरे राउंड के लिए, (चर्चा में विस्तृत) 0.03% की एकाग्रता कम।
  4. पुष्प डुबकी कदम के साथ आगे बढ़ें। उसकी तरफ से संयंत्र निर्धारित करना और 1-2 मिनट के लिए घुसपैठ माध्यम में ही दिखाई कलियों डुबकी। उसकी तरफ से संयंत्र को छोड़ दो और गुंबद (चित्रा 3) में उच्च नमी बनाए रखने के लिए प्लास्टिक की चादर के साथ कवर।
  5. अगले दिन, एक ईमानदार स्थिति में संयंत्र जगह है और सामान्य रूप से बनाए रखने के लिए।
  6. कली (आमतौर पर के बारे में 10 के बाद - 14 दिन) बड़ा बढ़ता है - 6.4, दोहराने 6.1 कदम। 0.003% करने के लिए 60 सेकंड और Silwet-77 एकाग्रता - 30 के लिए सूई समय कम करें।
  7. उनके बीज (चित्रा 4) एकत्र हो परिपक्व और तैयार कर रहे हैं जब तक सामान्य रूप से पौधों को बनाए रखें।

सकारात्मक टीआरए के 7. चयनडायरेक्ट पीसीआर के साथ nsformants

  1. 1.1 कदम के रूप में धरती पर T1 के बीज बोना।
    1. वैकल्पिक रूप से, 500 मिलीलीटर पानी में अगर की एमएस मध्यम 4 जी की 2.2 ग्राम जोड़कर Murashige और Skoog बेसल नमक मध्यम (एमएस मध्यम) बनाते हैं। आटोक्लेव और छोटे संयंत्र बर्तन में डाल देना। इस्तेमाल किया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस रखें।
    2. जम एमएस माध्यम पर उन्हें रखने के द्वारा बीज बोना। लंबे दिन के उजाले (14 घंटा प्रकाश और अंधेरे के 10 घंटा) के तहत रखें। 6 दिन (चित्रा 5) - बीज के बारे में 4 में अंकुरित होना होगा।
    3. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रत्येक फूल से एक बीज का प्रयोग करें। कोई सकारात्मक transformant प्राप्त किया जाता है, तो फूल से दूसरे बीज उठा द्वारा इस चरण को दोहराएँ।
      नोट: एक ही फूलों से टेस्ट विभिन्न बीज, कुछ मामलों में एक फूल से सभी बीज तब्दील हो जाएगा नहीं है। प्रयोगात्मक फूलों से अतिरिक्त बीज का चयन कभी कभी आवश्यक है।
  2. नियमित रूप से अंकुरों पर जाँच करें। लगभग 10 में - अंकुरण के बाद 14 दिन, जब सचविकसित करने, प्रत्यक्ष पीसीआर के साथ पौधों का परीक्षण छोड़ देता है।
  3. 3 पत्ते - 2 काटने से पत्ता डीएनए निकालने को तैयार है - प्रत्येक अंकुर से (5 वजन में 10 मिलीग्राम) और एक microcentrifuge ट्यूब में उन्हें जगह है।
  4. प्रत्येक ट्यूब 50 मिमी NaOH के 180 μl जोड़ें, और 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. 1 एम Tris-एचसीएल (8.0 पीएच) के 20 μl जोड़कर निकालने बेअसर।
  6. सकारात्मक transformants के लिए चयन करने के लिए, टी डीएनए या डालने (चित्रा 7) के पार से डिजाइन प्राइमरों का उपयोग कर, प्रत्यक्ष पीसीआर प्रतिक्रिया में निकालने के 1 μl का प्रयोग करें।
    1. इस प्रोटोकॉल में, 24 डिग्री सेल्सियस के एक प्रारंभिक पकड़ के साथ सीधे पीसीआर उपयोग करते हैं, तो 10 सेकंड, 15 सेकंड के लिए annealing के कदम है, और 68 डिग्री पर एक विस्तार के चरण के लिए 98 डिग्री सेल्सियस (के 40 चक्रों के बाद 98 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, सी)। 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चितकालीन पकड़ द्वारा पीछा 5 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार कदम प्रदर्शन करते हैं। (चक्र के लिए प्राइमरों, annealing के तापमान और विस्तार समय पर जानकारी के लिए 1 टेबल को देखें)।
  7. सकारात्मक transformants पहचानें और परिपक्वता के लिए उन्हें विकसित। बीज एक बड़े बर्तन में मिट्टी में एमएस मध्यम, प्रत्यारोपण में अंकुरित रहे थे (चित्रा 5)।

Representative Results

चित्रा 1-4 प्रोटोकॉल के भीतर कदम से कुछ उदाहरण देकर स्पष्ट करना। आंकड़े 1 और 2, पुष्पक्रम कलियों के आसपास पत्तियों में एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं और प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि विभिन्न कली चरणों के लिए उन्हें बेनकाब करने के लिए काट रहे हैं। तीन सन पुष्प डुबकी की प्रक्रिया से पता चलता है। 4 चित्रा, से पता चलता है एक और पता लगाया पहचाना जा सकता है कि कैसे मुख्य और पक्ष शाखाओं लेबल किया जा सकता है और कैसे अलग-अलग फूलों का उदाहरण है। चित्रा 5 T1 के संततियों एमएस संयंत्र मीडिया पर अंकुरित और फिर परिपक्वता के लिए मिट्टी में प्रत्यारोपित किया जा सकता है कि कैसे पता चलता है। चित्रा 6 कैसे wild- दिखाता है प्रकार सन साहित्य 6,9,14 में पिछले निष्कर्ष की पुष्टि, केनामाइसिन की उच्च सांद्रता से बच सकते हैं।

चित्रा 7 सकारात्मक T1 के transformants से सीधे पीसीआर प्रवर्धन का एक उदाहरण से पता चलता है। T1 के फूल मीटर से एकत्र किए गए थेएक एकल T0 संयंत्र के ऐन और पक्ष शूटिंग। प्रत्यक्ष पीसीआर से देखा जा सकता है, 8/12 T1 के पौधों पीसीआर द्वारा सकारात्मक परीक्षण और टी डीएनए भर में विभिन्न क्षेत्रों परिलक्षित है। हमारे प्राइमरों भी एलआईएस -1 डालने और कई क्लोनिंग साइटों (चित्रा 7B और सी) के बीच बनाया गया था। हम ऐसे छोड़ सीमा और ओपन स्कूल टर्मिनेटर (नहीं दिखाया डेटा) या सही सीमा और कई क्लोनिंग साइट (चित्रा 7 दिन) के रूप में टी डीएनए के विभिन्न क्षेत्रों, बढ़ाना संयंत्र द्विआधारी वेक्टर से अतिरिक्त प्राइमरों इस्तेमाल किया। एलआईएस -1 डालने के लिए विशिष्ट प्राइमरों भी इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया (डेटा) नहीं दिखाया। प्राइमरों की एक सूची तालिका 1 में प्रदान की जाती है। हालांकि, इन प्राइमरों के दृश्यों टी डीएनए संयंत्र द्विआधारी वेक्टर के अनुक्रम और पुष्प डुबकी के लिए इस्तेमाल किया डालने पर निर्भर करता है। हम भी मुख्य और पक्ष शाखाओं से एकत्र फूलों के बीच परिवर्तन की दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर था कि वहाँ का उल्लेख किया।


प्राथमिक पुष्पक्रम कलियों के आसपास पत्ते काटना चित्रा 1. Agrobacterim कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए। (ए) कलियों पत्तियों से कवर कर रहे हैं। (बी) के पत्तों उन्हें बेनकाब करने की कलियों के आसपास कटौती की गई है। (सी) संयंत्र से छवि बढ़ाया कलियों का पर्दाफाश करने के काटने के बाद (ए) में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. पुष्प डुबकी के लिए उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा मंच का निर्धारण करने के लिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है कि विभिन्न कली चरणों। (ए) के प्रारंभिक चरण कली approxima है tely 2 मिमी। (बी) के बीच मंच कली लगभग 5 मिमी है। (सी) देर से मंच कली लगभग बारे में 1 सेमी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3. सन पुष्प सूई की प्रक्रिया। (ए) के प्राथमिक पुष्पक्रम डूबा पौधों अगले दिन तक फ्लैट रखी हैं (सी)। (ए) से बढ़ाया (बी)। एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं से युक्त घुसपैठ मीडिया में डूबा रहे हैं, और डूबा शाखाओं बनाए रखने के लिए प्लास्टिक के साथ कवर कर रहे हैं उच्च आर्द्रता। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हमेशा ">:" रख-together.within पृष्ठ = के लिए "jove_content चित्रा 4
। चित्रा 4. T0 इलाज किया पौधों से फूल ट्रैकिंग और बीज संग्रह की प्रक्रिया, (ए) के मुख्य शाखा (बीच में सबसे ऊंची शाखा) के साथ पूरे संयंत्र का एक उदाहरण है और पक्ष शाखाओं (बी - डी)। एक । विभिन्न शाखाओं से फूलों का उदाहरण (ई) अलग-अलग फूलों से एकत्र बीज का एक उदाहरण (एक लेबल - कश्मीर)। मुख्य शाखा से यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. T1 के अंकुरों एंटीबायोटिक चयन के बिना हो रहे हैं। (ए) T1 के बीज होते हैंएमएस संयंत्र मीडिया पर अंकुरित। (बी) सकारात्मक transformants, प्रत्यक्ष पीसीआर द्वारा निर्धारित रूप में, मिट्टी में प्रत्यारोपित और परिपक्वता के लिए बड़े हो रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 एंटीबायोटिक भागने, T1 के चयन के लिए एक समस्या है, प्रत्यक्ष पीसीआर स्क्रीनिंग के द्वारा दूर किया जाता है। एंटीबायोटिक के बिना एमएस संयंत्र मीडिया पर अंकुरित (ए) जंगली प्रकार सन बीज। (बी) जंगली प्रकार सन बीज एमएस संयंत्र मीडिया + बढ़ रही सांद्रता पर अंकुरित के केनामाइसिन (200 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, 600 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, 1 मिलीग्राम / एमएल)। जंगली प्रकार सन और T1 से 2 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन। (डी) पीसीआर के साथ एमएस संयंत्र मीडिया पर अंकुरित (सी) जंगली प्रकार सन बीज केनामाइसिन प्राइमरों का उपयोग अंकुर, सभी ampl, सी डीएनए मार्कर, FlaxS, जंगली प्रकार flaxS: EZ1: केनामाइसिन जीन (किंवदंतियों ified गैर डूबा शाखा पर नियंत्रण, मा: फूल से T1 के संतान 'ए' मुख्य शाखा से एकत्र, अनुसूचित जाति, एसडी, एसई, एस एफ: पक्ष शाखा, डब्ल्यू से एकत्र विभिन्न फूल "सी, डी, ई, एफ" के T1 के संततियों। कोई-डीएनए) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. प्रत्यक्ष पीसीआर विधि का उपयोग T1 के संततियों के सफल पीसीआर amplifications का एक उदाहरण है। संयंत्र द्विआधारी वेक्टर + क्लोन एलआईएस -1 डालने की (ए) आरेख। नीले तीर (Takara से संशोधित) प्रत्यक्ष पीसीआर स्क्रीनिंग में इस्तेमाल पीसीआर प्राइमरों की स्थिति का संकेत। (बी) पीसीआर प्राइमरों M13F साथ + 3 '(सी) पीसीआर के साथ प्राइमरों M13R + 18a यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आगे प्राइमर अनुक्रम स्रोत अनुक्रम 5'-3 ' रिवर्स प्राइमर अनुक्रम स्रोत अनुक्रम 5'-3 ' एनीलिंग temprature (डिग्री सेल्सियस) एक्सटेंशन समय (सेकंड) उम्मीद आकार (बीपी)
M13F (टी डीएनए) CTGCAAGGCG
ATTAAGTTGG
3 '(एलआईएस -1 डालने) GAGGATGGAA
GATGAAGAAGG
57 40 450
18a (एलआईएस -1 डालने) TATTTTAACCC M13R (टी डीएनए) ATTAGGCACC
CCAGGCTTTA
57 40 520
एमसीएस (टी डीएनए) TGGTCATAGC
TGTTTCCTGTG
आरबी (टी डीएनए) TTTAAACTGA
AGGCGGGAAA
60 20 200
पौंड (टी डीएनए) TTTGATGGTG
GTTCCGAAAT
ओपन स्कूल (टी डीएनए) GAATCCTGTT
GCCGGTCTT
60 30 380
NPTII (टी डीएनए) GCGATACCGT
AAAGCACGAG
NTPII (टी डीएनए) GCTCGACGTT
GTCACTGAAG
65 45 502

तालिका 1. प्रत्यक्ष पीसीआर परीक्षण के लिए इस्तेमाल प्राइमरों के कुछ।

Discussion

ऐसे सन (Linum usitatissimum) के रूप में कुछ प्रजातियों के पौधे में, सफल संयंत्र परिवर्तन सीमित कर दिया गया है। इससे पहले, सन में परिवर्तन लोग घायल हो गए और सह खेती, biolistic कणों को लागू करने या उत्थान के द्वारा पीछा अल्ट्रासाउंड sonication के, का उपयोग करके एक एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण की आवश्यकता है; लंबी और होने का खतरा है कि दोनों एक प्रक्रिया कई उत्परिवर्तनीय घटनाओं के साथ किया जा रहा है। इसके अलावा, इन तकनीकों में से चयन प्रक्रिया ऐसी केनामाइसिन के रूप में एंटीबायोटिक चयन मार्कर के उपयोग की आवश्यकता है। हालांकि, यह सन एंटीबायोटिक दवाओं 6,9,14 की उच्च सांद्रता से बचने के लिए जाता है के रूप में चयन की इस पद्धति, कई झूठी सकारात्मक पैदा करता है कि साहित्य में उल्लेख किया गया है। सन परिवर्तन में पिछले तकनीकों का एक और नुकसान कम परिवर्तन दरों 2,6 किया गया है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, पुष्प की सूई के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन दिखाया गया था(60% - 50) सन के लिए एक उच्च परिवर्तन की दर में कमी की। Transformants मुख्य और पक्ष शाखाओं से डूबा हुआ है और एकत्र फूलों से प्राप्त किया गया। सकारात्मक transformants की चुनाव में बस से गुजर एंटीबायोटिक चयन का उपयोग करते हैं, धरती पर T1 के पौधों बढ़ रही है और वे अंकुरित के बाद जल्द ही अपने पत्ते स्क्रीनिंग द्वारा किया गया था, एक कदम पहले से अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए फूलों की डुबकी में एक आदर्श के रूप में प्रयोग किया जाता है। पत्तियों का प्रत्यक्ष पीसीआर परीक्षण के प्रदर्शन और उचित टी डीएनए प्राइमरों का उपयोग करके, सकारात्मक transformants तेजी से चुना जा सकता है। इस तकनीक को इस विधि 1,10,12 का उपयोग करते हुए पहले से एराबिडोप्सिस और अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए रिपोर्ट में उन लोगों की तुलना में एक बहुत अधिक परिवर्तन की दर में सरल, सस्ता और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, फिर भी परिणाम है। यह भी सन के लिए उच्चतम रिपोर्ट परिवर्तन की दर है।

हालांकि, सबसे अच्छा फूल चरण का चयन और सबसे अच्छा surfactant एकाग्रता सहित प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण कदम है, ताकि वहाँ रहे हैंएग्रोबैक्टीरियम फूल अंगों की हत्या के बिना संयंत्र कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं। एक प्रारंभिक कली चरण से अधिक 0.05% की उच्च Silwet-77 एकाग्रता के साथ (2A चित्रा) का इस्तेमाल किया जाता है, तो फूल विकसित और न ही बीज सेट नहीं होगा। परिवर्तन काम हो सकता है, हालांकि देर कली मंच, (चित्रा -2) का इस्तेमाल किया जाता है, तो यह एक बहुत कम दर पर घटित होगा। इसी तरह के परिणाम एराबिडोप्सिस पुष्प डुबकी परिवर्तन 1,4 के साथ प्राप्त किया गया। इस प्रोटोकॉल के लिए, सभी पुष्प चरणों में एक दूसरे की सूई पर, उसके बाद अलग Silwet-77 सांद्रता के साथ परीक्षण किया गया है और सबसे अच्छा मंच पहली सूई के लिए 0.05% पर Silwet-77 के साथ मध्य कली चरण (चित्रा -2) होने के लिए निर्धारित किया गया था 0.03% के एक से थोड़ा कम Silwet-77 एकाग्रता के साथ देर कली चरण (चित्रा -2)। परिवर्तन भी द्वारा पीछा किया, 0.003% की एक कम silwet-77 एकाग्रता के साथ जल्दी कली चरण (2A चित्रा) का उपयोग अच्छी तरह से काम0.05% के उच्च Silwet-77 एकाग्रता में मध्य कली चरण (चित्रा 2 बी) के साथ एक दूसरे की सूई।

इस प्रोटोकॉल में, कुछ अन्य मानकों परिवर्तन की दर का अनुकूलन करने का प्रयास किया, लेकिन अंतिम परिणाम पर कोई प्रभाव हो पाए गए। उदाहरण के पौधों को अपने पक्ष में करना और एक दिन से दो दिन के लिए प्लास्टिक में शामिल है कि सूई के बाद समय का विस्तार शामिल है; एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति के लिए अधिक से अधिक 1 के एक आयुध डिपो का उपयोग कर के बजाय, 0.5-1; 15 मिनट के बजाय - 1 - 2 मिनट से 5 सूई समय बढ़ रही है। फिर हम इन रणनीतियों का उपयोग परिवर्तन की दर पर कोई असर नहीं देखा है। सबसे प्रभावी कारक है, फिर भी, सही फूल चरणों में स्वस्थ पौधों का उपयोग कर, और सबसे अच्छा Silwet-77 एकाग्रता का उपयोग किया जाना पाया गया। हम दो सूई अंतराल, एक समय सूई भी काम करता है, भले ही किसी भी तरह से बेहतर है एक बार काम करता है कि देखा।

इस प्रोटोकॉल के लिए संशोधन reducin द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैजी दूसरे या तीसरे सूई में के रूप में छोटे 0.003% के रूप में करने के लिए Silwet-77 एकाग्रता। Silwet-77 विषैला होता है के बाद से, फूलों में भी एक उच्च एकाग्रता परिणाम कोई बीज उपज है, जिसके परिणामस्वरूप खराब विकासशील। पौधों स्वस्थ नहीं दिख रहे हैं और कलियों अच्छी तरह से विकसित नहीं कर रहे हैं तो दूसरे या तीसरे घटनाओं का सफाया साथ सूई आवृत्ति, एक को कम किया जा सकता है।

इस तकनीक का एक प्रमुख सीमा सन, प्रत्येक फूल से प्राप्त बीज की सीमित संख्या, और सन के लंबे जीवन चक्र द्वारा उत्पादित फूलों की कम संख्या है। T1 पीढ़ी को पाने के लिए 10 सप्ताह के बाद सूई - पहले की सूई के लिए तैयार प्राथमिक कलियों और एक अतिरिक्त 8 है करने के लिए बीज की बुआई से 8 सप्ताह - यह 6 लेता है। कुल में, 5 की एक श्रृंखला - 6 महीने T1 पीढ़ी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। अन्य प्रजातियों के पौधे के विपरीत, जो फूल किसी भी वर्ष के, वर्ष विशिष्ट समय पर कुछ सन किस्मों के फूल बेहतर है। इस तकनीक के लिए तो विचारशील नियोजन महत्वपूर्ण है।

एग्रोबैक्टीरियम शो - पुष्प डुबकी के माध्यम से मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन सन परिवर्तन के लिए एक लागू और कारगर तरीका है और सन परिवर्तन के लिए पहले से इस्तेमाल की तकनीक की जगह इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में पुष्प डुबकी विधि के संशोधनों के किसी भी अन्य प्रजातियों के पौधे के साथ उपयोग करने के लिए लागू है और सन तक ही सीमित नहीं किया जाएगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)
5" pots
Potting soil
Greenhouse with appropriate light setting
Thermocycler
Agarose gel electropheresis equipment
Digital imaging setup
Silwet-77 LEHLE SEEDS VIS-01 Toxic, wear gloves
GoTaq Green Master Mix Promega Part# 9PIM712
Terra PCR Direct Polymerase Mix Clontech 639270
Binary vector PRI 909 Takara 3260
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E Takara 9115
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4595-01
Sucrose Fisher Scientific
Electroporator and cuvettes Bio-Rad 165-2092
Shaker
Spinner
Plastic wrap and aluminum foil wrap
speedSTAR DNA polymerase Takara RR070A/B
QlAquick gel extraction kit Qiagen 28704
QIAGEN plasmid mini kit Qiagen 12123
SalI-HF enzyme NEB R3138S
SacI-HF enzyme NEB R3156S
T4 DNA ligation kit NEB M0202
Murashige Skoog Sigma M5524
Agar Fisher Scientific A360-500

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References

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