Blommor-Dip Omvandling av lin (
1Department of Biology, Case Western Reserve University

Biology
 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att omvandla lin använder Agrobacterium-medierad växttransformation via blommig-dip. Detta protokoll är enkel att utföra och billig, men ändå ger en högre omvandlingsfrekvens än de nuvarande tillgängliga metoder för lin transformation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bastaki, N. K., Cullis, C. A. Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate. J. Vis. Exp. (94), e52189, doi:10.3791/52189 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Agrobacterium-medierad växttransformation via blommig-dip är en allmänt använd teknik inom området för växt omvandling och har rapporterats vara framgångsrika för många växtarter. Dock har lin (Linum usitatissimum) omvandling av blommor-dip inte rapporterats. Målet med detta protokoll är att fastställa att Agrobacterium och blommiga-dip-metoden kan användas för att generera transgena lin. Vi visar att denna teknik är enkel, billig, effektiv, och ännu viktigare, ger en högre transformationsfrekvens än de nuvarande tillgängliga metoder för lin omvandling.

Sammanfattningsvis var blomställningar av lin doppas i en lösning av Agrobacterium bär en binär vektor plasmid (T-DNA-fragment plus Linum Inser Sequence, LIS-1) för 1 - 2 min. Plantorna läggs platt på sin sida för 24 h. Då var växter bibehålls under normala odlingsförhållanden tills nästa behandling. Process av doppa upprepades 2-3 gånger, med ca 10-14 dagars mellanrum mellan doppning. De T1 fröna samlades in och gro på marken. Efter cirka två veckor, behandlades avkommor testas genom direkt PCR; 2-3 blad användes per växt plus lämpliga T-DNA-primrar. Positiva transformanter selekterades och odlades till mognad. Omvandlingen takten var oväntat hög, 50 - 60% av fröna från behandlade växter vara positiva trans. Det är en högre omvandlingsfrekvens än de som rapporterats för Arabidopsis thaliana och andra växtarter, som använder floral-dip förvandling. Det är också den högsta, som har rapporterats hittills, för lin transformation med andra metoder för transformation.

Introduction

Lin (Linum usitatissimum) är en viktig gröda som odlas i stor utsträckning för sina fibrer och oljor. Transformation av lin-genomet är möjligt med tekniker såsom sårskada, Agrobacterium-infektion, och samodling i vävnadskultur, tillämpa biolistiska partiklar eller ultraljud sonikering följt av regenerering. Dessa tekniker har dock många nackdelar, bland proclivity till många mutationshändelser och en förlängd tid för att få de transgena linjerna. Vissa av dessa metoder kan också vara dyra och kräver kompetent och effektiv hantering av instrumenten, vilket resulterar i låga återvinnings plantor. Viktigast dessa teknik resulterar ofta i låga omvandlingshastigheter 2,6.

Agrobacterium-medierad växttransformation via blommig-dip är en enkel och effektiv metod för att generera transgena växter. Det har rutinmässigt och användes med framgång för många växtarter såsom från Arabidopsis Thalianen 1,4, Tornlusern 11, tomat 12, vete 13 och majs 10. Det har dock inte varit tänkt som en livskraftig teknik för lin omvandling på grund av flera faktorer, såsom det låga antalet blommor produceras av lin, begränsat antal frön som erhållits från varje blomma, den stora fröstorlek, och tjock päls, som också kan vara problematiskt för en sådan genetisk omvandlingsprocess. Dessutom valet segment av blommor-dip teknik kräver groende omvandlade frön på en anläggning media innehållande ett antibiotikum, med transforme avkommor särskiljas utifrån deras förmåga att gro och bo grönt, medan icke-transformerade avkommor antingen inte gror eller gro men blekmedel ut snabbt och dör. I den aktuella litteraturen, har det noterats att vildtyp lin tenderar att undkomma hög koncentration av antibiotika markeringar, producera falska positiva resultat, och gör valet av T1 progenies baseradeom antibiotikaresistens svårare 6,14. Också när en hög koncentration av antibiotika sattes till urvalsmediet, graden av observerade omvandling sjunkit dramatiskt 9.

I detta protokoll använde vi Agrobacterium och blommiga-dip metod för att omvandla en linje av spånadslin, Stormont cirrus (lyhörd och plast), vilket har visat sig svara på spänningar i miljön genom att ändra dess genom 3,5. För att övervinna den antibiotiska fly problemet, har vi valt att göra direkt PCR-testning av DNA från T1 blad, istället för val genom att lägga till antibiotika till anläggningen media. Vi drog fördel av den enkla anatomi lin att spåra specifika blommor vid tidpunkten för behandlingen. Detta system för spårning tillät urval av frön från specifika blommor och groning på marken utan att lägga antibiotika. Positiva trans var helt enkelt identifieras genom testning DNA erhållet från blad med hjälp av snabba och effektiva metoden of direkt PCR. Våra resultat visar att blom-dip-metoden fungerat mycket bra i denna linje av lin och överraskande resulterade i en mycket hög omvandlingsfrekvens (50-60%), högre än de som tidigare observerats för Arabidopsis thaliana, vilket rapporterades vara 0,1-1 % 1, och även högre än andra växtarter 10,12. Vi testade även en annan sort av linfrö (oljelin), Bethune (stabilt och icke-lyhörda), och vår preliminära data indikerar att floral-dip fungerar även för denna sort av lin.

Målet med detta protokoll är att visa att Agrobacterium och blommig-dip kan användas för att generera transgena lin. Vi visar att denna teknik är enkel, billig, och snabbare än andra metoder för lin omvandling. Viktigare det resulterar i en mycket högre omvandlingsfrekvens än andra metoder för lin transformation 2,6. Anatomi Arabidopsis thaliana, som har många grenar och blommor, makes det svårt att skilja doppat och icke-doppade blommor på samma planta. Därför ett stort antal frön, cirka 20.000 frön per planta, behöver screenas för att identifiera positiva trans 8. Flax, å andra sidan, har färre grenar (en huvudgren och några sidogrenar) och färre blommor, som producerar cirka 100 frön per växter, vilket gör det möjligt att spåra enskilda blommor och för att välja särskilt utsäde under screening process.

Vi föreslår att floral-dip är en tillämplig metod för att omvandla eventuella besläktade arter av lin, ett släkte av cirka 200 arter. Denna metod ger mycket högre omvandlingshastighet än andra metoder för lin omvandling. Vi föreslår också att den direkta PCR screening av T1 blad DNA är ett effektivt sätt att övervinna problemet med antibiotikaresistens flykt som ofta producerar många falska positiva. Direkt PCR-screening kan tillämpas på andra växtarter och är inte begränsad to lin. Den enkla spårning frö teknik som används i detta protokoll kan tillämpas på andra växtarter med förgrening anatomi liknar lin.

Protocol

1. Växande de Växter

  1. 6 veckor före doppning, fyller 5 tums krukor med jord och sår linfrön ¼ tums djupt i jorden (4 frön per kruka). Var noga med att strama jorden över fröna. Vattna blommorna regelbundet och hålla dem i långa dagsljus (14 timmar ljus och 10 timmar mörker).
  2. Kolla växter regelbundet för primära blomställningar (kluster av blommor "organ). Plantorna är färdiga för transformation när knopparna är synliga och har just bildats i blomställning (figur 1 och 2). För att se knopparna, skär bladen runt den om det behövs.
    OBS: Om du använder den bästa blomman stadiet är kritisk och beskrivs i diskussionen.
    1. Använd huvudgrenen av anläggningen för experimentell behandling som det producerar fler blommor än sido grenar. Använd sidogrenar antingen som kontroller (ej att doppas) eller för andra experimentella behandlingar.
    2. Alternativt kan du använda huvud- och sidogrenar avSamma anläggning för experimentell behandling och använda en annan anläggning som en kontroll eller för andra experimentella behandlingar. Använd etiketter för att markera enskilda grenar och enskilda blommor med datum och typ av behandling.

2. Kloning och Transformation in till Escherichia coli (E. coli) celler

  1. Klona fragmentet / genen av intresse in i det multipla kloningsstället i en växt binär vektor som härbärgerar den T-DNA.
    1. Utför kloning i ett steg eller två steg.
      1. Direkt klona små skär i detta protokoll (~ 500 bp) i växten binär vektor. I detta protokoll använder anläggningen binär vektor (PRI909). Annars använder några andra växt binära vektorer i en liknande strategi.
      2. Alternativt klona stora insatser (≥6.5 kb) i två steg: först med hjälp av en allmän kommersiell kloningssats (inte plantera specifik), sedan subklona i växten binär vektor.
  2. Inrätta en PCR REACtion för att amplifiera genen av intresse. Plan primers med restriktionsställen vid 5'-änden (enligt det multipla kloningsstället av anläggningen binär vektor i bruk).
    1. Utför en standard-PCR med användning av genomiskt lin-DNA med följande cykelbetingelser: en initial tag i 24 ° C, därefter 2 minuter vid 94 ° C, följt av 30 cykler av 98 ° C under 5 sek, 60 ° C under 15 sek, och 72 ° C under 2 min. Utför en slutlig förlängningssteg vid 72 ° C under 5 min följt av en obestämd uppehåll vid 4 ° C.
    2. Separata PCR-produkter på en% Tris / borat / EDTA (TBE) agarosgel, kör gelén vid 100 V under 1 h. Rena produkterna från gelén och kvantifiera via Nanodrop.
  3. Konfigurera ligeringsblandningen för att klona PCR-produkten i den kommersiella kloningsvektorn. Följ tillverkarens protokoll.
  4. Omvandla ligeringsblandningen in kemiskt kompetent E. coli-celler enligt följande.
    1. Tillsätt 2 pl av ligeringsblandningen in i en flaska med chemically kompetenta E. coli-celler. Inkubera på is under 30 min.
    2. Värmechock cellerna under 30 sek vid 42 ° C (värmechock tid och temperatur beror på den typ av celler som används).
    3. Inkubera på is och tillsätt 250 pl RT super optimal buljong med katabolitrepression (SOC) medium.
    4. Förslut röret och inkubera i en orbitalskak vid 200 rpm vid 37 ° C under en timme.
    5. Sprid 10-50 | il från varje transformation på en förvärmd LB-platta (förvärmd vid 37 ° C) + lämpligt selektivt antibiotikum (bestämma den selektiva antibiotikum baserat på typen av kommersiella kloningsvektor som användes). Inkubera plattorna vid 37 ° CO / N.
  5. Plocka ~ 10 kolonier för mini prep plasmidrening, med hjälp av ett kommersiellt kit. Mini prep plasmidrening utförs vanligen enligt följande.
    OBS: Buffert namn är specifika för den kommersiellt kit användas, men deras allmänna funktioner är liknande.
    1. Inokulera de enstaka kolonier i 2- 5 ml LB-medium innehållande lämpligt selektivt antibiotikum (bestäms baserat på den typ av kommersiell vektor som används).
    2. Inkubera i approximativt 8 h vid 37 ° C under kraftig skakning (~ 300 rpm).
    3. Skörda cellerna genom centrifugering vid 6000 xg under 10 minuter.
    4. Återsuspendera pelleten i 250 | il resuspensionsbuffert. Blanda och skaka för att helt skingra pelleten.
    5. Lyse bakteriecellerna genom att lägga till 250 l av lysbufferten, blanda väl genom att vända rören 4 - 6 gånger.
    6. Neutralisera lysatet i neutraliseringsbuffert och invertera 4 - 6 gånger för att blanda. Centrifugera i 10 min vid ~ 17.900 xg i en bordsmikrocentrifug.
    7. Överför supernatanterna från föregående steg till en spinnkolonn. Centrifugera igen vid ~ 17.900 xg under 30 - 60 sek.
    8. Tvätta spinnkolonn genom att tillsätta 0,75 ml tvättbuffert och centrifugera i 30-60 sek. Kassera genomströmning.
    9. Centrifugera under ytterligare 1 min för att remove resterande tvättbuffert. Placera spinnkolonn i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör. För att eluera DNA, tillsätt 50 | il vatten till centrum av varje kolumn. Låt stå under 1 min, och centrifugera i 1 minut.

3. Analysera Renat plasmider för förekomst av Infoga

  1. Begränsning Digest:
    1. Sätt upp en restriktionsklyvning för att bestämma närvaron av insatsen genom att digerera plasmiden med restriktionsenzymer som används för att klona insatsen. En typisk dubbel begränsning smälta reaktion enligt följande: 1 pg av renat plasmid, 1 pl av varje restriktionsenzymer, 2 pl 10x begränsning smälta buffert + 2 pl BSA (i förekommande fall), X l vatten (till totalt 20 l)
    2. Blanda försiktigt och inkubera vid rekommenderad temperatur (varierar från ett enzym till en annan).
    3. Analysera begränsningen smälta reaktionen på 1% TBE agarosgel, kör vid 100 V under 1 timme och leta efter avhopp av lämplig storlek.
  2. PCR-analys:
    1. Sätt upp en PCR med den renade plasmiden, med användning av primers från den kommersiella vektorn regionen för att amplifiera inuti insatsen eller förbindningen mellan vektorn och insatsen. Vanliga primers är M13 framåt och bakåt och T3 / T7 primers.
    2. I detta protokoll använda följande PCR cykelbetingelser: en initial tag i 24 ° C, därefter 2 minuter vid 94 ° C, följt av 18 cykler vid 98 ° C under 5 sek, 60 ° C under 15 sek, och 72 ° C i 2 min. Utför en slutlig förlängningssteg vid 72 ° C under 5 min följt av en obestämd uppehåll vid 4 ° C.
    3. Last PCR-produkter på en 1% TBE agarosgel och köra för 100-120 V under 1 timme.
  3. Sekvense:
    1. Skicka den renade plasmiden till en kommersiell sekvense anläggning för att analysera och bekräfta närvaron av insatsen.
    2. När väl den korrekta konstruktionen erhålls, använda den för det andra steget av kloning (in i växten binär vektor).
      OBS: Steg 2,3-3,3kan elimineras om kloning är klar i ett steg.

4. Kloning in i växt Binary Vector (PRI909) och E. coli Transformation

  1. Sätt upp en dubbel restriktionsklyvning reaktioner att linearisera växten binära vektorn och isolera den tidigare klonade insättningen med användning av samma restriktionsenzymställen som har lagts till de primrar (steg 2.2).
  2. Analysera restriktionsuppslutningar med användning av gelelektrofores, kördes vid 100 V under 1 - 2 h. Skär insatsen och linjäriserade växten binära vektorn från gelén.
  3. Använd ett kommersiellt kit för att rena gelprodukter. Se tillverkarens bruksanvisning.
  4. Sätt upp en ligeringsreaktion för att ligera in insatsen i växten binära vektorn. Insatsen till vektor förhållandet beror på storleken av skäret och anläggningen binära vektorn. I detta protokoll för LIS1 insatsen var 6,5 kb och anläggningen binära vektorn var 9 kb. Därför använder en 1: 2 insats till vektor-förhållande.
  5. steg 2,4-3 för bakteriell transformation, plasmidrening och analys. När korrekt konstruktion (insert + växt binär vektor) erhålls, gå vidare till elektroporering i steg 5.

5. Elektroporation i Agrobacterium tumefaciens Elektriskt Competent Cells

  1. Tina en flaska med Agrobacterium tumefaciens elektriskt kompetenta celler på is.
  2. Lägg ett ng av binär vektorplasmid-DNA till 20 | il kompetenta celler, på is, och blanda försiktigt.
  3. Chill en 0,1 cm elektroporeringskyvett på is.
  4. Överför den behöriga cellen / DNA mix till elektroporation kyvetter och tryck på för att samla in blandningen i botten. Placera kyvetten i elektroporator maskinen och puls (spänning och tid betingelserna beror på storleken på kyvetten och elektroporator används).
  5. Tillsätt 1 ml SOC medium och överföringsceller till en 15 ml tub.
  6. Inkubera i en timme vid 28 till 30° C, skaka vid 100 rpm. Plate 50-100 pl celler på LB-agar + lämplig selektiv antibiotika (beroende på plantan binära plasmiden och stam av Agrobacterium används i detta protokoll används 50 mikrogram / ​​ml kanamycin och 100 ng / ml streptomycin.).
  7. Inkubera plattorna upp till 48 h vid 28-30 ° C.
  8. Upprepa steg 2,5 för koloni urval och plasmidrening.
  9. Upprepa steg 3 för att analysera plasmiden och för att kontrollera integriteten hos insatsen och T-DNA före användning av konstruktionen för blom--doppning. Upprepa steg 3,2, med användning av multipla PCR-primrar i hela insatsen regionen och över T-DNA-regioner och genom sekvensering såsom i steg 3.3.
    OBS: I detta protokoll 4 olika primers utformades över T-DNA och 10 primers över insatsen.
  10. När närvaron av anläggningen binära plasmiden i den valda Agrobacterium kolonin bekräftas plats celler i-n 50% glycerol och förvaras vid -80 ° C. Store återstående kolonier på plattan vid 4 ° C om de ska användas inom en vecka 7.

6. Blommor-Doppning

OBS: 2 dagar före blommig-doppning:

  1. Väx Agrobacterium celler till den stationära fasen (OD 600 mellan 0,5-1 är acceptabelt) i LB + lämpliga antibiotika i flytande media.
    NOTERA: Dessa är samma antibiotikum som i steg 5.6, baserat på växten binära vektorn och på typen av Agrobacterium-stammen som används.
  2. Starta kultur med ett: 100 utspädningar av en mättad (5 ml) O / N-kulturen och växa för 24 - 48 h vid 28-30 ° C under skakning vid 150 rpm. Kulturen bör ha nått midlogarithmic fas och mer sannolikt kommer att närma sig eller stationär fas 1. OD på cirka 0,8 (igen OD mellan 0,5 till 1 är alla acceptabla) 8. Samla cellerna genom centrifugering vid 5000 xg vid RT.
  3. Resuspendera cellerna i infiltrations medium (5,0% sackaros + 0,05 till 0,003% Silwet L-77). För den första omgången av doppning, använd 0,05% Silwet-77. För den andra och tredje omgångarna, minska koncentrationen till 0,03% (enligt diskussion).
  4. Fortsätt med blommiga-dip steg. Lay växten på sidan och doppa endast de synliga knoppar i infiltrationen medium för 1-2 minuter. Lämna anläggningen på sidan och täck den med plastfolie för att hålla hög luftfuktighet i kupolen (Figur 3).
  5. På nästa dag, placera växten i ett upprätt läge och upprätthålla normalt.
  6. När knoppen växer sig större (oftast efter ca 10-14 dagar), upprepa steg 6,1-6,4. Minska dopptiden till 30 - 60 sek och Silwet-77 koncentrationen till 0,003%.
  7. Behåll växterna normalt tills deras frön är mogen och redo att samlas (Figur 4).

7. Valet av Positiv Transformants med Direct PCR

  1. Sås T1 frön på marken som i steg 1.1.
    1. Alternativt gör Murashige och Skoog basala saltmedium (MS-medium) genom att tillsätta 2,2 g MS-medium + 4 g agar i 500 ml vatten. Autoklav och häll i små krukor. Förvara i 4 ° C tills de användes.
    2. Sugga fröet genom att placera dem på stelnat MS-medium. Förvaras i långa dagsljus (14 timmar ljus och 10 timmar i mörker). Frön gror i ca 4-6 dagar (Figur 5).
    3. Använd ett frö från varje blomma som utgångspunkt. Om ingen positiv transformant erhålls, upprepa detta steg genom att plocka en annan frö från blomman.
      OBS: Testa olika frön från samma blommor, eftersom det i vissa fall inte alla frön från en blomma kommer att omvandlas. Välja extra frön från experimentella blommor är ibland nödvändigt.
  2. Kontrollera om plantorna regelbundet. I cirka 10-14 dagar efter groning, då santlöv utveckla, testa växterna med direkt PCR.
  3. Förbered blad DNA-extrakt genom att skära 2-3 blad (5-10 mg i vikt) från varje planta och placera dem i ett mikrocentrifugrör.
  4. Lägg 180 pl av 50 mM NaOH till varje rör, och inkubera under 10 minuter vid 95 ° C.
  5. Neutralisera extraktet genom tillsats 20 | il 1 M Tris-HCl (pH 8,0).
  6. Använd ett pl av extraktet i den direkta PCR-reaktion, med användning av primrar utformade tvärs T-DNA eller insatsen (fig 7), för att selektera för positiva transformanter.
    1. I detta protokoll använder direkt PCR med en initial tag i 24 ° C, därefter 2 minuter vid 98 ° C, följt av 40 cykler av (98 ° C under 10 sek, glödgning steg för 15 sek, och ett förlängningssteg vid 68 ° C). Utför en slutlig förlängningssteg vid 68 ° C under 5 min följt av en obestämd uppehåll vid 4 ° C. (Se tabell 1 för detaljer om primers, glödgningstemperaturer och förlängningstider för cykler).
  7. Identifiera positiva trans och odla dem till förfall. Om fröna grodde i MS-medium, transplantation till jord i en större kruka (Figur 5).

Representative Results

Figur 1-4 illustrerar några av stegen inom det protokollet. I figur 1 och 2, bladen runt blomställning knoppar skärs att exponera dem till Agrobacterium cellerna och de olika knopp stegen som användes för att utveckla protokollet. Figur 3 visar processen av lin blommig-dip. Figur 4, visar en exempel på hur de viktigaste och sidogrenar kan märkas och hur enskilda blommor kan spåras och identifieras. Figur 5 visar hur T1 avkommor kan gro på MS växtmedier och sedan transplanteras till jord att förfall. Figur 6 illustrerar hur vild typ lin kan undgå höga koncentrationer av kanamycin, vilket bekräftar tidigare resultat i litteraturen 6,9,14.

Figur 7 visar ett exempel på direkt PCR-amplifiering från positiva T1 transformanter. De T1 blommor samlades från main och sidoskott av en enda T0 anläggning. Som framgår av den direkta PCR, 8/12 T1 växter testade positivt med PCR och har förstärks de olika regionerna i hela T-DNA. Våra primers också utformade mellan LIS-1 insats och de multipla kloningsställen (Figur 7B och C). Vi använde ytterligare primrar från växten binära vektorn att amplifiera olika segment av T-DNA, såsom den vänstra gränsen och NOS-terminatorn (data ej visade) eller den högra gränsen och kloningsstället multipla (Figur 7D). Primrar som är specifika för LIS-1 insert användes också i detta protokoll (data ej visade). En lista av primrar ges i tabell 1. Emellertid sekvenserna för dessa primrar beror på sekvensen för T-DNA-växt binära vektorn och insatsen som används till blomster-dip. Vi noterade också att det inte fanns någon signifikant skillnad i omvandlingen hastigheten mellan blommor som samlats in från de största och sidogrenar.


Figur 1. Kapning bladen runt de primära blomställning knoppar att utsätta dem för de Agrobacterim cellerna. (A) Knopparna är täckta av löv. (B) Löv har skurits runt knopparna att exponera dem. (C) Förstorad bild från anläggningen i (A) efter kapning att exponera knoppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. De olika knopp stadier som användes i detta protokoll för att bestämma den bästa scenen för att använda för den blommiga dopp. (A) I det tidiga skedet knoppen är approxima tely 2 mm. (B) Den mellersta stadiet knoppen är cirka 5 mm. (C) Den sena stadiet knoppen är ungefär ca 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Förfarande enligt lin blommig-doppning. (A) De primära blomställningar doppas i infiltrations media innehållande Agrobacterium cellerna. (B) Förstorad från (A). (C) De doppade plantor läggs plant tills nästa dag, och doppade grenar är täckta med plast för att upprätthålla hög luftfuktighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 4
. Figur 4. Processen för blomman spårning och frösamlingar, från T0 behandlade plantor (A) Ett exempel på hela anläggningen med huvudgrenen (den högsta grenen i mitten) och sidogrenar (B - D). En . exempel på blommorna från de olika grenarna (E) Ett exempel på frön som samlats in från enskilda blommor (märkta a - k). från huvudgrenen Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. T1 plantor odlas utan antibiotikaselektion. (A) T1 frön ärgro på MS anläggningen media. (B) Positiva trans, som bestäms genom direkt PCR, transplanteras till jord och växa till mognad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Antibiotika flykt, ett problem för T1 val, övervinns genom direkt PCR-screening. (A) Wild-typ linfrön grodde på MS växtmedier utan antibiotika. (B) vildtyp linfrön gro på MS växtmedier + ökande koncentrationer av kanamycin (200 mikrogram / ​​ml, 600 mikrogram / ​​ml, 1 mg / ml). (C) Wild-typ linfrön grodde på MS växtmedier med 2 mg / ml kanamycin. (D) PCR från vildtyp lin och T1 fröplanta användning av kanamycin primrar, alla amplsom du angav kanamycingenen (legender: EZ1: DNA markör, FlaxS, vildtyp flaxS, C: kontrollera icke-doppade gren, Ma: T1 avkomma från blomma "en" samlas in från huvudgrenen, Sc, Sd, Se, Sf: T1 avkommor av olika blommor "c, d, e, f" samlats in från sidogrenen, W:. nej-DNA) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. Exempel på lyckade PCR förstärkningar av T1 avkommor hjälp direkt PCR-metoden. (A) Diagram av växt binära vektorn + den klonade LIS-1 insats. Blå pilar indikerar läget för PCR-primers som används i den direkta PCR-screening (modifierad från Takara). (B) PCR med primrarna M13F + 3 '(C) PCR med primers M13R + 18a Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Framåt primersekvens källa sekvensen 5'-3 ' Omvänd primersekvens källa Sekvens 5'-3 ' Glödgning Temprature (° C) Förlängning Tid (sek) Förväntad storlek (bp)
M13F (T-DNA) CTGCAAGGCG
ATTAAGTTGG
3 '(LIS-1 insats) GAGGATGGAA
GATGAAGAAGG
57 40 450
18a (LIS-1 insats) TATTTTAACCC
M13R (T-DNA) ATTAGGCACC
CCAGGCTTTA
57 40 520
MCS (T-DNA) TGGTCATAGC
TGTTTCCTGTG
RB (T-DNA) TTTAAACTGA
AGGCGGGAAA
60 20 200
LB (T-DNA) TTTGATGGTG
GTTCCGAAAT
NOS (T-DNA) GAATCCTGTT
GCCGGTCTT
60 30 380
NPTII (T-DNA) GCGATACCGT
AAAGCACGAG
NTPII (T-DNA) GCTCGACGTT
GTCACTGAAG
65 45 502

Tabell 1. Några av de primrar som används för att direkt PCR-testning.

Discussion

I vissa växtarter, såsom lin (Linum usitatissimum), har framgångsrikt växttransformation varit begränsad. Tidigare har omvandling i lin krävs en Agrobacterium infektion genom att såra och samodling, tillämpning biolistiska partiklar eller använda ultraljud ultraljudsbehandling, följt av regenere; en process som är både långa och benägna att åtföljas av många mutationshändelser. Vidare, urvalsprocessen av dessa tekniker kräver användning av antibiotikaselektionsmarkörer såsom kanamycin. Det har dock noterats i litteraturen att denna urvalsmetod producerar många falska positiva, som lin tenderar att fly höga koncentrationer av antibiotika 6,9,14. En annan nackdel med de tidigare teknikerna för lin omvandling har varit den låga omvandlingshastigheter 2,6.

I det protokoll som beskrivs här, Agrobacterium-medierad växttransformation via blommig-doppning visasatt resultera i en hög omvandlingsfrekvens för lin (50-60%). Transform erhölls från blommor doppade och samlats in från huvud- och sidogrenar. Val av positiva trans var helt enkelt gjort genom att odla T1 växter på jorden och screening sina blad snart efter att de grodda, förbi användning av antibiotikaselektion, ett steg som tidigare använts som en norm i blommig-dipp till andra växtarter. Genom att utföra direkta PCR-testning av löv, och med användning av lämpliga T-DNA-primrar, kan positiva trans snabbt väljas. Denna teknik är enkel, billig och lätt att utföra, men resulterar i en mycket högre omvandlingshastighet än de som tidigare rapporterats för Arabidopsis och andra växtarter med denna metod 1,10,12. Det är också den högsta rapporterade omvandlingsfrekvens för lin.

Men det finns kritiska steg i förfaranden, inklusive valet av den bästa blomman scenen och den bästa koncentrationen tensid, så attAgrobacterium kan tränga in i växtceller utan att döda blomman organ. Om ett tidigt knoppstadiet används (Figur 2A) med hög Silwet-77 koncentration av mer än 0,05%, kommer blomman utvecklas inte heller ställa frön. Om sen knoppstadiet används (figur 2C), även om omvandlingen kan fungera, kommer det att inträffa vid en mycket lägre takt. Liknande resultat erhölls med Arabidopsis blommig dopp transformation 1,4. För detta protokoll, alla blommor skeden testade med olika Silwet-77 koncentrationer och den bästa scenen bestämdes vara mittknoppstadiet (figur 2C) med Silwet-77 på 0,05% för den första doppning, följt av en andra doppning vid sen knoppstadiet (figur 2C) med en något reducerad Silwet-77 koncentration på 0,03%. Omvandlingen fungerade också bra att använda tidiga knoppstadiet (Figur 2A) med en låg Silwet-77 koncentration av 0,003%, följt aven andra doppning med mittknoppstadiet (Figur 2B) vid högre Silwet-77 koncentration av 0,05%.

I detta protokoll har några andra parametrar försökt optimera omvandlingsfrekvens, men fann att inte ha några effekter på det slutliga resultatet. Exempel inkluderar förlänga tiden efter doppa att växterna låg på deras sida och täckt i plast från en dag till två dagar; med användning av en OD av mer än en för Agrobacterium kultur, istället för 0,5-1; ökande doppningstiden till 5-15 min i stället för 1 - 2 min. Igen har vi inte märkt någon effekt på omvandlingen hastigheten med hjälp av dessa strategier. De mest effektiva faktorerna var emellertid befunnits använda friska växter på rätt blomma steg, och med hjälp av den bästa Silwet-77 koncentration. Vi märkte att två avbländande intervaller, fungerar på något sätt bättre än en gång, trots att en gång doppa fungerar också.

Ändring av detta protokoll kan uppnås genom reducing den Silwet-77 koncentration till så lite som 0,003% i det andra eller tredje doppning. Eftersom Silwet-77 är giftigt, för hög koncentration resultat i blommorna utvecklas dåligt, vilket resulterar i något fröskörd. Doppfrekvensen kan reduceras till en, med andra eller tredje händelser elimineras om växterna inte ser frisk och knopparna inte utvecklas väl.

En viktig begränsning med denna teknik är det låga antalet blommor produceras av lin, det begränsade antalet frön som erhållits från varje blomma, och den långa livscykel lin. Det tar 6 - 8 veckor från frö sådd att ha de primära knoppar redo för första doppa och en ytterligare 8-10 veckor efter doppning att komma till T1 generationen. Totalt, ett intervall av 5 - behövs 6 månader för att erhålla T1 generation. Till skillnad från andra växtarter, vilket blomma som helst på året, vissa linsorter blomma bättre på specifika tider på året. Så genomtänkt planering för denna teknik är viktigt.

Agrobacterium - medierad växttransformation via floral-dip är en tillämplig och effektiv metod för lin transformation och kan användas för att ersätta de tidigare använda tekniker för lin transformation. De modifieringar av blommiga-dip-metoden i detta protokoll kommer att gälla för användning med andra växtarter och inte begränsat till lin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)
5" pots
Potting soil
Greenhouse with appropriate light setting
Thermocycler
Agarose gel electropheresis equipment
Digital imaging setup
Silwet-77 LEHLE SEEDS VIS-01 Toxic, wear gloves
GoTaq Green Master Mix Promega Part# 9PIM712
Terra PCR Direct Polymerase Mix Clontech 639270
Binary vector PRI 909 Takara 3260
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E Takara 9115
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4595-01
Sucrose Fisher Scientific
Electroporator and cuvettes Bio-Rad 165-2092
Shaker
Spinner
Plastic wrap and aluminum foil wrap
speedSTAR DNA polymerase Takara RR070A/B
QlAquick gel extraction kit Qiagen 28704
QIAGEN plasmid mini kit Qiagen 12123
SalI-HF enzyme NEB R3138S
SacI-HF enzyme NEB R3156S
T4 DNA ligation kit NEB M0202
Murashige Skoog Sigma M5524
Agar Fisher Scientific A360-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).
  2. Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).
  3. Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment. New Phytol. 167, 171-180 (2005).
  4. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (6), 735-743 (1998).
  5. Cullis, C. A. Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax. Ann Bot. 95, 201-206 (2005).
  6. Dong, J. Z., McHughen, A. An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens. Plant Sci. 88, 61-71 (1993).
  7. Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol. Plant Methods. 2, (16), (2006).
  8. Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::β-glucuronidase reporter gene expression. J Vis Exp. (40), (2010).
  9. Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -P., Pretova, A. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax. Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).
  10. Mu, G., et al. Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium. Biotechnology. 11, (3), 178-183 (2012).
  11. Trieu, A. T., et al. Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium. Plant J. 22, (6), 531-541 (2000).
  12. Yasmeen, A., et al. In Planta transformation of tomato. Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).
  13. Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).
  14. Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics