Floral-Dip Transformation von Flachs (

Biology
 

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Flachs Transformation unter Verwendung von Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation über Blumen-dip. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und kostengünstig ist, aber ergibt eine höhere Transformationsrate als die derzeit verfügbaren Methoden für Flachs Transformation.

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Bastaki, N. K., Cullis, C. A. Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate. J. Vis. Exp. (94), e52189, doi:10.3791/52189 (2014).

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Abstract

Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation über floral-dip ist eine weit verbreitete Technik, die in dem Gebiet der Pflanzentransformation und es wurde berichtet erfolgreich für viele Pflanzenarten sein. Allerdings hat Flachs (Linum usitatissimum) Transformation durch Blumentauch nicht berichtet. Ziel dieses Protokolls ist es, dass Agrobacterium zu etablieren und die Blumentauchverfahren kann verwendet werden, um transgene Flachs zu generieren. Wir zeigen, dass diese Technik ist einfach, kostengünstig, effizient und vor allem einen höheren Umwandlungsrate als die derzeit verfügbaren Verfahren der Flachs Transformation.

2 min - Zusammengefasst wurden Infloreszenzen Flachs aus einer Lösung von Agrobacterium, der einen binären Vektor Plasmid (T-DNA-Fragment plus dem Linum Insertionssequenz LIS-1) für 1 getaucht. Die Pflanzen wurden flach auf ihrer Seite für 24 Stunden festgelegt. Dann wurden die Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen bis zur nächsten Behandlung gehalten. Die proces3 mal mit ca. 10 - - Abständen von 14 Tagen zwischen Tauch s des Eintauchens wurde 2 wiederholt. Die T1-Samen wurden gesammelt und auf Erde keimen. Nach etwa zwei Wochen wurden behandelt Nachkommen durch direkte PCR getestet; 2 - 3 Blätter pro Pflanze und die entsprechenden T-DNA-Primer verwendet. Positive Transformanten wurden ausgewählt und zur Reife gezogen. Die Umwandlungsrate war unerwartet hoch, mit 50 bis 60% der Samen aus behandelten Pflanzen positiv Anten. Dies ist eine höhere Umwandlungsrate als die für Arabidopsis thaliana und andere Pflanzenarten, mit Blumen-dip Transformation berichtet. Es ist auch die höchste, die bisher berichtet wurde, für Flachs Transformation unter Verwendung anderer Methoden zur Transformation.

Introduction

Flachs (Linum usitatissimum) ist eine wichtige Kultur weithin bekannt für seine Fasern und Öle gewachsen. Transformation der Flachs Genom mit Techniken wie Verwundung Agrobacterium Infektion und Co-Kultivierung in der Gewebekultur unter Anwendung biolistische Teilchen oder Ultraschallbehandlungs anschließender Regeneration möglich. Jedoch haben diese Techniken viele Nachteile, einschließlich Neigung, viele Mutationsereignisse und eine längere Zeit, um die transgenen Linien erhalten. Einige dieser Verfahren können auch teuer sein und erfordern qualifizierten und effizienten Handhabung der Instrumente, was zu einer geringen Rückgewinnung Sämlinge. Am wichtigsten ist, diese Technik oft in niedrigen Transformationsraten von 2,6 führen.

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation über Blumen-dip ist eine einfache und effiziente Methode, um transgene Pflanzen zu erzeugen. Es wurde routinemßig und erfolgreich für viele Pflanzenarten wie Arabidopsis thalian verwendetein 1,4, Medicago truncatula 11, Tomaten 12, Weizen und Mais 13 10. Es hat sich jedoch nicht als eine praktikable Technik zur Flachs Transformation auf mehrere Faktoren zurückzuführen, wie die geringe Zahl von Blumen von Flachs hergestellt dacht, beschränkte Anzahl von Samen aus jeder Blume, die große Größe der Samen, und dem dicken Mantel erhalten, die ebenfalls problematisch für solche genetischen Transformationsprozesses sein könnte. Zusätzlich ist die Auswahl des Segments floral dip-Technik erfordert keim transformierte Samen auf einer Pflanze Medien ein Antibiotikum enthält, mit transformierten Nachkommen Abgrenzung aus ihre Keimfähigkeit und grün bleiben basiert, während nicht-transformierte Nachkommen entweder nicht keimen oder keimen aber Bleich schnell und sterben. In der aktuellen Literatur wurde festgestellt, daß Wildtyp-Flachs neigt zu hohen Konzentration des Antibiotikums Auswahlen zu entkommen, zu falsch-positiven Ergebnissen und der Auswahl von T1 Nachkommen basierendauf Antibiotikaresistenz schwieriger 6,14. Auch wenn eine hohe Konzentration des Antibiotikums zu dem Selektionsmedium zugegeben, die Rate der beobachteten Umwandlung dramatisch gesunken 9.

In diesem Protokoll haben wir Agrobacterium und den Blumentauchverfahren, um eine Linie von Faserflachs, Stormont Cirrus (reaktionsschnelle und Kunststoff), die gezeigt wurde, um Spannungen in der Umwelt durch die Veränderung seines Genoms 3,5 reagieren zu verwandeln. Um das Antibiotikum Flucht Problem zu lösen, die wir gewählt haben, indem Sie die Antibiotika für die Pflanze Medien direkte PCR-Tests von DNA aus T1 Blätter zu tun, anstatt Auswahl. Wir nutzten die einfache Anatomie der Flachs zu bestimmten Blüten zur Zeit der Behandlung zu verfolgen. Das Tracking-System erlaubt Auswahl von Saatgut von bestimmten Blumen und Keimen auf Böden ohne Zusatz von Antibiotika. Positive Transformanten wurden durch einfaches Testen DNA aus Blättern mit Hilfe der schnellen und effizienten Verfahren o erhalten identifiziertf direkte PCR. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Blumen-Tauchverfahren funktionierte sehr gut in dieser Linie von Flachs und überraschend ergab eine sehr hohe Umwandlungsrate (50-60%), höher als die zuvor für Arabidopsis thaliana, die berichtet wurde, zu sein beobachtet 0,1-1 % 1, und auch höher als bei anderen Pflanzenarten 10,12. Wir testeten auch eine weitere Vielzahl von Leinsamen (Öllein), Bethune (stabil und nicht mehr reagiert), und unsere vorläufigen Daten zeigen, dass Blumentauch funktioniert auch für diese Vielzahl von Flachs.

Das Ziel des Protokolls ist es, zu zeigen, dass Agrobacterium und blumig-dip kann verwendet werden, um transgene Flachs erzeugen. Wir zeigen, dass diese Technik ist einfach, kostengünstig, und schneller als andere Verfahren der Flachs Transformation. Noch wichtiger ist es ergibt sich eine wesentlich höhere Umsatzrate als die anderen Verfahren der Flachs Transformation 2,6. Die Anatomie der Arabidopsis thaliana, die viele Filialen und Blumen hat, makes es schwierig, eingetaucht zu unterscheiden, und nicht getaucht Blüten auf derselben Pflanze. Daher eine große Anzahl von Samen, ca. 20.000 Samen pro Pflanze, müssen untersucht, um positive Trans 8 zu identifizieren. Flachs, auf der anderen Seite, hat weniger Niederlassungen (ein Hauptzweig und ein paar Seitenzweige) und weniger Blumen, produziert ca. 100 Samen pro Pflanzen, die es möglich, einzelne Blumen zu verfolgen und bestimmte Samen während der Screening-Verfahren zu wählen ist.

Wir schlagen vor, blumig-Dip ist eine anwendbare Methode, um alle verwandten Arten von Flachs, eine Gattung von etwa 200 Arten zu verwandeln. Dieses Verfahren ergibt wesentlich höhere Umsatzrate als andere Methoden der Flachs Transformation. Außerdem schlagen wir, dass der direkte PCR-Screening von T1 Blatt DNA ist ein effizienter Weg, um das Problem der Antibiotikaresistenz Flucht, die oft produziert viele False Positives zu überwinden. Direkte PCR-Screening können zu anderen Pflanzenarten angewendet werden und ist nicht auf to Flachs. Die einfache Samenverfolgungstechnik in diesem Protokoll verwendet wird, kann auf andere Pflanzenarten mit Verzweigungen Anatomie ähnlich wie Flachs verwendet werden.

Protocol

1. Wachsende die Pflanzen

  1. 6 Wochen vor dem Eintauchen, füllen 5-Zoll-Töpfe mit Erde und säen Leinsamen ¼ Zoll tief in den Boden (4 Samen pro Topf). Achten Sie darauf, den Boden in den Samen festigen. Wasser die Pflanzen regelmäßig und halten sie in langen Tageslicht (14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit).
  2. Überprüfen Pflanzen regelmäßig auf primäre Blütenstände (Cluster von Organen Blumen '). Die Pflanzen sind bereit für die Transformation, wenn die Knospen sichtbar und haben gerade in der Blütenstand (Abbildung 1 und 2) gebildet. Um die Knospen zu sehen, schneiden Sie die Blätter um ihn gegebenenfalls.
    HINWEIS: Mit der besten Blumen Bühne ist von entscheidender Bedeutung und wird in der Diskussion beschrieben.
    1. Verwenden Sie die Hauptgeschäftsstelle der Anlage für die experimentelle Behandlung, wie es produziert mehr Blumen als die Seitenzweige. Verwenden Sie die Seitenzweige entweder als Kontrollen (nicht getaucht werden) oder für andere experimentelle Behandlungen.
    2. Alternativ können Sie die Haupt- und Nebenzweige derelbe Anlage für die experimentelle Behandlung und eine andere Anlage als Kontrolle oder für andere experimentelle Behandlungen. Verwenden Sie Etiketten auf einzelne Branchen und einzelnen Blüten mit dem Datum und Art der Behandlung zu markieren.

2. Klonierung und Transformation in Escherichia coli (E. coli) Zellen

  1. Klonen des Fragments / Gen von Interesse in die multiple Klonierungsstelle eines Pflanzen binären Vektor, der die T-DNA.
    1. Führen Klonierung in einem Schritt oder in zwei Schritten.
      1. Direkt klonen kleine Einsätze in diesem Protokoll (~ 500 bp) in die Anlage binären Vektor. In diesem Protokoll, verwenden Sie die Anlage binären Vektor (PRI909). Ansonsten benutzen Sie keine anderen Pflanzen binären Vektoren in einer ähnlichen Strategie.
      2. Alternativ klonen große Einsätze (≥6.5 kb) in zwei Schritten: Zuerst mit einem allgemeinen kommerziellen Klonierungskit (nicht pflanzen spezifisch), dann in die Anlage Binärvektor subklonieren.
  2. Richten Sie eine PCR reaction, das Gen von Interesse zu amplifizieren. Design der Primer mit Restriktionsschnittstellen am 5'-Ende (gemäß der Mehrfach-Klonierungsstelle des Pflanzen binären Vektor in Gebrauch).
    1. Durchführen einer Standard-PCR unter Verwendung genomischer DNA Flachs mit den folgenden Zyklusbedingungen: eine erste Halte von 24 ° C und dann 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 98ºC für 5 s, 60 ° C für 15 sec, und 72 ° C für 2 min. Durchführen einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 5 min, gefolgt von einem unbestimmte Zeit bei 4 ° C.
    2. Separate PCR-Produkte auf 1% Tris / Borat / EDTA (TBE) Agarose-Gel, führen Sie das Gel bei 100 V für 1 Stunde. Reinige die Produkte aus dem Gel und Quantifizierung über Nanodrop.
  3. Einrichten des Ligierungsgemisch, das PCR-Produkt in der kommerziellen Klonierungsvektor zu klonieren. Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
  4. Wandeln Sie die Ligationsmischung in chemisch kompetente E. coli-Zellen wie folgt.
    1. Add 2 ul der Ligationsmischung in eine Durchstechflasche chemically kompetente E. coli-Zellen. Inkubieren auf Eis für 30 min.
    2. Hitzeschock der Zellen für 30 sec bei 42 ° C (Wärmeschock Zeit und Temperatur hängt von der Art der verwendeten Zellen).
    3. Inkubieren auf Eis und fügen Sie 250 ul RT SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) Medium.
    4. Das Röhrchen und Inkubation in einem Orbitalschüttler bei 200 Upm bei 37 ° C für eine Stunde.
    5. Verbreiten 10-50 ul von jeder Transformation an eine vorgewärmte LB-Platte (bei 37 ° C vorgewärmt) + geeigneten selektiven Antibiotikums (Bestimmung der selektiven Antibiotikum auf der Grundlage des Typs von kommerziellen Klonierungsvektor). Inkubiere Platten bei 37 ° CO / N.
  5. Wählen ~ 10 Kolonien für Mini-prep Plasmidreinigung, Verwendung eines kommerziellen Kits. Mini prep Plasmidreinigung ist in der Regel wie folgt durchgeführt.
    HINWEIS: Puffernamen sind spezifisch für den kommerziellen Kits verwendet, aber ihre allgemeine Funktionen sind ähnlich.
    1. Impfen Sie die einzelnen Kolonien in 2- 5 ml LB-Medium, das die geeigneten selektiven Antibiotikums (bestimmt basierend auf dem Typ der kommerziellen Vektor verwendet).
    2. Inkubieren für ungefähr 8 Stunden bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln (~ 300 rpm).
    3. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 min.
    4. Das Pellet in 250 ul Resuspensionspuffer. Mischen Sie und Wirbel um das Pellet vollständig zerstreuen.
    5. Lyse der Bakterienzellen durch Zugabe von 250 & mgr; l des Lysepuffers, gründlich durch Umdrehen der Röhrchen 4-6 mal.
    6. Neutralisieren des Lysats in der Neutralisationspuffer und Invertzucker 4-6 mal zu mischen. Zentrifuge für 10 min bei ~ 17.900 xg auf einer Tischmikrozentrifuge.
    7. Die Überstände aus dem vorherigen Schritt zu einer Spin-Säule. Zentrifuge wieder bei ~ 17.900 g für 30 bis 60 Sekunden.
    8. 60 Sekunden - durch Zugabe von 0,75 ml Waschpuffer und Zentrifuge für 30 Waschen Sie die Spin-Säule. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
    9. Zentrifuge für eine zusätzliche 1 min bis remove Waschpufferrückstände. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Zum Eluieren der DNA 50 ul Wasser in die Mitte der einzelnen Spalten. Lassen Sie stehen für 1 min, und Zentrifuge für 1 min.

3. Analysieren Sie den gereinigten Plasmide für die Anwesenheit von Insert

  1. Restriktionsverdau:
    1. Einrichten eines Restriktionsverdaus, um die Anwesenheit des Inserts durch Verdau des Plasmids mit Restriktionsenzymen verwendet, um den Einsatz zu klonieren bestimmen. Eine typische Doppel Restriktionsverdau Reaktion wie folgt: 1 & mgr; g von gereinigtem Plasmid, 1 ul jeder Restriktionsenzymen, 2 ul 10x Restriktionsverdauungspuffer + 2 & mgr; l BSA (falls zutreffend), X & mgr; l Wasser (auf insgesamt 20 & mgr; l)
    2. Vorsichtig mischen und inkubieren Sie bei empfohlene Temperatur (variiert von einem Enzym zu einem anderen).
    3. Analysieren Sie die Restriktionsverdau Reaktion auf 1% TBE-Agarose-Gel, bei 100 V für 1 Stunde laufen und suchen Sie drop-out von geeigneter Größe.
  2. PCR-Analyse:
    1. Einrichten einer PCR mit dem gereinigten Plasmid unter Verwendung von Primern aus dem kommerziellen Vektor Region im Inneren des Einsatzes oder der Verbindungsstelle zwischen dem Vektor und dem Insert zu amplifizieren. Gemeinsame Primer M13 Vorwärts- und Rückwärts und T3 / T7 Primer.
    2. In diesem Protokoll, die folgenden PCR-Zyklusbedingungen: eine erste Halte von 24 ° C und dann 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 18 Zyklen bei 98 ° C für 5 Sekunden, 60 ° C für 15 sec, und 72 ° C für 2 min. Durchführen einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 5 min, gefolgt von einem unbestimmte Zeit bei 4 ° C.
    3. Last PCR-Produkte auf einem 1% TBE Agarosegel und 100 laufen - 120 V für 1 Stunde.
  3. Sequenzierung:
    1. Senden Sie die gereinigte Plasmid-Sequenzierung zu einem kommerziellen Anlage zu analysieren und bestätigen die Anwesenheit des Inserts.
    2. Sobald das korrekte Konstrukt erhalten wird, diese für den zweiten Schritt der Klonierung (in die Anlage binären Vektor).
      Hinweis: Die Schritte 2,3-3,3können eliminiert werden, wenn die Klonierung in einem Schritt durchgeführt.

4. Klonierung in die Pflanzen Binary Vector (PRI909) und E. coli Transformation

  1. Einrichten eines Doppel Restriktionsverdau Reaktionen auf die Pflanze binären Vektor zu linearisieren und zu isolieren, das zuvor klonierte Insert unter Verwendung der gleichen Restriktionsenzymstellen, die zu den Primern (Schritt 2.2) zugegeben.
  2. Analysieren Sie die Restriktionsverdaus mittels Gelelektrophorese, bei 100 V für 1 ausgeführt - 2 Std. Schneiden des Einsatzes und des lineaPflanzen binären Vektor aus dem Gel.
  3. Verwenden eines kommerziellen Kits, um die Gel-Produkte zu reinigen. Siehe Wartungshandbuchs.
  4. Einrichten einer Ligationsreaktion, um den Einsatz in die Pflanze binären Vektor zu ligieren. Das Insert in Vektor-Verhältnis hängt von der Größe des Einsatzes und der Pflanze binären Vektor. In diesem Protokoll war die LIS1 Einsatz 6,5 kb und die Pflanze Binärvektor betrug 9 kb. So verwenden Sie eine 1: 2-Einsatz auf Vektor Verhältnis.
  5. die Schritte 2,4 bis 3 für die bakterielle Transformation Plasmid-Reinigung und Analyse. Sobald die korrekte Konstrukt (Einsatz + Pflanzen binären Vektor) erhalten wird, an die Elektroporation in Schritt 5 fortfahren.

5. Die Elektroporation in Agrobacterium tumefaciens Elektrisch Competent Cells

  1. Tauwetter ein Fläschchen von Agrobakterium tumefaciens elektrisch kompetente Zellen auf Eis.
  2. 1 ng binären Vektor Plasmid-DNA und 20 ul kompetenter Zellen, auf Eis, und vorsichtig mischen.
  3. Kühlen Sie ein 0,1 cm Elektroporationsküvette auf Eis.
  4. Übertragen Sie die kompetente Zelle / DNA-Mischung zu den Elektroporationsküvetten, und tippen Sie auf, um die Mischung am Boden zu sammeln. Setzen der Küvette im Elektroporator Maschine Impulses (Spannung und Zeit hängen von der Größe der Küvette und dem verwendeten Elektroporator).
  5. Zugabe von 1 ml SOC-Medien und Übertragungszellen in ein 15 ml Röhrchen.
  6. Inkubieren für 1 h bei 28 bis 30° C, bei 100 Umdrehungen pro Minute schütteln. Teller von 50 bis 100 & mgr; l der Zellen auf LB-Agar + geeigneten selektiven Antibiotikums (abhängig von dem Anlagen binären Plasmids und der Stamm von Agrobacterium verwendet In diesem Protokoll Verwendung 50 ug / ml Kanamycin und 100 ug / ml Streptomycin.).
  7. Inkubiere die Platten bis zu 48 h bei 28 - 30 ° C.
  8. Wiederholen Sie Schritt 2.5 für Kolonieselektion und Plasmidreinigung.
  9. Schritt 3, um das Plasmid zu analysieren und um die Integrität des Einsatzes und T-DNA vor der Verwendung des Konstrukts für Blumentauch überprüfen. Wiederholen Sie Schritt 3.2, unter Verwendung mehrerer PCR-Primer, der im gesamten Einsatzbereich und für die T-DNA-Bereiche und durch Sequenzieren wie in Schritt 3.3.
    HINWEIS: In diesem Protokoll 4 verschiedene Primer wurden für die T-DNA und 10 Primer in der Einlage ausgebildet ist.
  10. Sobald das Vorhandensein von Pflanzen Binärplasmid im ausgewählten Agrobacterium Kolonie wird bestätigt, Ortszellen in 50% Glycerin und bei -80 ° C. Speicher verbleibenden Kolonien auf der Platte bei 4 ° C, wenn sie sich innerhalb einer Woche 7 verwendet werden sollen.

6. Floral-Dipping

HINWEIS: 2 Tage vor der blumig-Tauchen:

  1. Wachsen Agrobacterium Zellen der stationären Phase (OD 600 zwischen 0,5 bis 1 ist annehmbar) in LB + Antibiotika in geeigneten flüssigen Medien.
    ANMERKUNG: Dies sind die gleichen Antibiotika wie im Schritt 5.6, bezogen auf die Pflanzen binären Vektor und dem Typ des Agrobacterium-Stamm verwendet.
  2. Starten der Kultur mit 1: 100-Verdünnungen von einer gesättigten (5 ml) O / N-Kultur wachsen und für 24 - 48 h bei 28-30 ° C unter Schütteln bei 150 rpm. Die Kultur sollte die midlogarithmic Phase erreicht haben und wahrscheinlicher werden nähern oder stationären Phase 1. OD von etwa 0,8 (wieder OD zwischen 0,5 bis 1 sind alle annehmbar) 8. Sammle die Zellen durch Zentrifugieren bei 5.000 xg bei RT.
  3. Die Zellen in Infiltrationsmedium (5,0% Sucrose + 0,05 bis 0,003% Silwet L-77). Für die erste Runde des Eintauchens, verwenden Sie 0,05% Silwet-77. Für die zweite und dritte Runde, ist die Konzentration auf 0,03% (in der Diskussion beschrieben).
  4. Fahren Sie mit der Blumentauchschritt. Legen Sie die Anlage auf die Seite und tauchen nur die sichtbaren Knospen in der Infiltrationsmedium für 1-2 min. Lassen Sie die Anlage auf die Seite, und decken Sie es mit Plastikfolie mit hoher Luftfeuchtigkeit in der Kuppel (Bild 3) zu erhalten.
  5. Am nächsten Tag, setzen Sie die Anlage in einer aufrechten Position und in der Regel erhalten.
  6. Wenn die Knospe größer wird (in der Regel nach etwa 10 bis 14 Tage), wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,4. Reduzieren Sie die Eintauchzeit auf 30 bis 60 sec und Silwet-77-Konzentration auf 0,003%.
  7. Pflegen Sie die Pflanzen in der Regel bis zu ihrem Samen sind reif und bereit, gesammelt werden (Abbildung 4).

7. Auswahl Positive Transformants mit Direct PCR

  1. Säen Sie die T1-Samen auf den Boden, wie in Schritt 1.1.
    1. Alternativ machen Murashige und Skoog basalen Salzmedium (MS-Medium) durch Zugabe von 2,2 g MS-Medium + 4 g Agar-Agar in 500 ml Wasser. Autoklavieren und gießen Sie in kleinen Pflanztöpfen. Halten Sie in der 4 ° C bis zur Verwendung.
    2. Säen Sie den Samen, indem sie auf der verfestigten MS-Medium. Halten Sie im Rahmen lang Tageslicht (14 Stunden Licht und 10 h Dunkelheit). 6 Tage (Figur 5) - Samen wird in etwa 4 keimen.
    3. Verwenden Sie eine Saatgut aus jeder Blume als Ausgangspunkt. Wenn keine positive Transformante erhalten wird, wiederholen Sie diesen Schritt durch Auswahl einen anderen Samen aus der Blüte.
      Hinweis: Testen Sie verschiedene Samen aus den gleichen Blumen, weil in einigen Fällen nicht alle Samen von einer Blume verwandelt werden. Auswahl zusätzlicher Samen aus experimentellen Blüten ist manchmal notwendig.
  2. Überprüfen Sie auf der Sämlinge regelmäßig. In etwa 10 bis 14 Tage nach der Keimung, wenn wahrBlätter entwickeln, testen Sie die Pflanzen mit direkter PCR.
  3. Bereiten Sie das Blatt DNA-Extrakt, indem 2-3 Blätter (5-10 mg Gewicht) von jedem Keimling und legen Sie sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. Hinzufügen 180 ul 50 mM NaOH zu jedem Röhrchen und Inkubation für 10 min bei 95 ° C.
  5. Neutralisieren des Extrakts durch Zugabe von 20 ul 1 M Tris-HCl (pH 8,0).
  6. Verwenden 1 ul des Extraktes in der direkten PCR-Reaktion unter Verwendung von Primern für die T-DNA oder dem Einsatz (7) ausgebildet ist, um positive Transformanten ausgewählt.
    1. In diesem Protokoll verwenden direkte PCR mit einem anfänglichen Halten bei 24 ° C und dann 2 min bei 98 ° C, gefolgt von 40 Zyklen (98 ° C für 10 sec, Glühschritt für 15 sec, und einem Extensionsschritt bei 68 ° C). Durchführen einer abschließenden Extensionsschritt bei 68 ° C für 5 min, gefolgt von einer unbestimmten Halten bei 4 ° C. (Siehe Tabelle 1 für weitere Einzelheiten auf Grundierungen, Glühtemperaturen und Verlängerungszeiten für die Zyklen).
  7. Identifizieren positive Transformanten und wachsen sie bis zur Endfälligkeit. Wenn die Samen wurden in MS-Medium, Transplantation in den Boden in einem größeren Topf gekeimt (Abbildung 5).

Representative Results

Bild 1 - 4 veranschaulichen einige der Schritte in dem Protokoll. In den Figuren 1 und 2 sind die Blätter um die Blütenknospen werden geschnitten, um sie zu den Agrobacterium-Zellen und den verschiedenen Stadien Knospe, die verwendet wurden, um das Protokoll zu entwickeln aussetzen, Fig. 3 zeigt den Prozess der Flachs floral-dip. Figur 4 zeigt ein Beispiel dafür, wie die Haupt- und die Seitenzweige können markiert sein, und wie einzelne Blumen können aufgespürt und identifiziert werden. Figur 5 zeigt, wie die T1-Nachkommen können auf den MS Pflanzenmedien gekeimt und dann in Erde für Reife transplantiert. 6 veranschaulicht, wie Wild Typ Flachs können hohe Konzentrationen an Kanamycin entkommen, bestätigt frühere Befunde in der Literatur 6,9,14.

7 zeigt ein Beispiel einer direkten PCR-Amplifikation aus positiven Transformanten T1. Die T1 Blumen wurden aus dem m gesammeltain und Seitentriebe eines einzelnen T0 Anlage. Wie aus der direkten PCR erkennen, getestet 8/12 T1 Pflanzen positiv durch PCR und haben die verschiedenen Regionen der T-DNA amplifiziert. Unsere Primer wurden auch zwischen den LIS-1-Einsatz und die multiple Klonierungsstellen (7B und C). Wir verwendeten zusätzlichen Primern, die aus der Pflanze binären Vektor zu verschiedenen Segmenten der T-DNA, wie dem linken Rand und dem NOS-Terminator (Daten nicht gezeigt) oder der rechte Rand und der multiplen Klonierungsstelle (7D) zu verstärken. Spezifisch für die LIS-1-Einsatz Primer wurden auch in diesem Protokoll verwendet werden (Daten nicht gezeigt). Eine Liste der Primer sind in Tabelle 1 bereitgestellt. Die Sequenzen dieser Primer ist jedoch abhängig von der Sequenz des T-DNA-Pflanzen binären Vektor und dem für den Blumentaucheinsatz verwendet. Wir auch festgestellt, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Umwandlungsrate zwischen Blumen von den Haupt- und Nebenzweigen gesammelt.


Abbildung 1. Schneiden Sie die Blätter um die primäre Blütenknospen werden, sie den Agrobacterim Zellen ausgesetzt werden. (A) Die Knospen werden von Blättern bedeckt. (B) Blätter gibt es schon die Knospen wurden geschnitten, um sie zu entlarven. (C) Bild Vergrößerte aus Pflanzen in (A) nach dem Schneiden zu Knospen aus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Die verschiedenen Stufen der Knospe, die in diesem Protokoll verwendet wurden, um die beste Bühne, um für die floral dip verwenden zu bestimmen. (A) Die Bühne Knospe früh ist approxima dig 2 mm. (B) Die Bühne Knospe Mitte beträgt ca. 5 mm. (C) Das Spätstadium Knospe ist ungefähr 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3: Der Prozess der Flachs Blumen-Tauchen. (A) Die primären Blütenstände sind in den Medien, die Infiltration die Agrobacterium Zellen getaucht. (B) (A) vergrößert. (C) Die eingetauchten Pflanzen werden bis zum nächsten Tag flach gelegt, und die eingetaucht Niederlassungen sind mit Kunststoff zu halten bedeckt hoher Luftfeuchtigkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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. Abbildung 4. Der Prozess der Verfolgung und Blumensamen Sammlungen, aus den T0 behandelten Pflanzen (A) Ein Beispiel für die gesamte Anlage mit dem Hauptzweig (der höchste Zweig in der Mitte) und die Seitenarme (B - D). Ein . Beispiel für die Blumen aus den verschiedenen Zweigen (E) Ein Beispiel für die von den einzelnen Blumen gesammelten Samen (bezeichnet eine - k). aus dem Hauptzweig Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Die T1-Keimpflanzen ohne antibiotische Selektion entwickelt. (A) T1-Samen sindauf der MS-Anlage Medien gekeimt. (B) Positive Transformanten, wie durch direkte PCR bestimmt werden, um Erde gepflanzt und bis zur Reife gezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 6
Abbildung 6. Antibiotika Flucht, ein Problem für die T1-Auswahl, wird durch direkte PCR-Screening zu überwinden. (A) Wildtyp-Leinsamen ohne Antibiotikum keimten auf MS-Anlage Medien. (B) Wildtyp-Leinsamen auf MS-Anlage Medien + steigende Konzentrationen gekeimt Kanamycin (200 ug / ml, 600 ug / ml, 1 mg / ml). (C) Wildtyp-Leinsamen auf MS-Anlage Medien aus Wildtyp-Flachs und T1 gekeimt mit 2 mg / ml Kanamycin. (D) PCR Sämling unter Verwendung von Kanamycin-Primer, die alle amplified die Kanamycin-Gen (Legenden: EZ1: DNA-Marker, FlaxS, Wildtyp flaxS, C: Kontrolle nicht getaucht Zweig, Ma: T1-Nachkommenschaft von Blume "a" von der Hauptgeschäftsstelle gesammelt, Sc, Sd, Se, Sf: T1 Nachkommen von verschiedenen Blumen "c, d, e, f" von der Seitenzweig, W gesammelt:. no-DNA) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

7
Abbildung 7. Ein Beispiel für eine erfolgreiche PCR-Amplifikationen von T1 Nachkommen nach der direkten PCR-Methode. (A) Schematische Darstellung der Anlage Binärvektor + des geklonten LIS-1-Einsatz. Blaue Pfeile zeigen die Position der in der direkten PCR-Screening (von Takara modifiziert) verwendeten PCR-Primer. (B) PCR mit Primern M13F + 3 '(C) PCR mit Primern M13R + 18a Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Forward-Primer-Sequenz Quelle Sequenz 5'-3 ' Reverse-Primer-Sequenz Quelle Sequenz 5'-3 ' Annealing Temprature (° C) Erweiterung Time (Sec) Erwartete Größe (bp)
M13F (T-DNA) CTGCAAGGCG
ATTAAGTTGG
3 '(LIS-1 Einsatz) GAGGATGGAA
GATGAAGAAGG
57 40 450
18a (LIS-1 Einsatz) TATTTTAACCC
M13R (T-DNA) ATTAGGCACC
CCAGGCTTTA
57 40 520
MCS (T-DNA) TGGTCATAGC
TGTTTCCTGTG
RB (T-DNA) TTTAAACTGA
AGGCGGGAAA
60 20 200
LB (T-DNA) TTTGATGGTG
GTTCCGAAAT
NAG (T-DNA) GAATCCTGTT
GCCGGTCTT
60 30 380
NPTII (T-DNA) GCGATACCGT
AAAGCACGAG
NTPII (T-DNA) GCTCGACGTT
GTCACTGAAG
65 45 502

Tabelle 1 Einige der für die direkte PCR Tests verwendeten Primer.

Discussion

Bei einigen Pflanzenarten, wie Flachs (Linum usitatissimum), erfolgreich Pflanzentransformation begrenzt. Zuvor hat Transformation Flachs eine Agrobacterium-Infektion erforderlich durch Verwundung und Kokultivierung Anwendung biolistischen Partikel oder mittels Ultraschall Ultraschallbehandlung, gefolgt von der Regeneration; ein Prozess, der sowohl Long- als auch anfällig für ist von vielen Mutationsereignisse begleitet. Außerdem ist die Auswahl dieser Techniken ist die Verwendung von Antibiotika-Selektionsmarkern, wie Kanamycin. Es hat sich jedoch in der Literatur, die diese Methode der Wahl produziert viele False Positives, wie Flachs neigt dazu, hohe Konzentrationen von Antibiotika 6,9,14 entkommen festgestellt worden. Ein weiterer Nachteil der bisherigen Verfahren Flachs Transformation war die niedrigen Transformationsraten 2,6.

In dem hier beschriebenen Protokoll wurde Agrobacterium vermittelte Pflanzentransformation über floral Tauch gezeigten(- 60% 50), um in einer hohen Umwandlungsrate für Flachs führen. Transformanten wurden von den Blumen getaucht und von Haupt- und Nebenzweigen gesammelt werden. Selektion positiver Transformanten wurde einfach dadurch T1 Pflanzen auf Erde und Screening ihre Blätter, kurz nachdem sie gekeimt, unter Umgehung der Verwendung von Antibiotika-Selektion durchgeführt, wird ein Schritt zuvor als Norm in floral dip-für andere Pflanzenarten eingesetzt. Durch Durchführen direkter PCR Tests der Blätter, und unter Verwendung der geeigneten T-DNA-Primer können positive Transformanten rasch ausgewählt werden. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und leicht durchzuführen, jedoch ergibt sich eine wesentlich höhere Umsatzrate als die bisher für Arabidopsis und anderen Pflanzenspezies berichtet unter Verwendung dieses Verfahrens 1,10,12. Es ist auch der höchste gemeldete Transformationsrate für Flachs.

Es gibt aber kritische Schritte in den Verfahren, einschließlich der Auswahl der besten Blumen Stufe und dem am besten Tensidkonzentration, so dassdie Agrobacterium kann ohne Tötung der Blütenorgane in die Pflanzenzellen eindringen. Wenn ein frühes Knospenstadium mit hoher Silwet-77-Konzentration von mehr als 0,05% verwendet (Abbildung 2A), wird die Blume nicht zu entwickeln, noch setzen Samen. Wenn späten Knospenstadium verwendet wird (2C), obwohl die Transformation funktionieren könnte, wird es zu einem viel niedrigeren Preis erfolgen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Arabidopsis floral dip Transformation 1,4 erhalten. Aus diesem Protokoll wurden alle Blumenstufen mit unterschiedlichen Silwet-77-Konzentrationen getestet und die beste Bühne war entschlossen, das mittlere Knospenstadium (2C) mit Silwet-77 bei 0,05% für das erste Eintauchen, gefolgt von einem zweiten Eintauchen in der späte Knospenstadium (2C) mit einer leicht reduzierten Silwet-77-Konzentration von 0,03%. Die Transformation arbeitete auch mit dem frühen Knospenstadium (2A) mit einem niedrigen Silwet-77-Konzentration von 0,003%, gefolgt voneinen zweiten Tauch mit mittleren Knospenstadium (2B) bei höheren Silwet-77-Konzentration von 0,05%.

In diesem Protokoll wurden einige weitere Parameter versucht, die Umwandlungsgeschwindigkeit zu optimieren, aber festgestellt, dass keine Auswirkungen auf das Endergebnis haben. Beispiele hierfür sind die Verlängerung der Zeit nach dem Eintauchen, dass die Pflanzen lag auf ihrer Seite und in Kunststoff von einem Tag bis zwei Tage überzogen; Verwendung einer OD von mehr als 1 für Agrobacterium-Kultur, anstelle von 0,5 - 1; Erhöhung der Eintauchzeit zum 5 - 15 Minuten anstelle von 1 bis 2 min. Auch hier haben wir keinen Einfluss auf die Transformationsrate mit Hilfe dieser Strategien nicht bemerkt. Die wirksamsten Faktoren wurden jedoch festgestellt, dass mit gesunden Pflanzen an den richtigen Blumen Stufen und mit den besten Silwet-77-Konzentration. Uns ist aufgefallen, dass zwei Tauch Abständen funktioniert irgendwie besser als einmal, auch wenn einmal Tauchen funktioniert auch.

Änderungen an diesem Protokoll kann durch Reducin erreicht werdeng die Silwet-77-Konzentration auf weniger als 0,003% in der zweiten oder dritten Eintauchen. Seit Silwet-77 ist giftig, eine zu hohe Konzentration führt in den Blüten entwickeln schlecht, so dass keine Samenertrag. Die Tauchfrequenz kann auf einen reduziert werden, wobei die zweite oder dritte Ereignisse eliminiert werden, wenn die Pflanzen nicht gesund und die Knospen sind nicht gut entwickelt.

Eine wichtige Einschränkung dieser Technik ist die geringe Anzahl von Blumen am Flachs, der begrenzten Anzahl von Samen von jeder Blume erhalten, und die lange Lebensdauer von Flachs hergestellt. Es dauert 6-8 Wochen nach Aussaat, um die primären Knospen bereit für den ersten Eintauchen und eine zusätzliche 8 haben - 10 Wochen nach dem Eintauchen in die T1-Generation erhalten. Insgesamt ein Bereich von 5 - 6 Monate benötigt, um die T1-Generation erhalten. Im Gegensatz zu anderen Pflanzenarten, die Blumen zu jeder Zeit des Jahres, einige Flachssorten blühen besser zu bestimmten Zeiten des Jahres. So durchdachte Planung für diese Technik ist wichtig.

Agrobacterium - vermittelte Pflanzentransformation über floral-Dip ist ein praktisches und effizientes Verfahren für Flachs Transformation und kann verwendet werden, um die zuvor verwendeten Techniken für Flachs Transformation ersetzen. Die Änderungen des Blumentauchverfahren in diesem Protokoll werden die für die Verwendung mit anderen Pflanzenarten und nicht auf Flachs begrenzt sein.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)
5" pots
Potting soil
Greenhouse with appropriate light setting
Thermocycler
Agarose gel electropheresis equipment
Digital imaging setup
Silwet-77 LEHLE SEEDS VIS-01 Toxic, wear gloves
GoTaq Green Master Mix Promega Part# 9PIM712
Terra PCR Direct Polymerase Mix Clontech 639270
Binary vector PRI 909 Takara 3260
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E Takara 9115
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4595-01
Sucrose Fisher Scientific
Electroporator and cuvettes Bio-Rad 165-2092
Shaker
Spinner
Plastic wrap and aluminum foil wrap
speedSTAR DNA polymerase Takara RR070A/B
QlAquick gel extraction kit Qiagen 28704
QIAGEN plasmid mini kit Qiagen 12123
SalI-HF enzyme NEB R3138S
SacI-HF enzyme NEB R3156S
T4 DNA ligation kit NEB M0202
Murashige Skoog Sigma M5524
Agar Fisher Scientific A360-500

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References

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