Evaluación de la viabilidad de la inyección de grasa humana en ratones desnudos con micro-tomografía computarizada

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Atashroo, D. A., Paik, K. J., Chung, M. T., McArdle, A., Senarath-Yapa, K., Zielins, E. R., Tevlin, R., Duldulao, C. R., Walmsley, G. G., Wearda, T., Marecic, O., Longaker, M. T., Wan, D. C. Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography. J. Vis. Exp. (95), e52217, doi:10.3791/52217 (2015).

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Abstract

Trasplante de grasa es una herramienta vital en el arsenal del cirujano para el tratamiento de los déficits de los tejidos blandos de todo el cuerpo. La grasa es el relleno de tejido blando ideales, ya que es fácilmente disponible, fácil de obtener, de bajo costo, e inherentemente biocompatible. 1 Sin embargo, a pesar de su creciente popularidad, el injerto de grasa se ​​ve obstaculizada por resultados impredecibles y la supervivencia variable de injerto, con tasas de retención publicados que van desde 10 -80%. 1-3

Para facilitar las investigaciones sobre el injerto de grasa, por lo tanto, hemos desarrollado un modelo animal que permite el análisis en tiempo real de la retención de volumen de grasa inyectada. Brevemente, una pequeña incisión en el cuero cabelludo de un CD-1 de ratón desnudo y 200-400 l de lipoaspirado procesado se coloca sobre el cráneo. El cuero cabelludo es elegido como el sitio receptor debido a su ausencia de grasa subcutánea nativo, y debido a la excelente contraste de fondo proporcionada por la bóveda craneal, que ayuda enel proceso de análisis. La tomografía computarizada de Micro (micro-CT) se utiliza para explorar el injerto al inicio del estudio y cada dos semanas a partir de entonces. Las imágenes de TC se reconstruyen, y un software de imagen se utiliza para cuantificar los volúmenes de injerto.

Tradicionalmente, las técnicas para evaluar el volumen de grasa injerto han necesitado la eutanasia del animal estudio para proporcionar una sola evaluación del peso del injerto y el volumen de medición física ex vivo. Comparaciones bioquímicos e histológicos han requerido igualmente el animal estudio que ser sacrificados. Esta técnica de imagen descrito ofrece la ventaja de visualizar y cuantificar objetivamente el volumen en múltiples momentos después del injerto inicial sin tener que sacrificar el animal estudio. La técnica está limitada por el tamaño del injerto capaz de ser inyectado como la piel injertos más grandes riesgos y necrosis grasa. Este método tiene utilidad para todos los estudios que evalúan la viabilidad del injerto de grasa y retención de volumen. Es particularmente bien adaptado a providing de una representación visual de los injertos de grasa y después de los cambios de volumen en el tiempo.

Protocol

NOTA: Los protocolos experimentales y formularios de consentimiento de los pacientes para la obtención de grasa fueron revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Stanford (Protocolo # 2188). Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el grupo administrativo de Stanford en Laboratorio Animal Care (APLAC) en virtud del protocolo # 9999. Todos los experimentos se llevaron a cabo con estricto apego a la seguridad de los animales y las directrices cuidado humano.

1. Fat cosecha

  1. Usando el procedimiento Coleman 17-19, obtener tejido adiposo humano desde el abdomen, flanco, y / o regiones del muslo de pacientes femeninos sanos sometidos a liposucción electiva.
  2. Para procesar la lipoaspirado para el injerto, comenzará al permitir que la grasa se asiente durante 30 minutos.
  3. Lipoaspirado normalmente se asienta en tres capas, con aceite en la parte superior, la grasa en el medio, y la sangre en la parte inferior. Aspirar y desechar la capa de aceite superior y la capa inferior de la sangre.
  4. Para quitar aún más cualquier tumesc restantefluido ent o restos de células, se centrifuga la grasa durante 5 min a 350 xg y 4 ° C, y aspirar la capa acuosa inferior.
  5. Calcular la cantidad de grasa necesaria para el injerto, permitiendo error de entrega 20%, y transferir el volumen deseado de grasa a 50 ml cónico (s). Multiplicar 400 por el número de ratones en el estudio para obtener microlitros de grasa necesaria para el injerto.
  6. En este punto, si se realiza la célula Asistida trasplante de grasa 20,21, lugar volumen de grasa para injertar en el hielo. Entonces cosechar células derivadas de tejido adiposo del estroma (ASC) de la grasa restante utilizando la técnica estándar descrita por Zuk et al 22.

2. injerto de grasa

  1. Obtener femenino, homocigotos CD-1 ratones desnudos para el estudio experimental. Elige ratones entre 8 - 12 semanas de edad.
  2. Para inducir la anestesia, el lugar del ratón en una caja de caída con 2,5% de mezcla de isoflurano / oxígeno a 2 L / min durante aproximadamente 10 min. Tenga en cuenta que ISOF recomendadolurane dosis varía con la cepa de ratón.
  3. Cuando la tasa de respiración del ratón se ha desacelerado, confirmar sedación adecuada con una pizca dedo del pie. Aplicar veterinaria pomada oftálmica lubricante a los dos ojos del ratón.
  4. Si el ratón no se inmuta en respuesta a la pizca dedo del pie, lo que confirma un avión suficiente de la anestesia. Coloque la nariz del ratón en una ojiva entregar 2,5% de mezcla de isoflurano / oxígeno a 2.1 L / min. Si ratón retrae de pizca dedo del pie, volver al cuadro de derribo y nueva prueba después de 5 minutos.
  5. Establecer campo estéril bajo el ratón y luego esterilizar cuero cabelludo con 2,5% de povidona yodada seguido de una solución de etanol al 70%. Repite dos veces más.
  6. Coloque paños quirúrgicos sobre el ratón y tenga cuidado de mantener el campo estéril. Los instrumentos estériles, guantes y PPE se deben utilizar en todo momento.
  7. Si el volumen de grasa a injertar se colocó previamente en hielo, deje que la grasa que ajustar primero a RT antes de la entrega.
  8. BackLoad una jeringa luer-lock 1 ml con 1 mlde grasa.
  9. Conectar un 14 G, 8 cm de grasa cánula larga injerto hasta el final de la jeringa.
  10. Primer sistema presionando el émbolo de la jeringa hasta entre 200 y 400 l de grasa permanece en la jeringa. Mientras oprime el émbolo de la jeringa confirmar que la cánula ha llenado totalmente con la grasa mediante la observación de la grasa que sale del orificio distal de la cánula.
  11. Usando unas pinzas finas, levantar la piel dorsal en la línea media que recubre el caudal-aspecto más del cráneo. Hacer un 1.5 mm cortadas en la piel con unas tijeras finas.
  12. Coloque una sola sutura de nylon 6-0 a través de medio de la corte que posteriormente se utiliza para lograr bordes de la herida juntos después se realiza el injerto. No ate la sutura.
  13. Crear un bolsillo subcutáneo sobre el cráneo mediante la inserción de la cánula a través de la incisión de la piel y pasando la cánula de ida y vuelta en un patrón en forma de abanico sobre el cráneo para liberar los archivos adjuntos del tejido conjuntivo a la piel suprayacente.
  14. Una vez que el bolsillo se ha creado, coloque el cannula en la línea media del ratón directamente sobre el cráneo hasta la punta se encuentra en el rostral-más aspecto de la bolsa que debe ser justo detrás de una línea trazada entre los ojos. (Figura 1A)
  15. Lentamente inyectar la grasa en una forma retrógrada, avanzar el émbolo mientras tira de la cánula de la espalda. Con unas pinzas, lleve los bordes de la herida juntos y levantarlos para mantener la grasa se filtre fuera del bolsillo.
  16. Ate la sutura que se colocó anteriormente, asegurándose de que el primer nudo se encuentra ligeramente contra la piel. Ate tres más nudos cuadrados y cortar la sutura con una cola de 3 mm. (Figura 1B)
  17. Confirme con la visualización y palpación manual que el bolsillo no está sobrecargada y que cubre el bolsillo de la piel no es tensa. Si la bolsa se ha llenado en exceso, cortar la sutura y quitar toda la grasa de dentro de la bolsa. Lavar el bolsillo a cabo con tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 y volver a inyectar un volumen más pequeño de grasa.
  18. Retire del ratón de unnesthesia y colocar en su parte posterior o lateral en una jaula limpia por sí mismo. Monitorear el animal para la respiración regular, los movimientos normales, ausencia de sangrado, y signos de dolor o angustia. Administrar buprenorfina 0,1 mg / kg por vía subcutánea cada 6 horas durante un máximo de 48 horas si el animal está en el dolor.
  19. Asegúrese de que el animal ha despertado lo suficiente como para mantener decúbito esternal antes de dejarla desatendida. No coloque animal en una jaula con otros animales hasta que se haya recuperado por completo.
  20. Después de 4 horas, asegúrese de que el animal es capaz de comer y beber, moverse y respirar con normalidad y que no hay sangrado en el sitio de la operación. Lleve la unidad a las instalaciones de cuidado de los animales.

3. Micro-CT

  1. Ratones Scan para el volumen de línea de base por día postoperatorio 3, y luego repetir las exploraciones en las semanas después de la operación 2, 4, 6 y 8.
  2. Cuando imágenes de los ratones en cada punto de tiempo, siga las pautas de sedación y cuidado de los animales antes y después del procedimiento como se indica anteriormente en S02.02 a 02.04 y de 02.17 a 02.19 los PTE.
  3. Realizar análisis bajo un escáner micro-CT con un tamaño de voxel reconstrucción de 100 micras o mejor.
  4. Con un kilovoltage de rayos X de pico de 80 kVp y una corriente de ánodo de 450 mu, administrar una dosis de ración de aproximadamente 5 centiGy durante una exploración de 9 min para cada ratón. Tenga en cuenta estos valores varían dependiendo del protocolo de exploración.
  5. Antes de realizar la primera exploración, calibre micro-CT con un fantasma de imagen que distingue entre el aire, el agua, y la intensidad de los huesos.
  6. Coloque cuatro ratones en el escáner en la posición ventral con dos ratones en la parte superior y dos en la parte inferior. Una cama de exploración puede ser fácilmente construido utilizando 60 ml jeringas para sujetar el cuerpo del ratón y jeringas de 10 ml como conos de ojiva. 23
  7. Mantener ratones bajo anestesia con una mezcla de isoflurano / oxígeno 2.5% a 2.1 L por minuto.
  8. Confirme imagen scout con el que todo el cráneo del ratón, desde la nariz hasta la primera vértebra cervical, y de arriba del cráneo hasta la base del skull, se va a ver.

Análisis 4. Micro-CT

  1. Abra las imágenes reconstruidas con un micro-CT de imágenes de software de análisis que permite la creación de regiones de interés (ROI) mediante la selección de voxels utilizando umbrales de intensidad de los píxeles. El software también permite la creación de superficies 3D mediante la interpolación de voxels seleccionados, y para el análisis del volumen.
  2. Comience por cargar las imágenes de TC reconstruidas en dos dimensiones (2D) coronal, axial y sagital. (Figura 2A)
  3. Utilizando el corte axial como guía, vaya a la rebanada sagital que corresponde al aspecto más a la izquierda del injerto de grasa. Seleccionar un umbral superior e inferior para la intensidad de los píxeles que captura todos los voxels correspondientes al injerto de grasa, pero que excluye el tejido circundante y hueso. (Figura 2B)
  4. Definir una ROI en la vista sagital que corresponde al injerto de grasa usando umbrales de intensidad de píxel previamente definidos. REPEAT este procedimiento cada quinta rebanada sagital, navegar hasta que se alcanza más a la derecha aspecto del injerto. (Figura 2C)
  5. Interpolar voxels seleccionados de todas las ROI de 2D en una sola, combinada ROI 3D. (Figura 2D)
  6. Volumen ROI Record calculado por el software.
  7. Render del isosuperficie 3D para visualizar el volumen final del injerto de grasa. (Figura 2E)
  8. En los análisis posteriores, asegúrese de mantener los valores mínimo umbral máxima intensidad de los píxeles y los mismos que los utilizados para el análisis de referencia.

5. La grasa de la cosecha

  1. Después de ratones han sido escaneados para la semana 8 24,25 punto de tiempo, anestesiar a los ratones como se describe anteriormente anteriormente en los pasos 2.2 a 2.4 y 2.17 a 2.19.
  2. Siguiendo directrices APLAC, la eutanasia a los ratones mediante la separación de sus columnas vertebrales.
  3. Coloque el ratón en el campo operatorio. Con unas tijeras de tenotomía, abrir cuidadosamente el bolsillo y diseccionar tque recubre la piel y anexos del tejido conectivo del injerto de grasa.
  4. En este punto, puede ayudar para escindir un parche de la piel dorsal suprayacente para ayudar en la extracción del injerto. (Figura 3A)
  5. Ligeramente mantener la tracción sobre el injerto con unas pinzas y gire injerto de lado a lado para visualizar los sucesivos puntos de tensión que deben ser liberados con unas tijeras.
  6. Manténgase lo más cerca del injerto como sea posible cuando la escisión de minimizar el tejido conectivo se toma con el injerto. (Figura 3B)
  7. Después de la escisión de injerto, medir la masa en una escala tarado que tiene una precisión de al menos 0,01 gramos.
  8. Calcular el volumen del injerto de grasa utilizando el valor de la masa medida y la densidad media de la grasa humana (0,9 g / ml) como una tasa de conversión.
  9. Comparar volumen calculado de injerto de grasa a la obtenida usando micro-CT.
  10. Injertos de grasa pueden ser procesados ​​para histología o su posterior análisis, si es necesario.

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Representative Results

Injertos de grasa disminuyeron progresivamente en volumen durante el curso de estudio, resultando en 62.2% de supervivencia media en la Semana 8. (Figura 4A) 24 A la finalización de la exploración Semana 8, cada injerto de grasa se ​​extrajo en una sola pieza. Se utilizó una prueba Wilcoxan suma de rangos para comparar la diferencia entre las mediciones de volumen de los injertos de grasa obtenidos por cualquiera de las micro-CT o calculados a partir de la masa física. No se encontraron diferencias significativas entre estos dos métodos (p-valor de dos caras = 0,9362). (Figura 4B)

Con 5 centiGy por exploración y cinco puntos de tiempo de escaneo, cada ratón recibió no más de un total de 25 centiGy en el transcurso del estudio. Consistente con esto, ninguno de los ratones muestra ninguna evidencia bruto de quemaduras por radiación cutáneas.

Figura 1
Figura 1. (A) (B) ratón desnudo sobre el injerto de grasa completado, con una sola sutura de nylon utiliza para lograr la herida bordes juntos. El bolsillo se ha llenado, pero no es tensa.

Figura 2
Figura 2. (A) que se muestran las imágenes reconstruidas inicialmente en axial, coronal y sagital. (B) Uso de la vista axial como una guía para navegar hasta el aspecto más a la izquierda del injerto en vista sagital. El establecimiento de un umbral de intensidad de los píxeles para que todos los voxels seleccionados dentro del rango umbral representará el tejido adiposo, por lo tanto permitir la delimitación del volumen del injerto de grasa. (C) de retorno de la inversión definido en vista sagital empezando por el aspecto más a la izquierda del injerto y continuado siemprey quinta rebanada en movimiento al otro extremo del injerto. (D) Todos los voxels seleccionados de ROI de 2D interpolado en un único ROI 3D. (E) Una superficie tridimensional se ha creado usando interpolación cúbica-spline para visualizar los volúmenes totales de injerto de grasa .

Figura 3
Figura 3. injerto (A) de grasa antes de la explantación, con parche dorsal de la piel eliminado. (B) del injerto de grasa después de la explantación.

Figura 4
Figura 4. Análisis de (A) volumétrica Micro-CT demostró pérdida gradual de volumen de grasa injerto de más de ocho semanas. (B) volúmenes finales de injerto de grasa, medido por micro-CT, correspondía estrechamente a los volúmenes calculados a partir de las masas de injerto de grasa explantados. La densidad media de la grasa humana (0,9 g / ml) se utilizó como un índice de conversión.

Tabla 1
Tabla 1. Calculado Micro-CT de volumen vs. midió el volumen de grasa real 24

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Discussion

Hasta este punto, la mayoría de los investigadores se han basado en modalidades no de imagen para cuantificar la supervivencia a largo plazo de los injertos de grasa, pero estos métodos requieren el sacrificio del animal estudio y producir una sola medición. 3,10-12 Nuestro estudio representa un método de análisis mejorado que permite objetivo, la cuantificación en tiempo real de grasa supervivencia del injerto en un modelo de ratón.

Crítico en este proceso es garantizar que los ratones suficientemente inmunocomprometidos se utilizan para el estudio, ya que esto evita que el rechazo del injerto que se produciría si se utilizan ratones con el sistema inmune intacto. Preservar la integridad de grasa es crítica durante la cosecha, el procesamiento y las fases de colocación de injertos. De acuerdo con las normas tradicionalmente aceptados, grasa para el injerto debe obtenerse mediante succión liposucción asistida (SAL). Durante la colocación, la grasa debe ser inyectado a una velocidad de flujo constante a no más de 0,5 ml / seg. Se prefiere una cánula de calibre 14 para injertar ina ratón, pero cánulas de mayor diámetro pueden ser utilizados sin ningún perjuicio a la grasa. Cánulas y agujas más pequeñas, especialmente aquellos calibre son más estrechos que 16 desalentadas durante la colocación, ya que pueden hacer que la grasa a la ruptura debido al aumento de la tensión de cizallamiento. Aunque describimos nuestra técnica preferida para el procesamiento de más arriba, cualquier combinación de sedimentación, centrifugación y / o filtración puede ser utilizado siempre y cuando las capas de aceite y la sangre se separan adecuadamente de la grasa antes del injerto.

Injertos de grasa debe ser de al menos 200 l en tamaño para minimizar la varianza en los resultados debido a la naturaleza inconsistente de injertos de grasa. Injertos más grandes de hasta 400 l de tamaño se pueden usar, pero por encima de este volumen, el suministro vascular alterada y excesiva tensión de la piel puede resultar en grasa y necrosis de la piel. En última instancia, el tamaño máximo de grasa de injerto será determinado por el área de superficie y el volumen del bolsillo. Para aumentar el volumen de un injerto que se puede entregar de forma segura, la pocket se puede ampliar mediante una disección más extensa. Sin embargo, esto puede colocar la grasa más allá de los límites de la parte superior del cráneo, lo que hará que el contraste entre el injerto y el tejido circundante menos clara. Por lo tanto, la selección de voxel posterior será más difícil.

Si la incisión inicial de la piel es lo suficientemente pequeño, una sutura puede no ser necesario siempre y cuando la grasa permanece contenida y no se ve salga del bolsillo. Si se coloca una sutura, se debe tener cuidado de no atar el primer nudo muy apretado, de lo contrario se puede producir deterioro de la piel. Se prefiere una sutura de monofilamento no absorbible tal como el nylon, ya que limita la reacción inflamatoria y es menos probable para albergar la infección. Re-epitelización de la incisión se producirá dentro de 24 a 48 horas después de la operación, y la sutura pueden retirarse en este momento. Las suturas absorbibles trenzadas y no deben utilizarse. Piel siempre debe ser manejado con la menor fuerza necesaria, y el cirujano debe tener cuidado de no aplastar la pielmientras que soporta bordes de la herida.

Dependiendo de imágenes de software de análisis de los investigadores, la relación exacta entre la intensidad de píxeles y la densidad del tejido puede variar. Los investigadores deben elegir los umbrales de intensidad de píxel para obtener un rango máximo y mínimo que distingue más precisión el injerto de grasa del tejido circundante. Los mismos valores umbrales máximo y mínimo se deben utilizar durante todo volumen analiza para mantener la consistencia.

Hay varios métodos para seleccionar el volumen del injerto una vez que se han establecido valores de umbral de intensidad de píxel. Aunque nos encontramos con la pintura con una herramienta de pincel en la vista sagital mejor en nuestras manos, otros métodos de selección voxel para crear un retorno de la inversión se puede utilizar como dibujar con la herramienta spline o pintura en la vista axial. Es preferible si una sola persona realiza todo el volumen analiza la mayor coherencia posible con el fin de reducir el error de medición.

La no-naturaleza invasiva de este método y la visualización en tiempo real de la evolución del injerto ofrecen ventajas significativas sobre las técnicas tradicionales. Sin embargo, esta técnica está limitada en su capacidad para identificar la viabilidad y la salud de los injertos de remanentes. Además, no puede demostrar la revascularización relativa de injertos. Aunque los cambios en la apariencia y la densidad del injerto pueden insinuar necrosis grasa, infección, formación de quistes, o licuefacción, es difícil sacar conclusiones exactas de micro-TC sola.

Esperamos que esta técnica servirá como una base sobre la cual se pueden realizar futuros estudios para entender mejor los factores causales en la supervivencia del injerto de grasa y pérdida. Variaciones sobre este tema pueden dilucidar el papel que las células madre, factores de crecimiento, citoquinas, genes, y marcadores de superficie celular desempeñar en la preservación final de volumen de grasa injerto. Con esta mejora de la herramienta para probar hipótesis de contraste, esperamos un mejor entendimiento de la transferencia de grasa que TRANSFOrms una técnica caprichoso para el tratamiento de los déficits de tejidos blandos en una más predecible.

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Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la Fundación Oak, el Laboratorio Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa, y el Instituto Nacional de Salud, Becas NIHR21DE019274, NIHR01DE019434, NIHR01DE021683 y NIHU01HL099776 a MTLDCW fue apoyado por la AEC Franklin H. Martin Facultad de Becas de Investigación, la Hagey Laboratorio de Pediatría Medicina Regenerativa, y el Premio Académico Facultad Instituto de Investigación de Salud Infantil de la Universidad de Stanford. Micro-CT se llevó a cabo en el Centro de Stanford para la Innovación en imágenes in vivo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SAL lipoaspirate
Centrifuge Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA
50 ml conical tubes BD Biosciences, San Jose, CA
CD-1 nude mice (Crl:CD1-Foxn1nu) Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA
Isoflurane Henry Schein, Dublin, OH
2.5% Betadine Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT
70% Ethanol solution  Gold Shield, Hayward, CA
1cc luer-lock syringe BD Biosciences, San Jose, CA
14 gauge cannula Shippert Medical, Centennial, CO
Forceps Fine Science Tools, Heidelberg, Germany
Tenotomy scissors Fine Science Tools, Heidelberg, Germany
6-0 nylon suture Ethicon, Blue Ash, OH
Phosphate buffered saline Gibco, Carlsbad, CA
micro-CT scanner  Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Phantom  TriFoil Imaging, Northridge, CA
Imaging analysis software IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Scale  Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH

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