Vicino infrarosso (NIR) Luce aumenta l'espressione di un marcatore di mitocondriale Funzione nel mouse vestibolare sensoriale Epithelium

1Discipline of Physiology, University of Sydney, 2Discipline of Biomedical Science, University of Sydney
Biology

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Summary

Disfunzione mitocondriale è una caratteristica della senescenza cellulare. Questo documento utilizza nel vicino infrarosso (NIR) trattamento non invasivo per migliorare la funzione mitocondriale nel invecchiamento del mouse vestibolare epitelio sensoriale.

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Zhang, L., Tung, V. W., Mathews, M., Camp, A. J. Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium. J. Vis. Exp. (97), e52265, doi:10.3791/52265 (2015).

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Abstract

Strategie per attenuare il declino in funzione di bilanciamento con l'aumentare dell'età sono prevalentemente concentrati su terapie fisiche, tra cui le attività di bilancio e l'esercizio fisico. Tuttavia, questi approcci non affrontano le cause alla base dell'equilibrio declino. Usando topi, è stato valutato l'effetto di luce vicino infrarosso (NIR) sul metabolismo di cellule dell'epitelio sensoriale vestibolare. I dati raccolti mostrano che questo intervento semplice e sicuro può proteggere queste cellule vulnerabili dagli effetti deleteri di invecchiamento naturale. mRNA è stato estratto dalla isolato epitelio periferico vestibolare sensoriale (ampollare crista e macula utricular) e successivamente trascritto in una libreria di cDNA. Questa libreria è stato poi indagato per l'espressione di antiossidanti onnipresente (SOD-1). Antiossidante espressione genica è stato poi utilizzato per quantificare il metabolismo cellulare. Utilizzando consegna transcranica di Nir in giovane (4 settimane) e anziani (8-9 mesi) i topi, e un regime di trattamento breve (90 sec / giorno per 5 days), questo lavoro suggerisce Nir sola può essere sufficiente per migliorare la funzione mitocondriale nell'epitelio sensoriale vestibolare. Dal momento che non ci sono attualmente disponibili, a prezzi accessibili, i metodi non invasivi di terapia per migliorare la funzione delle cellule dei capelli vestibolare, l'applicazione delle radiazioni NIR esterna fornisce una strategia potenziale per contrastare l'impatto dell'invecchiamento sul metabolismo cellulare inthe vestibolare epitelio sensoriale.

Introduction

Il calo delle prestazioni equilibrio e cadute successive sono comuni, e le caratteristiche, purtroppo, spesso definiscono di invecchiamento naturale 1. L'impatto di questo declino può essere sia fisica che sociale, e riduce in modo significativo la qualità della vita per le persone anziane. In risposta, terapie fisiche e riabilitazione sono stati al centro della ricerca di cadute, ma non sono stati associati con la riduzione consistente della prevalenza di cadute ripetute. Allo stesso tempo, il lavoro indagando i cambiamenti nel sistema periferico o centrale vestibolare (il sistema responsabile per mantenere l'equilibrio) è scarso, e potenziali strategie terapeutiche destinate a questi sistemi e le cause di squilibrio limitato.

Un recente lavoro su malattie neurodegenerative legate all'età, tra cui età-correlate degenerazione maculare 2-4, modelli di malattia di Alzheimer 5-8, e il morbo di Parkinson 9-12 hanno mostrato effetti neuroprotettivi di simple applicazione non invasiva del vicino infrarosso (NIR) luce. Inoltre, nel sistema vestibolare, NIR è stato usato per aumentare l'attività di neuroni vestibolari afferenti primari in vitro 13. Mentre il meccanismo di Nir luce non è ben compreso,, maggior parte degli studi che utilizzano NIR hanno suggerito che Nir stimola mitocondri complesso IV (citocromo c ossidasi) 14-17 per facilitare il metabolismo cellulare. Nel epitelio sensoriale vestibolare piastra sottocuticolare delle cellule ciliate che tipo è denso in mitocondri 18 e come tale può rappresentare un luogo di azione per il trattamento terapeutico Nir.

Qui, una breve, regime di trattamento non invasivo transcranially applicato NIR che può essere utilizzato per misurare il metabolismo cellulare (e di conseguenza, la funzione mitocondriale) nel topo vestibolare dell'epitelio sensoriale descritto. Anche discusso è una preparazione dell'epitelio sensoriale vestibolare e si dimostra che NIR aumenta l'espressione di un ubiquitonoi anti-ossidante (superossido dismutasi 1) nell'epitelio sensoriale - precedentemente dimostrato di essere importante per la sopravvivenza delle cellule dei capelli coclea 19.

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Protocol

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure descritte qui di seguito sono stati approvati dalla University of Sydney Comitato etico degli animali.

1. Gli animali

NOTE: 1 e 8-9 mesi topi (C57 / BL6) sono stati ottenuti dalla Animal Resources Centre (Perth, Australia). I topi sono stati alloggiati in Facility Bosch Roditore presso l'Università di Sydney.

  1. Casa topi in gabbie standard del mouse su un 12/12 luce hr / ciclo scuro con accesso a cibo e acqua ad libitum.
  2. Topi Divide in ogni fascia d'età in vicino infrarosso (NIR) trattati, o sham trattati (controllo) gruppi per il confronto.

2. vicino infrarosso (NIR) irradiazione e Sham trattamento

  1. Accorciare il pelo sulla regione della testa e del collo del mouse con un rasoio elettrico più vicino possibile impedire rapida ricrescita dei capelli prima del completamento del regime di trattamento. Per mantenere lo stato privo di patogeni dei topi, utilizzare etanolo al 70%per pulire strumenti tra gli animali da trucco e F10 veterinaria disinfettante tra animali di gabbie separate. Fare questo 2 - 3 giorni prima l'inizio del trattamento in modo gli animali non sono più manico.
  2. Trattenere il mouse tenendo l'estremità prossimale della coda e permettono di rilassarsi nel palmo di una mano o superiore del banco di modo da ridurre al minimo lo stress che potrebbe portare a risultati falsi.
  3. Tenere il NIR (670 nm) LED (light emitting diode) Dispositivo 1 - 2 cm di distanza dal (rasato) area esposta e accendere il dispositivo per 90 secondi (Figura 1A).
    NOTA: La variazione di temperatura a seguito di esposizione 90 sec stata misurata come <0,2 ° C in 100 ml di acqua.
  4. Ripetere i passaggi 2,2-2,3 per il gruppo di trattamento sham degli animali, ma lasciare l'apparecchio spento (Figura 1B).
  5. Ripetere i passaggi 2,2-2,3 per il gruppo di trattamento Nir-bloccato di animali, ma coprire il dispositivo con un foglio di alluminio.
  6. Ripetere i passaggi 2,2-2,5 giorni alle approximate 24 intervalli hr per 5 giorni consecutivi.
  7. Estrarre l'epitelio vestibolare sensoriale (3 creste e 1 macula utricular) da entrambe le orecchie per il quinto giorno dopo il trattamento (vedere paragrafo 3).

3. Tissue estrazione 20

  1. Preparare 300 ml di un liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) basato glicerolo-costituiti (in mM): 26 NaHCO3, 11 glucosio, 250 glicerolo, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1.2 MgCl 2, 2,5 e CaCl 2. Prima dell'aggiunta di CaCl 2, gas la soluzione con CarboGen (95% O 2 e 5% CO 2) per stabilire un pH di 7,4 e di evitare la precipitazione di calcio (nuvolosità). Raffreddare la soluzione in un -80 ° C freezer per 45 minuti in modo da formare una sospensione di ghiaccio.
  2. Preparare il tampone di lisi isolamento RNA etichettati microtubi tappo a vite (ferma il popping dei coperchi, quando le variazioni di pressione del tubo tra congelamento e scongelamento in azoto liquido) in basele istruzioni del fabbricante o usuali pratiche di laboratorio. Avere azoto liquido pronto in un matraccio dewar alluminio.
    NOTA: Usare indumenti protettivi e eyeware durante la manipolazione di azoto liquido. Assicurarsi che l'azoto liquido viene utilizzato in una stanza ben ventilata come il volume della sua forma di gas è di circa 700 volte quella della sua forma liquida e può causare asfissia.
  3. Profondamente anestetizzare topi con ketamina (400 mg / kg) tramite una iniezione intra-peritoneale. Lasciare che il riflesso arti posteriori a placarsi del tutto come indicazione che i topi sono completamente anestetizzati.
  4. Decapitare topi con le forbici in acciaio inossidabile affilate e fare un'incisione lungo la pelle sagittale del cranio con una lama di rasoio (arrotondato # 22). A questo punto e tutto passi 3,5-3,9, mantenere il più fresco possibile, l'applicazione regolare di ACSF ghiacciato sopra il tessuto della volta cranica, cervello e apparato vestibolare sottostante.
  5. Utilizzando il braccio punta di forbici modello standard fare un small 'incisione nel cranio a Lambda e tagliare lungo la sutura sagittale.
  6. Scorrere delicatamente un braccio di un superficiale rongeurs sotto l'osso parietale mantenendo la lama più vicino possibile alla superficie inferiore dell'osso senza trascinare il cervello. Sicuro e tirare via l'osso parietale laterale e l'osso occipitale posteriormente fino a quando il cervello è esposto.
  7. Utilizzare una piccola spatola di acciaio inox e sollevare il cervello dal anteriore e centrale fossa cranica per esporre il nervo vestibolococleare (CN VIII). Transetto il nervo per evitare inutili tensioni sui assoni afferenti primari che innervano direttamente le cellule ciliate vestibolari.
  8. Rimuovere il cervello in toto dopo resezione del CN VIII.
  9. Osservare il labirinto osseo contiene la coclea e gli organi vestibolari periferici nella fossa cranica media. Fare due piccole incisioni accanto a ogni labirinto osseo e asportare l'intera struttura tenendo il canale semicircolare anteriore e tirare tardialleato.
  10. Immergere immediatamente labirinti escisse in un piatto dissezione contenente soluzione ACSF ghiacciata (come descritto al punto 3.1), mentre continua perfusione con CarboGen.
  11. Sotto uno stereomicroscopio, tenere premuto il labirinto della coclea e fissarla al fondo del piatto con una pinza.
    1. Utilizzare pinze dritto fini graffiare una piccola apertura nel midollo sopra anteriore canale semicircolare (SSC) ampolla.
    2. Allargare delicatamente questa apertura raggiungendo immediatamente sotto l'osso e sfogliando verso l'esterno lontano dal ampolla. Fare attenzione qui per non spingere pinze nell'apertura e danneggiare il labirinto membranoso fragile sotto. Continuare in questo modo fino a quando il utricolo, anteriore e ampolle laterale sono tutti esposti. Se possibile rimuovere anche l'ampolla posteriori.
  12. Utilizzando una pinza sottile, sollevare delicatamente il utricolo e ampolle dal labirinto osseo fino a quando non sono completamente staccati. Ove possibile, tenerlidai canali semicircolari associati per evitare di danneggiare l'epitelio sensoriale. In alcuni casi, la parte prossimale del condotto membranoso semicircolare può avere bisogno di essere tagliato con forbici iris per rilasciare le ampolle dall'osso.
  13. Saldamente cogliere gli organi vestibolari tra la punta di una pinza e posto nel buffer di lisi preparata in precedenza al punto 3.2. Mescolare delicatamente la pinza intorno nel buffer per garantire organi vestibolari hanno staccato dalla pinza. Controllare questo è il caso per portare le pinze con lo stereomicroscopio.
    1. Avvitare sul coperchio microtubuli e congelare il campione in azoto liquido immediatamente.

4. RNA Estrazione e RT-PCR

  1. Seguire metodi standard di RNA messaggero (mRNA) di estrazione secondo le istruzioni del fabbricante o protocolli di laboratorio preferito.
    NOTA: un kit commerciale che utilizzava RNA carrier per aiutare isolare le piccole rese di mRNA è stato utilizzato in questoprotocollo. Volumi di eluizione inferiori possono essere usati per aumentare le concentrazioni finali di mRNA.
    NOTA: Controlli negativo "no enzima" (NEC) e controlli "non modello DNA" (NTC) devono essere completati per garantire la validità degli effetti osservati.
  2. Applicare metodi standard di trascrizione inversa di mRNA a DNA complementare (cDNA) e l'amplificazione di geni bersaglio 21-23.

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Representative Results

Per confrontare l'impatto del trattamento Nir nei giovani (4 settimane) e anziani (8-9 mesi) topi abbiamo misurato l'espressione di antiossidanti superossido dismutasi 1 (SOD-1) nei giovani (n = 16) e anziani (n = 20) i topi che erano NIR-trattata, sham-trattati, o Nir-bloccato. figura 2 mostra un aumento significativo normalizzato SOD-1 β-actina di oltre 2 volte nei giovani Nir-animali trattati rispetto ai giovani animali sham trattati (p <0.01) e animali giovani NIR-bloccati (p <0.01). Animali più vecchi Nir-trattati hanno mostrato più di 2 volte up-regolazione di SOD-1 rispetto ai più anziani animali Nir-bloccate (p <0.05).

Figura 1
Figura 1. Nir trattamento. 2 cm sopra la regione rasata sulla testa del mouse per 90 secondi al giorno per 5 giorni consecutivi a irraggiamento trea - dispositivo tenuto 1 (A) NIR LEDtopi ted. (B) Nir dispositivo tenuto sopra topi sham trattati allo stesso modo, ma con il dispositivo spento per tutta la durata di 90 sec LED. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Analisi SOD-1 espressione genica dopo 5 giorni consecutivi di trattamento NIR (90 sec / giorno). L'epitelio sensoriale vestibolare è stato raccolto il quinto giorno e specifico gene antiossidante sondato per usando RT-PCR. La SOD-1 gene è stata normalizzata a β-actina basale e densitometria condotta utilizzando ImageJ v1.48. Significativa up-regulation (p <0.01) di SOD-1 è stata osservata in animali giovani Nir-trattati rispetto sia giovane sham trattati e giovani controlli Nir-bloccati (4 settimane). Aumento significativo (p &# 60; 0.05) in SOD-1 è stata inoltre osservata in animali più vecchi Nir trattati rispetto ai più anziani animali Nir-bloccati (8-9 mesi). Tutti i grafici mostrano la variazione piega di SOD-1 espressione genica rispetto al giovane di controllo sham-trattata. Dati rappresenta media ± SD. Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando ANOVA e significatività statistica determinati utilizzando comparazione multipla post-hoc test di Tukey. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I risultati rappresentativi qui descritti mostrano che breve consegna transcranica di NIR luce (90 sec / giorno per 5 giorni) è sufficiente per aumentare i livelli di espressione antiossidante nei topi anziani rispetto ai topi sham trattati. Mentre calore emesso potrebbe rappresentare una fonte di mitocondriale e / o l'attivazione neuronale, come riportato per ratto vestibolare afferenti 24 - nostra misurazione del calore emesso dal LED NIR dispositivo era <0,2 ° C superiore al 90 sec, e come tale è improbabile causare le modifiche descritte qui. Inoltre, a differenza della relazione ha evidenziato sopra, il trattamento Nir qui utilizzato non è stato applicato direttamente dell'epitelio sensoriale o neuroni afferenti vestibolari, e come tale è anche improbabile che un impatto sulla termo canali sensibili (ad esempio, TRPV4). Infine, il lavoro precedente con lo stesso dispositivo NIR in altre regioni del cervello hanno suggerito che il calore non era la fonte delle differenze osservate 7,9.

Mentre questi ResuLTS mostrano un up-regolazione delle risposte cellulari per età-associate stress ossidativo a livello genetico, non è chiaro se questi cambiamenti sono ulteriormente espressi a livello di proteine, o importante, sia che si riflettono nello svolgimento equilibrio complessivo dei topi. Inoltre, l'up-regolazione è mostrato per una singola onnipresente antiossidante. È probabile che più marcatori del metabolismo cellulare sono interessate da questo regime di trattamento. Inoltre, poiché mRNA è stato estratto dall'apparato vestibolare in toto (cioè cellule ciliate, cellule di supporto, afferents vestibolari e dell'epitelio tutti presenti) non è possibile mettere in relazione cambiamenti osservati nel metabolismo cellulare in risposta al trattamento luce NIR ad un capello vestibolare specifica cellula o tipo afferente primaria. È importante sottolineare che, però, utilizzando la preparazione descritta mRNA sufficiente può essere estratto da un singolo mouse per permettere future studi di correlazione tra il metabolismo cellulare e analisi comportamentale di equilibrio performance.

Il dispositivo ad alta intensità LED utilizzata qui emette circa il 5 J / cm 2 per 90 secondi al trattamento con un totale di 25 J di energia su 5 giorni. Mentre il vantaggio dell'uso della luce lunghezza d'onda lunga (compresi NIR) è penetranza, non si può presumere che la piena 25 J di NIR luce viene consegnato dell'epitelio sensoriale vestibolare. Nel topo, la luce deve penetrare almeno 1 mm attraverso strati di tessuto molle e osso che proteggono l'apparato vestibolare periferico e cervello. Negli esseri umani questo si estende a centimetri. Così la penetranza di luce rappresenta una limitazione della tecnica descritto con riferimento a definizione di NIR strategie di trattamento luce in ambito clinico. Studi recenti, tuttavia, ha impiegato le fibre ottiche per fornire NIR luce alle strutture cerebrali profonde, tra cui i gangli della base 25, e gli organi sensoriali, tra cui la coclea 26. Sulla base di questo e la posizione dell'apparato vestibolare periferica adiacentecoclea (e accesso clinico ad esso tramite il processo mastoideo), è fattibile a suggerire che nell'essere umano, la stimolazione diretta dell'epitelio sensoriale vestibolare potrebbe essere realizzato attraverso una piccola fibra ottica provocato da un dispositivo esterno - simile ad un impianto coclea 27 .

Diverse condizioni possono essere modificati nel protocollo sopra descritto per adattare l'interesse del ricercatore. Innanzitutto, la lunghezza d'onda usata qui (670 nm) può essere esteso per includere lunghezze d'onda più lunghe nel campo infrarosso come precedentemente riportato in altri sistemi sensoriali e modelli animali. In secondo luogo, i regimi di trattamento possono anche essere variati a seconda che a breve termine o risposta a lungo termine è in questione. Qui una breve regime di trattamento è stata utilizzata, ma questo potrebbe essere esteso a durate maggiori, o durate ancora più brevi per misurare la dinamica dei cambiamenti indotti NIR.

La sfida principale di questo protocollo è quello di mantenere la vitalità del tessutodurante l'estrazione del tessuto. Dato il tempo necessario per rimuovere il labirinto osseo e asportare il labirinto membranoso da esso, è fondamentale per ridurre la rottura metabolica. Ciò si ottiene bagnando il tessuto in ACSF ghiacciata durante tutta la procedura e perfusione questa soluzione continuamente con carbogeno. Inoltre, al termine della procedura di dissezione, ulteriore degradazione del tessuto può essere arrestata con l'uso di azoto liquido a lampeggiare congelare il tessuto estratta. Se del caso, il tessuto congelato può essere scongelato e mRNA estratto per ulteriori analisi genica.

Anche se i metodi descritti non descrivono l'impatto completo di trattamento luce Nir sul metabolismo cellulare nell'epitelio sensoriale vestibolare, ulteriore applicazione di questa strategia può essere modificato per includere altri marcatori associate all'età della funzione mitocondriale 28,29 e / o metabolica cellulare insulti quali ipossia 30. Infine, la possibilità di descrivere la vestibular profilo metabolico cellulare di un individuo del mouse permette la ricerca delle correlazioni tra prestazioni equilibrio e processi subcellulare durante l'invecchiamento, e l'impatto di terapie compreso il trattamento Nir.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Paul Witting e la signora Genevieve Fong per la loro assistenza con estrazione mRNA e PCR, e Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation per il supporto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quantum WARP 10 Quantum Devices 2070N030-A
Screw top microtubules Quality Scientific Plastics 520-GRD-Q
Ketamine Parnell, Alexandria Australia
Standard pattern scissors FST 14001-12
Carbon steel surgical blades #22 Livingstone SBLDCL 22
Friedman-Pearson rongeurs FST 16221-14
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Dumont #5 SF forceps FST 11252-00
Isolate II RNA Micro Kit Bioline BIO-52075

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