Выделение и Иммортализация пациента, полученных клеточных линий мышечной биопсии для моделирования заболеваний

1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Robin, J. D., Wright, W. E., Zou, Y., Cossette, S. A., Lawlor, M. W., Gussoni, E. Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling. J. Vis. Exp. (95), e52307, doi:10.3791/52307 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы для сбора ткани человека должны быть рассмотрены и одобрены комиссией Институциональная IRB. Коллекция отбрасываются, обезличенной человеческой ткани был одобрен больницы Бостона детей и Brigham и женской больницы IRB комитетов. Способы, описанные ниже, были применены для выделения клеток из миогенными де-определены, отбрасываются ткани. Описанные методы применимы к ткани, собранной из согласие материала пациента.

1. Выделение клеток

  1. Диссоциация мышечной биопсии и очистки миогенных клеток
    1. Предварительно весить 10 см планшета для культуры ткани в культуре ткани капот биологической безопасности, а затем повторно взвешивают пластину, содержащую мышечной биопсии, чтобы рассчитать количество ткани, чтобы быть отделены.
    2. Использование стерильных скальпелей, пропустить через мясорубку мышечной ткани мелко и добавить несколько капель стерильного 1x HBSS, чтобы предотвратить ткани от высыхания.
    3. Добавить 3,5 мл каждого из диКосмических II и коллагеназы D на грамм мышечной ткани переваривается. Внесите фарш ткани и ферментного раствора через стерильный 25 мл пипетки несколько раз. Инкубируют планшет в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 15 мин и переварить ткань до тех пор, пока суспензия легко проходит через стерильный 5 мл пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ткани диссоциации обычно достигается путем ферментативного расщепления в 45-90 мин. Пожалуйста, обратитесь к разделу "Представитель Результаты" для получения дополнительной информации.
    4. Добавить 2 объемами стерильной среды роста на диссоциированного ткани, фильтр через 100 мкм сито клеток свыше 50 мл коническую трубку и гранул клеток в течение 10 мин при 329 х г (~ 1100 оборотов в минуту), комнатной температуры. Пожалуйста, обратитесь к таблице Материалы для состава массовой информации.
    5. Ресуспендируют осадок в 1 объеме стерильной среды роста и добавить 7 томов красный раствор лизиса клеток крови. Фильтр раствора через клеточный фильтр 40 мкм, затем гранул тон клеток в течение 10 мин при 329 мкг, комнатной температуры.
    6. Количество клеток в гемоцитометра и ресуспендирования клеток в 1x HBSS 0,5% BSA в концентрации 1 × 10 6 клеток / 100 мкл. Установите в сторону ~ 250000 клеток в одной пробирке, которые будут использоваться в качестве (неокрашенной) управления отрицательным. Отложите дополнительные одноцветных окрашенных управления трубы для пропидийиодидом и для CD56, которые необходимы для правильного стробирования CD56-положительных клеток по FACS сортировки. Пожалуйста, обратитесь к сортировки клеток руководства или проконсультируйтесь с FACS сортировки экспертов основной комплекс для обеспечения надлежащего контроля включены.
    7. Пятно клетки должны быть отсортированы с 5 мкл / 10 6 клеток анти CD56 антител. Выдержите все образцы (в том числе управления) на льду в течение 30 мин.
    8. Образцы стирка в 10 мл 1х HBSS и гранул клетки в течение 10 мин при 329 х г (~ 1100 оборотов в минуту) в охлаждаемой центрифуге, 4 ° C температуре.
    9. Добавить пропидийиодидом в конечной концентрации 1 мкг / мл в образце, чтобы быть SorТед для исключения мертвых клеток. Очищают миогенные CD56-положительных клеток от не-миогенных клеток с использованием флуоресцентного активирована сортировщик клеток.
  2. Диссоциация биопсии кожи
    Примечание: дермальных фибробластов могут быть выделены из пуансона кожи от пациентов при биопсии мышц отсутствуют. Дермальных фибробластов могут быть использованы в качестве биоматериала в течение многих исследований, в том числе трансдукции с MyoD генерировать миогенные клеток. Кроме того, кожные фибробласты могут быть использованы для создания плюрипотентных клеток, которые могут быть дифференцированы в различные типы клеток для дальнейшего исследования.
    1. Транспорт биопсии кожи в лабораторию в транспортной среде. После того, как образец будет получена, выполнить первичную культуру, как можно скорее. Если основной культуры не может быть установлена ​​в тот же день, хранить образцы при комнатной температуре в течение ночи.
    2. Передача биопсии кожи в стерильную 35 мм чашки Петри в колпаке с ламинарным потоком.
    3. Промойте биопсию кожи в чашке Петри со стерильной 1х PBS, чтобы удалить кровь и грязь. Удалить жировой ткани стерильным скальпелем.
    4. Добавить 2 мл раствора коллагеназы и фарш ткани с скальпелем, инкубировать при 37 ° С в течение 45 мин до 1 ч, в зависимости от размера ткани.
    5. Передача переваренной ткани на 15 мл коническую трубку, промыть в чашку Петри с 2 мл питательной среды фибробластов в два раза, и собирать среды в той же трубе.
    6. Гранул клетки при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    7. Жидкость над осадком сливают и промывают осадок с 3 мл среды фибробластов, чтобы удалить коллагеназы, затем гранул клетки снова. Пожалуйста, обратитесь к таблице Материалы для состава массовой информации.
    8. Повторите шаг 1.2.7 еще один раз.
    9. Повторное приостановить осадок в 5 мл фибробластов средних и пластинчатых клеток на Т25 стерильного тканевой культуральной колбы. Инкубируйте колбы при 37 ° C с 5% CO 2.
    10. Оценить культуры для крепления фибробластов и рост в течение ближайших 1-3 дней. <BR /> ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мелкие кусочки ткани также может приложить к плите и фибробласты мигрируют из этих тканей штук.
    11. Поддержание культуры в тех же условиях до тех пор, пока фибробласты выращивали до приблизительно 80% слияния.
    12. Сбор фибробласты трипсинизацией и передать на свежие культуры колбах для дополнительного расширения. Выполните трипсинизации промывкой культур 3 раза в 1X PBS бесплатно Са ++ и Mg ++. Добавить трипсин-ЭДТА (см материалы таблица) к клеткам (2 мл / Т25 колбы) в течение 2 мин при 37 ° С.
    13. Сплит отдельные клетки в дополнительные колбы. Если некоторые кусочки ткани остаются прикрепленными к оригинальным колбы Т25, добавить 5 мл свежей культуральной средой в эту колбу и больше фибробласты мигрируют постоянно.
      Примечание: расширен культуре фибробластов могут быть заморожены вниз, как Р1 и хранили в жидком азоте для будущих экспериментов.

2. Иммортализация миогенных клеток

  1. Кормовые клетки 30 мин до трансфекции с 5 мл свежей средой с добавлением 10 мМ кофеина.
  2. Однородный смесь 2 мкг плазмидной ДНК из миди преп (CDK4 или hTERT плазмиды) и PolyJet и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин, в соответствии с рекомендациями производителя.
  3. Добавить плазмиды / POLYJET смесь на PE клеток ночь.
  4. Поток клетки свежей средой (DMEM, и среда 199 в соотношении 4: 1, с добавлением 10% сыворотки теленка). Двенадцать часов спустя, собрать вирус, содержащий супернатант и фильтровать ее через фильтр размер 0,45 мкм пор.
  5. Использование 1 мл собранной супернатант заразить в течение ночи PA317 амфотропный упаковка клеточной линии 5 и получить стабильный вируса-продуцирующих клеток линии после выбора либо с 0,5 мг / мл неомицина (G418) для CDK4 или 0,5 мг / мл гигромицину для hTERT.
  6. Подготовка рабочих вирусные супернатанты путем выращивания устойчивых упаковочных клеток почти до слияния, затем уборки супернатант каждое утро и вечером, и утром в течение трех урожаев.
  7. Фильтр вирусные супернатанты и либо сразу использовать или разделить их на 1 мл аликвоты и хранят при -80 ° С для последующего использования. Обратите внимание, что вирусная супернатант теряет 50% эффективности инфекции с каждым замораживания-оттаивания. Помните, чтобы отбелить стирка, прежде чем выбросить все, что коснулся вирусные частицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: стабильная PA317 вирус-продуцирующих клеточная линия может быть заморожен и выдерживают при -150 ° C для постоянного хранения (замораживание среды составляет 10% ДМСО; 90% сыворотки).
  8. Пластина FACS-очищали миогенные клетки (как описано в шагах 1,1-1,9) при плотности 5 х 10 4 клеток / лунку в 6-луночных планшетах, покрытых 0,1% желатином. Убедитесь, что клетки прикреплены к пластине, прежде чем приступить к вирусной инфекции.
  9. Добавить 400 мкл фильтруется, Freshly производится вирусный супернатант или замороженные аликвоты для каждого шесть-луночного планшета в течение ночи (держать 2 скважин в качестве контроля).
  10. Изменение среды путем подачи клетки с 2,5 мл / лунку свежим мышечной информации (4: 1, модифицированного Дульбекко среде Игла (DMEM), и среды 199, дополненной 15% фетальной бычьей сыворотки; 0,02 М HEPES буфера, 1,4 мг / л витамина В12; 0,03 мг / л ZnSO4, 0,055 мг / л дексаметазона, 2,5 мкг / л фактора роста гепатоцитов и 10 мкг / л Основной фактор роста фибробластов). Откажитесь от средств массовой информации и пипетки, содержащие вирусные частицы в хлорной тары. Оставьте клетки в той же среде в течение 3 дней, чтобы восстановиться после инфекции, затем обрабатывают для выбора с использованием либо 400 мкг / мл неомицина (CDK4 инфекции) или 300 мкг / мл гигромицина (hTERT инфекции).
  11. Поддерживать клетки под выбора препарата до клеток в контрольной блюдо умереть (1-2 недели).
  12. Прохождение клетки, прежде чем они становятся сливной (60-80% слияния, использование 0,05% трипсина ЭДТА), даже во время Selectiна период. Replate клетки в несколько 10см блюд со свежими миобластов среды (как описано в 2,11), с добавлением выбора препарата. Поддержание увековечили выбранные ячейки представляют собой гетерогенную популяцию или клонировать, чтобы получить полностью однородную генетический фон (те же вставки трансгена в каждой клетке).
  13. Выполните клонов выбор, используя следующие шаги:
    1. Семенной клетки с низкой плотностью (например, от 300 до 500 клеток в 10 см чашки) и поддерживать их в течение приблизительно двух недель, пока небольшие колонии не образуются (10-20 клеток).
    2. Удалить большинство среде в этой точке, оставляя лишь тонкую пленку, чтобы предотвратить клетки от высыхания.
    3. Поставьте клонирования кольцо (с одним концом, смоченной в силиконовой вакуумной смазки) по каждой нужной клона и добавить несколько капель трипсина / ЭДТА.
    4. Урожай клетки, когда они округляется тщательно аспирации клеток с использованием наконечника 1 мл или пипетки Пастера и передачи их наименьшим доступным многоямного плаTE (96 или 48, 24 или 12-луночные планшеты).
    5. Expand клонов, сколько необходимо для предотвращения местного слияния.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 1 иллюстрирует некоторые из основных шагов при диссоциации первичной ткани: Точное количество ткани, взвешивают в стерильной культуре ткани чашках Петри (1А, Б). Затем ткань тонко измельченного с помощью стерильных скальпелей, пока ткань суспензию получают (фиг 1С, D). После добавления пищеварения ферментов, первичной мышечной ткани диссоциации обычно достигается путем ферментативного расщепления течение 45-90 мин. Прогрессирование ткани пищеварения, как правило, контролируется каждые 15-20 минут, чтобы предотвратить overdigestion и гибель клеток. Ферментативное расщепление может быть слегка пипетировали и смешивают несколько раз в 15-20 мин. В конце стадии варки, клетки фильтруют через 100 мкм (фиг 1E, F), а затем 40 мкм фильтр. В зависимости от количества исходного мышечной ткани и будет ли получена выборка из мягко или серьезно пострадавших мышц, диссоциированного основного челLs будет гетерогенным. рис 1G показан пример мононуклеарных клеток в суспензии сразу же после пищеварения, а на фиг 1H показан пример диссоциированные первичные элементы 3-6 ч после расщепления и покрытие в чашках для тканевых культур. Миогенные клетки обычно будут смешивать с фибробластами и клетками адипогенных. Иммунные клетки могут также присутствовать в тех случаях, когда воспаление, связанных с болезнью пациента. Таким образом, потенциальный разделение различных типов клеток может оказаться желательным. Для перспективного изоляции миогенных клеток человека, CD56 или N-CAM широко используются в качестве надежного маркера 6-9. Эта очистка может быть полезным сразу после изоляции для обогащения миогенными предшественников и до процесса клеток Иммортализация. Кроме того, иммортализация первичных элементов может быть выполнена в первый, а затем иммортализованных миогенные клетки могут быть отобраны на основе экспрессии CD56 на FACS. Схему нашаги, необходимые перед FACS сортировки и примера профиль FACS показано на фиг.2. Вкратце, первичные клетки подсчитывали и ресуспендировали при высокой концентрации, как указано, то первичное антитело (т.е. против CD56) добавляют к клеткам и инкубируют в течение 30 минут на льду. После промывки клетки анализировали с помощью флуоресцентного активированного сортировщика клеток и очищают (рис.2) .Отель приблизительный выход из CD56-положительных клеток варьирует от образца к образцу, в пределах от 40-70% от общего объема мононуклеарных клеток. Выход изменяется в зависимости от возраста человека и является ли миогенные клетки извлекаются из непораженной или больной мышцы. Независимость мышцы, как правило, имеет высокий процент миогенными клеток, в то время как дистрофические мышцы часто имеет более низкие проценты CD56-положительных клеток. Очищенные клетки высевают в полную среду роста миогенного (см Материалы таблицу). Клетки могут быть пассируют путем обработки трипсином, когда они пастьч 60-70% слияния. CD56 выражения клетки миогенная и способны образовывать мышечные трубки в пробирке 10,11 .The увековечение миогенных клеток требует последовательного трансфекции двух генов 12,13 (как схематизированы на рисунке 3). Cyclin зависимой киназы 4 (CDK4) используется для преодоления стресса культуре ткани из-за неадекватных условиях культуры, и человек теломеразы обратной транскриптазы (hTERT) предотвращает укорочение теломер благодаря явлению репликации конец 12. Оба предварительно вирусные плазмиды в базовой вектора pBAbe. Мышь CDK4 кДНК конструкция содержит ген устойчивости к неомицину и hTERT кДНК конструкция содержит ген устойчивости к гигромицину. Последний также содержит Вирус простого герпеса тимидинкиназы (ТК) и кассету сайты LoxP помещенный в обоих концах hTERT / TK кассеты. Это позволяет иссечение всего блока выражение на Cre рекомбиназой 14 и контр-селекции с использованием ганцикловир.

Недавно иммортализованных клеток может быть сохранена в популяции, где вирусы, интегрированной в различные сайты, или клонированного, чтобы получить полностью гомогенного генетический фон (один вставку в геном клетки и его потомство). В большинстве случаев, изолируя клонов из одного главного население будет результат в незначительных различий между клонами в зависимости от вставке кассеты в геном клетки. Кроме того, обширная культура ткани будет способствовать выбор клеток с преимуществом роста, а не те, которые отличают. Яsolation одиночных клонов сделано просто путем посева клеток при низкой плотности (например: от 300 до 500 клеток в 10 см чашки) и культивирование в течение двух недель, пока небольшие колонии не образуются (10-20 клеток). Большая часть среды удаляют, оставляя лишь тонкую пленку, чтобы предотвратить клетки от высыхания. Клоны трипсином, используя клонирования кольца, а затем расширить по мере необходимости. Расширенные иммортализованных клонов могут быть проверены на экспрессию общих миогенными маркеров клеток, таких как CD56, по FACS десмина и экспрессии MyoD с помощью иммунофлуоресценции или myotube формирования при дифференциации. Мышечных трубочек наиболее очевидным, когда сливные миогенные клетки (90% слияния) размещаются в дифференциации среды (DMEM и среднего 199 в соотношении 4: 1, с добавлением 2% лошадиной сыворотки) через 3-5 дней (рисунок 4). Никакие различия не были замечены в myotube образования и сокращения, способность myotube между неправительственными иммортализованных клеток контроля и иммортализованных клеток (видео 1 и 2).

(Рисунок 5). Примеры кривых роста показаны на фиг.5А, где укорочение теломер наблюдалась клетки были расширены в течение длительного число проходов. И наоборот, успешное увековечение связано с увеличением активности теломеразы (Рисунок 5)

Рисунок 1
Фигура 1:.. Иллюстрации критических этапов для диссоциации первичной мышечной ткани человека (A) весом пустого культурального планшета, до размещения ткани и (B) ниже размещения ткани (С) Стерильные скальпели используются, чтобы фарш ткани, до (D) тканей, чтосебе сводится к суспензии. Добавляют Коллагеназа и диспаза и ткань переваривается 45-90 мин, затем пищеварения фильтруют через нейлоновый фильтр сетка для отмены мусора (E, F). (G, H) примеры недавно диссоциированных клеток высевали сразу после диссоциации (G ) или 3 часа после диссоциации, когда первичные клетки начинают оседать (H).

Фиг.2
Рисунок 2:. Последовательность процедур, вовлеченных в окрашивании миобластов человека перед очисткой с помощью флуоресцентной активированный клеточного сортера будут выделены важные шаги для окрашивания клеток человека перед анализом FACS. Примеры FACS участков также показаны. Отрицательный контроль (левая панель) используется для установления сортировки ворота. В правых панелей, положительные клетки, экспрессирующие CD56 являются закрытого типа, и PercentaGE положительных клеток показано на рисунке. Эта стратегия может быть использована для очистки миогенные клетки либо до или после иммортализации процедуру Иммортализация.

Рисунок 3
Рисунок 3: Схема производства Касперского для миобластов увековечении. Рабочий процесс производства ретровируса используется, чтобы увековечить миобластов. Плазмиды конструкция, содержащая либо CDK4 или floxed hTERT-TK кассету в pBabe позвоночника (слева) трансфицировали в экотропным Phoenix (PE) упаковка клеточная линия ночь (8-12 ч), используя POLYJET. Затем супернатант переносили после фильтрации на Phoenix амфотропный линии упаковочные клетки (PA317). Супернатант от этих клеток может быть использована непосредственно, или клетки могут быть выбраны с любым неомицин или гигромицину для генерации стабильной клеточной линии для будущего использования. Порции фильтERed супернатант можно хранить при -80 ° С для последующего использования (с потере эффективности 50%). Bleach используется для очистки все расходные используется во всех точках процедуры.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Схема обратимого миобластов увековечении Workflow процедуры увековечении (вверху): Первичные клетки сначала трансфицировали CDK4. После выбора неомицин, миобластов трансфицировали с floxed кассеты hTERT, содержащей два маркера отбора; HSV-TK и Гигромицин. При желании в более позднее время, hTERT кассета может быть "floxed" путем экспрессии Cre рекомбиназу и выбора для удаления с ганцикловир. Это позволяет "повторного mortalization" из миобластов и повторного инициирования укорочение теломер. Если теломеры 20 Кбайт, то это еще позволяет сотни удвоений, и избегает т он усложнение над экспрессии hTERT. Наконец, изогенных клонов из увековеченный населения могут быть выделены. Myogenicity из вновь иммортализованных клеток может быть показано с помощью специфических маркеров мышечных клеток, таких как десмина (нижней левой панели, клеток в среде для роста, окрашенных анти-десмина, клон D33, зеленый). Этот клон так миогенная, что дифференцированные клетки видны, даже если клетки поддерживают в условиях распространения. Когда клетки дифференцируются в дифференциации среды (с 2% лошадиной сыворотки, средняя и правая панели) myotube образование становится очень обширна. Почти все клетки, окрашенные в MF20 антител к эмбриональной тяжелой цепи миозина (зеленый) и мышечных трубочек несколько ядер DAPI окрашивания (синий, все изображения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

ле / ftp_upload / 52307 / 52307fig5highres.jpg "/>
Рисунок 5: Проверка процедуры увековечение. () Кривые роста изогенной клонов из первичной миобластов, бессмертной населения (миобластов hTERT-CDK4) и повторно mortalized клона (миобластов floxed hTERT-CDK4) показаны в качестве примеров. Никаких различий в темпах роста не были обнаружены до того, как клетки достигают старение. Укорочение теломер контролировали в зависимости от удвоений популяции и длины теломер была измерена с помощью TRF. (B) TRF показаны примеры ранних временных точек и репликации в конце миобластов (5 временных точках от PD 13 до 75), повторно mortalized миобласты после hTERT иссечение (3 временных точек от PD 62 до 152) и иммортализованных миобласты (PD 75 и 200). (С) Успешная hTERT инфекции приводит к увеличению активности теломеразы. Активность теломеразы оценивали с помощью ddTRAP (ddTRAP считывания, справа; количественной оценки анализа, слева) 15 в клетках перед и после HteRT-инфекции. hTERT удаление отменено активность теломеразы в исходное порога видели в миобластов. Результаты представлены в виде полных продуктов теломеразы, полученных на ячейку эквивалента (фон исправлено). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео.
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео.

Видео 1 и 2. мышечные трубки были получены из клеток до и после процесса Иммортализация. Клетки выращивали до слияния в средах роста и перешли к дифференциации средств массовой информации в течение 10 дней. В обоих видео, функциональные сокращения одного или более мышечные трубки могут быть обнаружены. Запись спонтанного подергиваниябыло сделано с помощью линзы 20X. Никаких различий не наблюдалось между увековечены и не иммортализованных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Клетки как полезный ресурс

Выделение и культивирование миогенных клеточных популяций является чрезвычайно полезным при установлении заболевания фенотипа или в пробирке моделей болезни. Миогенного процедура изолятор описано здесь, дает возможность изолировать миобластов и фибробластов из скелетных мышц образцов, которые затем могут быть размножены, дифференцированных или сразу анализировали. Миобластов структура и функция может быть оценена с помощью микроскопического исследования, оценка выживаемости клеток, оценки клеточного слияния, или через молекулярных исследований РНК или экспрессии белка. Кроме того, Миобласты могут быть дифференцированы в мышечных трубочек, которые разделяют многие черты незрелых мышечных волокон, что позволяет непосредственно оценить функции миобластов в контексте развития и восстановления мышц после повреждения ткани. Хотя все эти фенотипы, как правило, достаточно воспроизводимой в начале проходов миогенными клеток, поведение многих первичного мyogenic клеточные линии могут быть изменены в течение многих пассажей. В результате, иногда желательно, чтобы увековечить данное миогенный клеточной линии (как описано здесь), который может облегчить легкость создания культуры и генерацию воспроизводимых результатов в течение более длительного периода времени.

Выбор конкретных клеточных популяций

Этот протокол описывает выделение клеток из миогенными ткани скелетных мышц с использованием FACS в качестве схемы очистки. Предлагаемая стратегия выбора клеток включает в себя использование пропидийиодидом (индикатор мертвых клеток) и CD56 (маркер миогенных клеток), чтобы отличать живые, миогенные клетки от мертвых клеток, мусора, и без миогенных клеток. Элементы, содержащиеся в положительном населения CD56 будет включать миогенные предшественники, способные образовывать мышечные трубки, в то время как CD56-отрицательными населения будет включать не-миогенные клеток, включая фибробласты и, возможно, адипогенных клеток. Каждый из этих фракций можетбыть независимо культивировали для получения клеточных культур миобластов или фибробласты, и потенциал для установления культур фибробластов параллельных могут быть полезны для независимых клеток или банковских ДНК упражнений или в качестве дополнительных условий управления для анализов выполняется на культурах клеток миогенными. Есть несколько других вариантов для выбора конкретных myoblastic и фибробластов клеточных культур из сброженных мышечной ткани, в тех случаях, когда FACS сортировка является нежелательным или недоступен, которые описаны в другом месте 16,17. Одним из альтернативных методов для разделения myoblastic и фибробластов клетки предполагает использование дифференциальных свойств адгезии между этими двумя типами клеток, чтобы обогатить последовательными прохождениями клеток для данного типа клеток. Как фибробласты придерживаться пластика гораздо легче, чем миобластов, позволяя клеточные суспензии инкубируют на пластике в течение приблизительно 1 ч при установлении или пассирования клеток и затем супернатант покрытие на другой чашке будет RESUл при удалении многих фибробластов из клеточной суспензии 18.

Утилита фибробластов против Миобласты

Мышечные биопсии от пациентов, как правило, используются для очистки первичных клеток мышц, однако больные миобласты не могут эффективно пролиферируют и может только пройти небольшое число делений в пробирке, что требует клеток иммортализацию достичь большого числа делений, необходимых. Учитывая, что оба фибробласты и миобласты могут быть выделены из мышечных биопсий, как клеточные фракции должны быть сохранены из клинических образцов, так как они могут быть полезны как и предлагают много универсальность для последующих применений. Например, фибробласты могут быть использованы для генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), которые весьма перспективным для генерации неограниченное количество клеток и потенциально могут быть индуцированы к дифференцировке в нескольких клеточных линий. Эти особенности очень желательно для клеток, полученных от пациентас редкими заболеваниями, которые потенциально могут быть устранены в пробирке или используемых в экспериментальных фильмов наркотиков в поисках терапевтических соединений. Иммортализованные миобласты могут быть также использованы для скрининга на основе лекарственной. Фибробласты также может быть эффективно преобразовано в направлении миогенного судьбы инфекцией с вирусом, экспрессирующим MyoD 19-21. Этот метод был эффективно проверена с помощью фибробласты, выделенные из пациентов с заболеваниями мышц и подтвердили, что MyoD экспрессирующих фибробласты могут эффективно образовывать мышечные трубки, которые экспрессируют зрелые белки мышц. Таким образом, оба типа клеток могут быть эффективно использованы в нескольких последующих применений и предоставлять ценную материал для диагностических и терапевтических исследований.

Влияние увековечении

Иммортализация нормальных диплоидных клетках позволяет приготовить стабильную клеточную линию человека, которые могут быть полностью охарактеризованы и исследованы с помощью различных лабораторий. Первичные культуры от независимогоизоляция может варьироваться, и их общая мощность пролиферативной может быть переменной, когда повреждение вводится в процессе диссоциации или overdigestion, которые могут исказить поведение культуры. Иммортализация клеток с использованием экспрессию каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) имеет то преимущество, чтобы поддерживать стабильный клеточный фенотип и диплоидные клетки остаются. Там были доклады на мышах, что теломераза может модулировать пути Wnt 22. Мы не наблюдали этот феномен в клетках человека. Тем не менее, чтобы избежать такого потенциального осложнения, hTERT кассета по бокам с LOX-сайтов, так что она может быть удалена после того, как теломеры были удлиненными. Длинные теломеры придают сотни дополнительных подразделений, как правило, достаточно провести большинстве экспериментов.

Потому что непрерывное расширение клеток всегда обеспечивает селективное преимущество для быстрого роста, клеточный фенотип может иногда стать предвзятым из-за зарастания наиболее быстро делящиесяклетки, а не лучших дифференциации клеток. Хотя это еще не доказано, чтобы быть серьезной проблемой с помощью описанного метода, его можно устранить путем оттаивания клетки, которые были заморожены в начале своей истории культуры или клонального отбора клеток, обладающих нужный фенотип.

Наконец, в то время как расширение миогенных клеток вблизи неограниченном количестве есть свои преимущества для скрининга лекарственных средств и возможного моделирования заболевания, текущие методы также имеют собственные недостатки, которые препятствуют использованию этих клеток в качестве терапевтических средств в клеточной терапии или в качестве первичных диагностических инструментов. Оба обширной в пробирке культуры и иммортализации шаги изменяют фенотип мышечных клеток по сравнению с их родного государства. Важно отметить, что эти клетки будут расширены в среде, которая очень отличается от естественного окружения первичной сателлитных клеток в своей нише. Таким образом, увековечены клетки требуют интенсивного тестирования безопасности и, возможно, развитмат ветствующую защитную эк новых методов, если они должны быть вновь введены в мышцах человека пациента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood Baker Company, Inc. Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model  Beckman Coulter Model Allegra 6R If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope Nikon Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source Forma Scientific  Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) Becton Dickinson Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II Roche Applied Science #04942078001 Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D  Roche Applied Science #088882001 Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free GIBCO Life Technologies #14185-052
Bovine serum albumin, fraction V Sigma #05470 Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum GIBCO Life Technologies 11965-092 Contains L- glutamine
RBC lysis solution Qiagen 158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml Sigma P4170 Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry Biolegend 318310 APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE Cell Biolabs RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174 Cell Biolabs RV-102
Pig skin gelatin Sigma G1890-500g Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet  Signagen SL100688
G418 Fisher 345812
Hygromycin EMD Biosciences 400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT not commercially available Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit Qiagen 12143
Medium 199 Life Technologies  Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies  DMEM (11965-092) Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor. Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)  #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).  Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining Developmental Hybridoma Bank MF20 Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining Thermo Scientific MS-376-S0 Clone D33
Horse serum Invitrogen 26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies 11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin Fetal bovine serum: Thermo Scientific SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized Worthington 4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free Lonza 17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes GeneMate/Bioexpress C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels Aspen Surgical 372610
Hemocytometer Hausser Scientific 1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes Bellco glass 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml) Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm) BD Falcon 353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size) BD Falcon 352340 (40µm); 352360 (100µm)
 Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters Millipore SLHV013SL
Cloning rings Corning #3166-8 To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines 
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes Greiner bio-one 628160
Sterile scalpels DeRoyal D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks Techno Plastic Product, TPP 90026 sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
  2. Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
  3. Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
  4. Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
  5. Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
  6. Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
  7. Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
  8. Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
  9. Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
  10. Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
  11. Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454 (2011).
  12. Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
  13. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34 (2011).
  14. Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
  15. Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104 (2014).
  16. Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
  17. Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
  18. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
  19. Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
  20. Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
  21. Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
  22. Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics