Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Robin, J. D., Wright, W. E., Zou, Y., Cossette, S. A., Lawlor, M. W., Gussoni, E. Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling. J. Vis. Exp. (95), e52307, doi:10.3791/52307 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

NOT: insan dokusunun toplanması için protokoller gözden ve Kurumsal IRB komitesi tarafından onaylanmış olmalıdır. Atılan, de tanımlanan insan dokusunun Koleksiyon Boston Çocuk Hastanesi ve Brigham ve Kadın Hastanesi IRB Komiteleri tarafından onaylandı. Aşağıda tarif edilen yöntemler de tanımlanan gelen miyojenik hücre izolasyonu için uygulanmış olan, doku atılır. Tarif edilen yöntemler, razı hasta materyalinin toplanan dokuya uygulanabilir.

1. Hücre İzolasyonu

  1. Kas biyopsisi ve kas hücrelerinin saflaştırılması Ayrılma
    1. Doku miktarını hesaplamak için kas biyopsisi içeren plaka tartılır ve sonra tekrar ayrıldığı için, bir doku kültürü biyo-güvenlik başlığı içinde bir 10 cm doku kültürü plakası önceden ağırlık, vb.
    2. Ince steril neşter, kıyma kas dokusu kullanılarak ve kurumasını önlemek için doku steril 1x HBSS birkaç damla ekleyin.
    3. 3.5 ml di her ekleSpase II ve kas dokusu gramı başına kolajenaz D ile sindirilmiş olan. Bir steril 25 ml pipet ile birkaç kez kıyılmış doku ve enzim çözeltisinin Pipet. 15 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, plaka inkübe ve bulamaç kolayca steril 5 ml pipet da geçene kadar doku sindiremez.
      Not: Doku ayrılma, genellikle 45-90 dakika içinde enzimatik sindirimi ile elde edilir. Ek ayrıntılar için 'Temsili Sonuçlar' bölümüne bakınız.
    4. 329 xg (~ 1,100 rpm) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 ml'lik bir konik tüp ve topak hücreler üzerinde 100 um hücre süzgecinden ayrışmış dokunun, filtre edin steril büyüme ortamı 2 hacim ekleyin. Medya kompozisyon malzemeler Tablo bakınız.
    5. Steril büyüme ortamı içinde 1 hacim pelet yeniden süspanse edin ve 7 hacim alyuvar lisiz çözeltisini ekleyin. 40 mikron hücre süzgecinden çözüm Filtre, ardından t pelet329 x g hızında 10 dakika, oda sıcaklığı için de hücreler.
    6. Bir hemositometrede hücre sayımı, 1 x 10 6 hücre / 100 ul bir konsantrasyonda 1x HBSS,% 0.5 BSA içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Bir kenara koyunuz ~ negatif (lekesiz) kontrol olarak kullanılacak bir tek tüp içinde 250,000 hücre. FACS sıralama tarafından CD56 pozitif hücrelerin düzgün yolluk için gerekli propidium iyodür ve CD56 için kenara ek tek renkli lekeli kontrol tüpleri, ayarlayın. Sıralama kılavuzları hücre veya uygun kontrolleri sağlamak için çekirdek tesis uzmanları sıralama FACS dahil danışmak bakınız.
    7. Leke hücreleri, anti CD56 antikoru 5ul / 10 6 hücreleri ile sıralanacak. 30 dakika boyunca buz üzerinde (kontroller dahil) örnekleri inkübe edin.
    8. 10 mi 1 x HBSS içinde yıkayın örnekler ve pelet hücreleri soğutmalı santrifüj 329 xg (~ 1,100 rpm) 4 ° C sıcaklıkta 10 dakika karıştırıldı.
    9. Sor için örnek 1 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyonda propidyum iyodür eklemeÖlü hücrelerin dışlanması için ted. Floresan aktif hücre sıralayıcı kullanılarak olmayan Miyojenik hücrelerden myojenik CD56 pozitif hücreler arındırın.
  2. Cilt biyopsisi ayrışma
    Not: kas biyopsilerinde, mevcut olmadığında, dermal fibroblastlar hastadan bir deri zımba izole edilebilir. Dermal fibroblastlar miyojenik hücre elde etmek amacıyla MyoD transdüksiyon dahil olmak üzere birçok çalışmaları için malzeme olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, dermal fibroblastlar, ileri çalışmalar için çeşitli hücre tiplerine ayırt edilebilir iPS hücrelerini üretmek için kullanılabilir.
    1. Ulaşım ortamında laboratuvara deri biyopsisi taşıyın. Numune alındıktan sonra, en kısa sürede temel kültürünü gerçekleştirmek. Birincil kültür aynı gün tesis edilemez ise, oda sıcaklığında gece boyunca örnek saklayın.
    2. Laminer akış başlığı içinde steril bir 35 mm'lik petri deri biyopsisi aktarın.
    3. Steril 1 ile bir petri çanağı içinde deri biyopsisi durulayınx PBS kan ve enkaz kaldırmak için. Steril bir bisturi ile yağ dokusu çıkarın.
    4. 2 ml kollajenaz solüsyonu eklenir ve neşter ile dokusunu inceltmek, doku boyutuna bağlı olarak 1 saat ile 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    5. , 15 ml konik tüp ile sindirilmiş doku transferi iki fibroblast kültür ortamına 2 ml petri durulama ve aynı tüp içerisinde ortam toplanır.
    6. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle 200 x g'de topak hücrelere.
    7. Süpernatantı atın ve sonra tekrar, pelet hücreleri kollajenaz çıkarmak için fibroblast orta 3 ml pelet yıkayın. Medya kompozisyon malzemeler Tablo bakınız.
    8. Adım 1.2.7 kez daha tekrarlayın.
    9. Bir T25 steril doku kültürü şişesi üzerine 5 ml fibroblast orta ve plaka hücrelerinde pelet yeniden askıya. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir balon içinde inkübe edin.
    10. Önümüzdeki 1-3 gün içinde fibroblast eki ve büyüme için kültür değerlendirin. <br /> Not: Bazı küçük doku parçaları da plaka takmak olabilir ve fibroblastların bu doku parçaları dışarı göç.
    11. Fibroblastlar, yaklaşık% 80 konflüense kadar büyütülür kadar aynı koşullar altında kültür muhafaza edin.
    12. Tripsinizasyon ile fibroblastlar toplayın ve ek genişleme için taze kültür şişeler üzerine aktarın. Ca ++ ve Mg ++ serbest Kültürlerin 1x PBS içinde 3 kez yıkanarak trypsinization gerçekleştirin. 37 ° C'de 2 dakika için bir hücre (2 ml / T25 şişesi) ile Tripsin-EDTA (bakınız Materyaller Tablosu) ekleyin.
    13. Ek şişeler içine müstakil hücreleri bölün. Bazı doku parçaları orijinal T25 şişeler bağlı kalırsa, bu şişeye 5 ml taze kültür ortamı ekleyin ve daha fibroblastlar sürekli dışarı göç edecek.
      NOT: Genişletilmiş fibroblast kültürü P1 dondurulur ve gelecekteki deneyler için sıvı azot içinde saklanır.

AndMyogenic Hücreler 2. Ölümsüzleştirme

  1. 10 mM kafein ile desteklenmiş taze ortam 5 ml transfeksiyondan 30 dakika önce besleme hücreleri.
  2. Midi hazırlık (CDK4 veya hTERT plazmid) ve PolyJet plazmid DNA 2 ug homojen bir karışım ve üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. Gecede PE hücrelere plazmid / polyjet karışımı ekleyin.
  4. Taze ortam ile besleme hücreleri (DMEM ve 4 arasında bir oranda orta 199:% 10 dana serumu ile takviye edilmiş 1). Oniki saat sonra, virüs içeren süpernatan toplamak ve 0.45 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ediniz.
  5. (G41 gece boyunca amfotropık paketleme hücre hattı PA317 5 enfekte süpernatan 1 ml kullanın ve ya 0.5 mg / ml neomisin ile seçildikten sonra stabil bir virüs üreten hücre hattı elde edilir8) CDK4 veya 0.5 mg / hTERT için higromisin ml.
  6. Sonra üç hasat için süpernatant her sabah, akşam ve sabah hasat, yakın konfluansa stabil ambalaj hücreleri büyüyerek viral üst fazlar çalışma hazırlayın.
  7. Viral süpernatanların, filtre edin ve doğrudan daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de 1 ml'lik numuneler ve deposuna kullanan ya da bölün. Viral süspansiyon her dondurulup çözülerek% 50 enfeksiyonu verimlilik kaybeder unutmayın. Ağartıcı yıkama viral parçacıkların dokundu her şeyi atmadan önce unutmayın.
    Not: kararlı PA317 virüs üreten hücre çizgisi dondurulmuş ve kalıcı depolama için -150 ° C 'de muhafaza edilebilir (orta dondurma,% 10 DMSO,% 90 serum).
  8. Plaka, FACS ile saflaştırılmış miyojenik hücre / göz% 0.1 jelatin ile kaplanmış 6-çukurlu levhalarda 5 x 10 4 hücre yoğunluğunda (1.1-1.9 adımlarda tarif edilmiştir). Hücreler viral enfeksiyon geçmeden önce plaka takılı olduğundan emin olun.
  9. F, süzülmüş 400 ul eklereshly gece boyunca (kontrol olarak 2 kuyu tutun) her biri altı plaka viral süpernatan ya da dondurulmuş alikotları üretti.
  10. 2.5 ml / oyuk taze kas madde (4 hücrelerin beslenmesi ile orta değiştirin: 0.02 M HEPES tamponu, 1.4 mg / L Vitamin B12,% 15 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş 1 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve Medium 199 0.03 mg / L ZnSO4, 0.055 mg / L, deksametason, 2.5 ug / L hepatosit büyüme faktörü ve 10 ug / L, temel fibroblast büyüme faktörü). Bir ağartıcı kap içinde viral partikülleri ihtiva eden ortam ve pipet atın. 3 gün sonra enfeksiyon kurtarmak 400 ug / ml neomisin (CDK4'ün enfeksiyonu) veya 300 ug / ml higromisin (hTERT enfeksiyonu) kullanarak seçimi için tedavi için aynı ortamda hücreleri bırakın.
  11. Kontrol çanak kalıp hücrelerin (1-2 hafta) kadar ilaç seçimi altında hücreleri koruyun.
  12. Hatta selecti sırasında; (EDTA tripsin% 0.05 ile% 60-80 confluency) Geçiş hücreleri birleşik haline gelmeden öncedönemi. Seçim ilaç ile desteklenmiş taze miyoblast ortamı ile birden çok 10 cm tabaklarda Replate hücreleri (2.11 tarif edildiği gibi). Heterojen bir nüfus olarak ölümsüzleştirdi seçilen hücreleri korumak veya tamamen homojen genetik geçmişini (her hücrede transgenin aynı ekleme) elde etmek klon.
  13. Aşağıdaki adımları kullanarak klonal seçim yapın:
    1. Küçük koloniler (10-20 hücreleri) oluşana kadar, düşük yoğunluklu (örneğin 10 cm yemekleri 300 ile 500 hücreler) hücreleri Tohum ve yaklaşık iki hafta boyunca onları korumak.
    2. Kurumasını hücreleri önlemek için sadece ince bir film bırakarak, bu noktada sıvı ortamı en iyi çıkarın.
    3. (Bir ucu silikon vakum yağ batırılmış) ile istenen her klon üzerinde klonlama halka yerleştirin ve tripsin / EDTA birkaç damla ekleyin.
    4. Hasat hücreleri dikkatli bir 1 ml ucu veya Pasteur pipeti kullanarak hücrelerin aspire ve en küçük multiwell pla aktararak yuvarlak hale kezte (96 ya da 48, 24 ya da 12 havuzlu plakalar).
    5. Yerel confluency önlemek için gerektiği gibi klonlar genişletin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 birincil doku ayrışma yer alan önemli bazı adımlar göstermektedir: dokusunun tam miktarı (Şekil 1A, B) steril doku kültürü petri tartılır. Doku bulamaç (Şekil 1C, D) elde edilinceye kadar Doku daha sonra ince steril neşter kullanılarak çekilir. Sindirim enzim ilavesinden sonra, primer kas dokusu ayrılma, genellikle 45-90 dakika içinde enzimatik sindirimi ile elde edilir. Doku sindirimi ilerlemesi tipik Overdigestion ve hücre ölümünü önlemek için her 15-20 dakikada bir kontrol edilir. enzimatik sindirim hafifçe Pipetlenen olması ve bir kaç katını her 15-20 dakikada karışık olabilir. Sindirim aşamasının sonunda hücreler 100 um (Şekil 1E, K) ve daha sonra bir 40 um'lik bir filtreden filtre edilir. Kas dokusu başlangıç ​​miktarına bağlı olarak ve örnek hafif ya da ağır etkilenen kas, ayrışmış birincil cel elde edilipLs heterojen olacaktır. Şekil 1 H sindirimi takiben ve doku kültür tabaklarında kaplama ayrışmış birincil hücreler, 3-6 saat bir örneğini göstermektedir ise Şekil 1G hemen yumuşatıldıktan sonra süspansiyon içinde, tek çekirdekli hücreler bir örneğini göstermektedir. AndMyogenic hücreler genellikle fibroblastlar ve adipojenik hücreleri ile karıştırılacaktır. Bağışıklık hücreleri, enflamasyon, hastanın hastalığı ile ilişkili olduğu durumlarda da mevcut olabilir. Bu nedenle, farklı hücre tiplerinin muhtemel ayrılması arzu edilebilir. İnsan miyojenik hücre adaylarının izolasyonu için, CD56 ya da N-CAM yaygın olarak güvenilir bir göstergesi 6-9 olarak kullanılmıştır. Bu arıtma kısa bir süre Miyojenik atalarıdır zenginleştirilmesi ve hücre ölümsüzlük işleminden önce için izolasyondan sonra yararlı olabilir. Seçenek olarak ise, primer hücre ölümsüzleşmenin önce gerçekleştirilebilir, daha sonra ölümsüzleştirilmiş miyojenik hücre, FACS ile CD56 ekspresyonu göre seçilebilir. Şematik üzerindeönceki ayırma FACS ve FACS profil örneği için gereken adımlar Şekil 2'de tasvir edilmiştir. Kısaca, birincil hücreler sayılır ve hücreler, daha sonra primer antikor (örneğin, anti-CD56) ilave edilir belirtildiği inkübe yüksek konsantrasyonda yeniden süspanse edilir Buz üzerinde 30 dakika karıştırıldı. Bir yıkamayı takiben, hücreler bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı ile analiz edilmiş ve (Şekil 2) CD56 pozitif hücrelerinin .bir yaklaşık verim, toplam mononükleer hücrelerin% 40-70 kadar, bir numuneden diğerine değişir saflaştırılır. verim bireyin yaşına bağlı olarak değişir ve kas hücreleri etkilenmez ya da hastalıklı kas ayıklanır olsun. Distrofik kas genellikle CD56 pozitif hücrelerin alt yüzdelerini sahipken etkilenmez kas genellikle, myojenik hücrelerinin yüksek oranda vardır. saflaştırılmış hücreler, tam miyojenik büyüme ortamı içinde plakalanır (Malzeme Tablo). Bunlar reac zaman hücreler tripsinizasyon ile geçişli olabilirh% 60-70 izdiham. CD56 ifade eden hücreler miyojenik ve (Şekil 3'de şematik olarak) miyojenik hücre .The ölümsüzleşmenin iki gen 12,13 ardışık transfeksiyon gerektirir vitro 10,11 miyotüpler oluşturabilirler. Siklin bağımlı kinaz 4 (CDK4) yetersiz kültür koşulları doku kültürü stres aşmak için kullanılır, ve insan telomeraz ters transkriptaz (hTERT) nedeniyle son çoğaltma fenomeni 12 telomer kısalması önler. Hem ön-viral plazmidler pBAbe omurga vektöründe bulunmaktadır. Fare CDK4 cDNA neomisin direnç geni içeren ve hTERT cDNA yapısı higromisin direnç geni ihtiva eder. ikincisi de hTERT / TK kasetinin her iki ucunda yer alan bir herpes simpleks virüs timidin kinaz (TK) kaset ve loxP sitelerini içerir. Bu gansiklovir kullanarak Cre recombinase 14 ve karşı-seçim tarafından tüm ifade biriminin eksizyonu izin verir.

Yeni ölümsüzleştirilmiş hücreler tamamen homojen bir genetik arka planı (tek ekleme hücre genomuna ve döl) elde etmek üzere, virüs farklı sitelerde entegre veya klonlanmış olan bir popülasyon olarak korunabilir. Çoğu durumda, hücre genomuna kasetinin sokulmasıyla bağlı klonlar arasında küçük farklılıklar olacak sonuçlar, bir ana popülasyonundan klonlar izole edilmesi. Buna ek olarak, geniş doku kültürü büyüme avantajı ile hücrelerin yerine ayırt olanlar seçimini tercih edecektir. Benküçük koloniler (10-20 hücre) oluşana kadar (10 cm tabaklarda 300-500 hücreleri gibi) ve yaklaşık iki hafta içinde yetiştirilmesi tek klonların solation düşük yoğunlukta hücreler, tohumlama ile, sade bir şekilde yapılır. Orta çoğu daha sonra kurumasını hücreleri önlemek için sadece ince bir film bırakarak ayrılmıştır. Klonlar klonlama halkaları kullanılarak tripsinlendi ve gerektiği gibi daha sonra genişletilir. Genişletilmiş ölümsüzleştirilmiş klonları, bağışıklık fluorışıması yoluyla FACS, desmin ve MyoD ifadesi ile CD56 veya farklılaşması üzerine miyotüp oluşumu gibi yaygın miyojenik hücre işaretleyicileri, ekspresyonu için test edilebilir. 3-5 gün sonra (Şekil 4) daha sonra: konfluent miyojenik hücre (% 90 konflüans) (% 2 at serumu ile takviye edilmiş 1, 4 oranında DMEM ve Medium 199) farklılaştırma ortamının yerleştirildiğinde miyotüpleri en belirgindir. Herhangi bir farklılık miyotüp oluşumunda ve ölümsüzleştirilmemiş kontrol hücreleri ve ölümsüzleştirilmiş hücreler arasındaki miyotüp kasılma yeteneği görüldü (Video 1 ve 2).

(Şekil 5) de dahil olmak üzere birkaç yöntem ile analiz edilebilir. Büyüme eğrilerinin örnekleri hücre geçişlerinin genişletilmiş sayıda genleşmiş gibi telomer yağ gözlenmiştir Şekil 5A'da, gösterilmiştir. Bunun aksine, başarılı ölümsüzleşmenin artan telomeraz aktivitesi ile ilişkilidir (Şekil 5)

Şekil 1,
Şekil 1.:. Dokuya yerleştirilmesinden sonra boş kültür plakasının tartılması primer insan kas dokusunun ayrılması için kritik adımlar Çizimler (A), daha önce doku yerleştirilmesi ve (B) (C), steril neşter kıyma için kullanılır Doku kadar (D) doku okendi kendine bir bulamaç haline indirgenir. Kolajenaz ve dispaz ilave edilir ve doku 45-90 dakika için sindirilmiştir, daha sonra sindirim artıkları (E, F). (G, H), ayrışma hemen sonra kaplama taze ayrışmış hücrelerinin örnekleri (G atmak için bir naylon ağ filtre içinden filtre edilir, ) veya 3 saat sonra ayrılma, birincil hücreler) H (yerleşmek başladığınızda.

Şekil 2,
Şekil 2:. Floresan aktive hücre sıralayıcı ile saflaştırmadan önce, insan miyoblast boyama içerisinde yer alan prosedürlerin akışı FACS analizinden önce insan hücrelerinin boyanması için kritik adımlar vurgulanır. FACS araziler örnekleri de gösterilmiştir. negatif kontrol (sol panel) sıralama kapısı kurmak için kullanılır. Sağ panellerde, CD56 ifade pozitif hücreler kapılı ve Percenta edilirpozitif hücrelerin ge gösterilir. Bu strateji, önce ölümsüzleşme veya ölümsüzleşmenin prosedür takip ya miyojenik hücrelerinin saflaştırılması için de kullanılabilir.

Şekil 3,
Şekil 3: miyoblast ölümsüzleşme virüs üretiminin şematik. Retrovirüs üretimi Akışı miyoblastları ölümsüzleştirmek için kullanılır. Bir pBabe omurgada CDK4 veya floxed hTERT-TK kaset ya da ihtiva eden bir plasmid konstruktu (solda) Phoenix ekotropik transfekte edilir (PE), paketleme hücre soyu, gece boyunca PolyJet kullanılarak (8-12 saat). Yüzer madde daha sonra Phoenix amfotropık paketleme hücre hattı (PA317) üzerine filtrasyondan sonra aktarılır. Bu hücrelerden alınan üst faz, doğrudan kullanılabilir ya da hücreler, ileride kullanılmak üzere stabil bir hücre dizisi oluşturmak için neomisin veya higromisin ya da seçilebilir. Filt alikolarıri yüzer madde (% 50 verim kaybı ile birlikte) daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de muhafaza edilebilir. Bleach prosedürünün tüm noktalarda kullanılan her sarf temizlemek için kullanılır.

Şekil 4,
Şekil 4:. Ölümsüzleşmenin prosedürü (üst) 'nın tersine çevrilebilen miyoblast ölümsüzleşme şematik Akışı: Primer hücreler önce CDK4 ile transfekte edilir. Neomisin Seçimden sonra, miyoblastlar iki seçim işaretçileri içeren bir floxed hTERT kaseti ile transfekte edilir; HSV-TK ve Higromisin. Daha sonra İstenirse, hTERT kaset dışarı Cre recombinase ifade ve gansiklovir ile eksizyon için seçerek "floxed" olabilir. Bu miyoblastların ve telomer kısalması yeniden başlatma "yeniden mortalization" izin verir. Telomerlerin 20 kb uzunluğunda ise, bu hala çiftlenmeler yüzlerce izin ve t önler hTERT aşırı ifadesi o komplikasyon. Son olarak, ölümsüzleştirilmiş popülasyonundan izogenik klonlar izole edilebilir. Yeni ölümsüzleştirilmiş hücrelerin myogenicity örneğin desmin (sol alt panelde, bir anti-desmin, klon D33 ile lekelenmiş büyüme ortamı hücre, yeşil) ve kas hücrelerinin spesifik markörleri kullanılarak gösterilebilir. Bu klon hücreleri çoğalma koşulları muhafaza bile farklılaşmış hücrelerin görülür böylece myojenik olduğunu. Hücreler (% 2 at serumu, orta ve sağ paneller) farklılaşma ortamında ayırt zaman miyotüp oluşumu çok geniş olur. Embriyonik miyozin ağır zincir (yeşil) ve miyotüplerinin için MF20 antikor ile boyandı Hemen hemen tüm hücreler DAPI boyama (mavi, tüm görüntüler) tarafından birden fazla çekirdekleri vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

les / ftp_upload / 52.307 / 52307fig5highres.jpg "/>
Şekil 5: ölümsüzleşme prosedürünün doğrulanması. (A) Birincil miyoblast, ölümsüz nüfus (miyoblast hTERT-CDK4'ün) ve yeniden mortalized klonundan isogenik klonların büyüme eğrileri örnek olarak gösterilmektedir (Miyoblast hTERT-CDK4'ün floxed). Hücreler yaşlanmaya ulaşmadan büyüme oranlarında hiçbir fark tespit edildi. Telomer yağ TRF ile ölçülmüştür nüfus katlanmaya ve telomer uzunluğunun bir fonksiyonu olarak izlenmiştir. (B), erken zaman noktalarında ve iskelet (PD ile ilgili 13-75 5 zaman noktaları) geç çoğaltma TRF olan gösterilen örnekler, yeniden mortalized miyoblastlar sonra hTERT eksizyonu (PD 62 152 3 kez puan) ve ölümsüzleştirdi miyoblastlar (PD 75 ve 200). (C) Başarılı hTERT enfeksiyonu telomeraz aktivitesinde bir artış çevirir. Öncesi ve sonrası hte hücrelerde 15, Telomeraz aktivitesi ddTRAP (testinin ölçümü, sol ddTRAP okuma, sağ) tarafından değerlendirildiRT enfeksiyonu. hTERT eksizyon miyoblastların görülen orijinal eşik telomeraz aktivitesini kaldırıldı. Sonuçlar hücre eşdeğer (arka plan düzeltilmiş) başına üretilen toplam telomeraz ürünleri olarak gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Video 1 ve 2 miyotüplerinin önce ve ölümsüzleşmenin işleminden sonra hücreler elde edildi. Hücreler büyüme ortamı içinde büyütüldü ve 10 gün boyunca farklılaşma ortamına geçirilmiştir. Her iki videoda, bir ya da daha fazla miyotüplerinin işlevsel kasılmaları saptanabilir. Spontan seğirmesi KayıtBir 20X lens kullanılarak yapıldı. Herhangi bir farklılık, ölümsüzleştirilmiş ve ölümsüzleştirilmemiş hücreleri arasında gözlenmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Faydalı Kaynak olarak Hücreler

Hastalığın in vitro modellerde veya hastalık fenotipleri kurulurken miyojenik hücre popülasyonlarının izolasyonu ve kültürü son derece yararlıdır. Burada anlatılan Miyojenik hücre izolasyon prosedürü sonra, yayılır farklılaştırılmış, ya da hemen analiz edilebilir iskelet kas örneklerinde, gelen miyoblastların ve fibroblastların izolasyonu sağlar. Miyoblast yapısı ve fonksiyonu, hücre yaşamda kalması, hücre füzyonunun değerlendirilmesi değerlendirilmesi ya da RNA ya da protein ekspresyonunun moleküler çalışmalar ile, mikroskopik inceleme ile değerlendirilebilir. Ayrıca, miyoblastlar doku hasarı aşağıdaki kas gelişimi ve kurtarma bağlamında miyoblast fonksiyonunun direkt değerlendirmesini sağlar olgunlaşmamış myofibers, birçok özellikleri paylaşan myotubes ayırt edilebilir. Bu fenotip tüm Miyojenik hücrelerin erken geçişlerinde oldukça tekrarlanabilir olma eğiliminde iken, birçok ilköğretim m davranışyogenic hücre çizgileri çok geçitler boyunca değiştirilebilir. Bunun bir sonucu olarak, bu (burada tarif edildiği gibi) kültürü kurulması kolay ve daha uzun bir süre boyunca tekrarlanabilir sonuçlar üretilmesini kolaylaştırabilir olan, belirli bir miyojenik hücre hattı ölümsüzleştirmek zaman zaman tercih edilir.

Spesifik hücre popülasyonlarının Seçimi

Bu protokol, bir saflaştırma şeması olarak FACS kullanılarak iskelet kası dokusu miyojenik hücre izole edilmesini tarif etmektedir. seçme hücrelerin önerilen strateji ölü hücrelerden, enkaz ve olmayan Miyojenik hücrelerden canlı, myojenik hücreleri ayırt etmek propidiyum iyodür (ölü hücrelerin bir göstergesi) ve CD56 (Miyojenik hücrelerin bir belirteci) kullanarak içerir. CD56-negatif nüfus fibroblastlar ve muhtemelen adipojenik hücreleri dahil olmayan Miyojenik hücreleri dahil olurken CD56 pozitif nüfus bulunan hücreler oluşturan miyotüplerinin yeteneğine miyojenik atalarıdır içerecektir. Bu parçalardan her biri olabilirbağımsız hücre ya da DNA bankacılık egzersizleri ya da miyojenik hücre kültürleri üzerinde yapılan deneyler için ek kontrol koşulları için yararlı olabilir paralel fibroblast hücre kültürleri oluşturmak için miyoblastların veya fibroblastlar ve potansiyel hücre kültürleri elde etmek için bağımsız bir şekilde kültüre edilebilir. Başka 16,17 açıklanan FACS sıralama istenmeyen veya kullanılamıyor durumlarda sindirilmiş kas dokusu belirli miyoblastik ve fibroblastik hücre kültürlerinin seçimi, diğer bazı seçenekler vardır. Miyoblastik ve fıbroblastik hücreleri ayırmak için bir alternatif metot, belirli bir hücre tipi için hücre arka arkaya pasajlar zenginleştirmek için, bu iki hücre tipi arasındaki diferansiyel yapışma özelliklerinin kullanılmasını içerir. Fibroblastlar kurulması veya hücreleri pasaj ve ardından resu edecek farklı bir tabak üzerine yüzer kaplama yaparken yaklaşık 1 saat plastik inkübe hücre süspansiyonları izin çok daha kolay miyoblastların fazla plastik uygun olarakhücre süspansiyonu 18 birçok fibroblast çıkarılmasına lt.

Fibroblastlarına vs miyoblastların Yardımcı

Hastaların kas biyopsileri, tipik olarak, ancak hasta miyoblastlar etkili bir şekilde prolifere olabilir, primer kas hücrelerinin saflaştırılması için kullanılan ve sadece bu şekilde gerekli olan bölümlerin çok sayıda ulaşmak için hücre immortalizasyonunu gerektiren, in vitro bölümler birkaç sayıda uğrayabilir. Ikisi de yararlı olabilir ve mansap uygulamalar için çok yönlülük sunabilir hem fibroblastlar ve miyoblastlar kas biyopsi izole edilebilir göz önüne alındığında, her iki hücre fraksiyonları, hasta örneklerinden kaydedilmiş olmalıdır. Örneğin, fibroblastlar sınırsız hücre sayıları ve potansiyeli üretmek üzere çok ümit vaat eden uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) oluşturulması için kullanılabilecek çok sayıda hücre soylarının farklılaşmaları için tetiklenebilir edilmesi. Bu özellikler, hastadan elde edilen hücreler için yüksek ölçüde istenebilecektirPotansiyel olarak, in vitro olarak düzeltilebilir veya terapötik bileşiklerin arayışında deneysel ilaç taramalarında kullanılmıştır ender hastalıklar ile s. Ölümsüzleştirilmiş miyoblastlar ayrıca, ilaca-taramalarda kullanılabilir. Fibroblastlar, aynı zamanda etkin bir şekilde MyoD 19-21 eksprese eden bir virüs ile enfeksiyon, bir miyojenik kaderine karşı dönüştürülebilir. Bu yöntem etkili bir şekilde, kas hastalıkları olan hastalardan alınan ekstre fibroblastlar ile test edilmiş ve MyoD ifade fibroblastlar etkili bir şekilde olgun kas proteinleri ifade miyotüpler oluşturabilen teyit edilmiştir. Bu nedenle, her iki hücre tipi etkili biçimde pek çok alt-uygulamalarda kullanılan tanı ve tedavi çalışmaları için çok değerli bir malzeme temin edilebilir.

Ölümsüzleşme Etkisi

Normal diploid hücrelerin ölümsüzleşme biri tamamen farklı laboratuarlar tarafından karakterize ve ele alınabilir istikrarlı bir insan hücre hattı hazırlamak için izin verir. Bağımsız Primer kültürlerizolasyon değişebilir ve hasar ayrıştırma işleminde veya kültür davranışı bozabilir Overdigestion tarafından içeri getirildiği zaman, genel çoğalma kapasitesi, değişken olabilir. telomeraz (hTERT) katalitik alt birim ekspresyonunu kullanarak hücrelerin ölümsüzleşmenin stabil hücre fenotipi muhafaza avantajına sahiptir ve hücreler diploid kalırken. Telomeraz Wnt yolunu 22 modüle ki farelerde raporlar olmuştur. Biz insan hücrelerinde bu fenomeni gözlenmiştir değil. Telomer uzatılmış edildikten sonra kaldırılır ve böylece Ancak, bu tür olası komplikasyonlara yol, hTERT kaseti, lox mevkileri ile eteklenmiştir edilmiştir. Uzun telomerlerin çoğu deneyler yürütmek için genellikle yeterli, ekstra bölümler yüzlerce görüşmek.

Sürekli hücre genişleme her zaman hızlı büyüme için selektif bir avantaj sağladığından, hücresel fenotip bazen nedeniyle en hızlı bölünen aşırı çoğalmasına önyargılı olabilirHücreler, çok iyi ayırt hücrelerden daha. Bu henüz açıklanan yöntem kullanılarak önemli bir sorun olduğunu kanıtladı olsa da, erken kendi kültür tarihinin veya istenilen fenotip gösteren hücrelerin klonal seleksiyon tarafından dondurulan hücrelerin çözülme çözülebilir.

Yakınındaki sınırsız numaralarına miyojenik hücre genişlemesi ilaç tarama ve hastalığın modelleme için avantaj sahipken Son olarak, mevcut teknikler de hücre bazlı terapisinde terapötik araçlar, ya da primer teşhis araçları olarak, bu hücrelerin kullanımını önlemek içsel dezavantajları vardır. Hem in vitro kültürü ve ölümsüzleşmenin adımda geniş kendi doğal yapısında kıyasla kas hücrelerinin fenotipi değiştirin. Önemlisi, bu hücreler kendi niş içinde birincil uydu hücrelerin doğal ortamı çok farklı bir ortamda yayılır. Bu nedenle, ölümsüzleştirdi hücreler muhtemelen yoğun güvenlik test ve develo gerektirirYeni tekniklerin pment insan hastanın kas içine yeniden tanıtılacak eğer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood Baker Company, Inc. Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model  Beckman Coulter Model Allegra 6R If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope Nikon Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source Forma Scientific  Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) Becton Dickinson Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II Roche Applied Science #04942078001 Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D  Roche Applied Science #088882001 Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free GIBCO Life Technologies #14185-052
Bovine serum albumin, fraction V Sigma #05470 Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum GIBCO Life Technologies 11965-092 Contains L- glutamine
RBC lysis solution Qiagen 158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml Sigma P4170 Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry Biolegend 318310 APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE Cell Biolabs RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174 Cell Biolabs RV-102
Pig skin gelatin Sigma G1890-500g Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet  Signagen SL100688
G418 Fisher 345812
Hygromycin EMD Biosciences 400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT not commercially available Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit Qiagen 12143
Medium 199 Life Technologies  Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies  DMEM (11965-092) Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor. Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)  #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).  Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining Developmental Hybridoma Bank MF20 Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining Thermo Scientific MS-376-S0 Clone D33
Horse serum Invitrogen 26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies 11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin Fetal bovine serum: Thermo Scientific SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized Worthington 4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free Lonza 17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes GeneMate/Bioexpress C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels Aspen Surgical 372610
Hemocytometer Hausser Scientific 1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes Bellco glass 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml) Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm) BD Falcon 353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size) BD Falcon 352340 (40µm); 352360 (100µm)
 Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters Millipore SLHV013SL
Cloning rings Corning #3166-8 To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines 
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes Greiner bio-one 628160
Sterile scalpels DeRoyal D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks Techno Plastic Product, TPP 90026 sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
  2. Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
  3. Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
  4. Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
  5. Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
  6. Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
  7. Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
  8. Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
  9. Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
  10. Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
  11. Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454 (2011).
  12. Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
  13. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34 (2011).
  14. Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
  15. Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104 (2014).
  16. Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
  17. Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
  18. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
  19. Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
  20. Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
  21. Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
  22. Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics