In vitro Funktionel karakterisering af Mouse Colorectal Afferent Endings

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J. Vis. Exp. (95), e52310, doi:10.3791/52310 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denne video i detaljer viser en in vitro single-fiber elektrofysiologiske optagelse protokol ved hjælp af en mus colorectum-nerve præparat. Tilgangen giver uvildig identifikation og funktionel karakterisering af individuelle kolorektale afferente. Ekstracellulære optagelser af opformerede aktionspotentialer (APS), der stammer fra en eller nogle få afferent (dvs. enkelt fiber) receptive felter (RFS) i colorectum er lavet af drillet nerve fiber hæfterne. Den colorectum fjernes med enten bækken (PN) eller lumbal splanknisk (LSN) nerve vedhæftet og åbnet på langs. Vævet anbringes i en optagelse kammer, pinned flad og perfunderet med oxygeneret Krebs-opløsning. Focal elektrisk stimulation anvendes til at lokalisere kolorektale afferente endelser, som yderligere testet af tre forskellige mekaniske stimuli (stump sondering, mucosal strøg og periferisk strækning) til funktionelt kategorisere afferenter i fem mechanosensitive klasser. Endings reagerer på ingen af ​​disse mekaniske stimuli er kategoriseret som mekanisk ufølsomme afferente (Mias). Både mekanosensitive og Mias kan vurderes for overfølsomhed (dvs. forbedret respons, nedsat tærskel, og / eller erhvervelse af mechanosensitivity) ved lokal eksponering af RFS for kemikalier (f.eks inflammatorisk suppe (IS), capsaicin, adenosin trifosfat (ATP)). Vi beskriver udstyr og colorectum-nerve præparat optagelse, høst af colorectum med vedlagte PN eller LSN, identifikation af RFS i colorectum, single-fiber optagelse fra nerve hæfterne, og lokaliseret anvendelse af kemikalier til RF. Desuden er udfordringer i udarbejdelse og anvendelse af standardiserede mekanisk stimulation også drøftet.

Introduction

Smerter og overfølsomhed er de fremherskende klager fra patienter, der lider af funktionelle gastrointestinale sygdomme, herunder irritabel tarmsyndrom (IBS), som findes i fravær af tilsyneladende patobiologiske årsag eller vævsskade. For eksempel IBS patienter udviser overfølsomhed, herunder øgede responser til rektal ballon distension og øget følsomhed under normal tarmfunktion samt overfølsomhed af somatisk henvisning (dvs. ømhed til palpering af maveregionen) 1. Fordi målretning kolorektale afferente har vist sig at være effektive til at lindre smerter og overfølsomhed i IBS patienter (fx intra-rektal instillation af lokalanæstetika 2,3; oral indtagelse af guanylatcyklase-C agonist linaclotide 4-6), forbedret forståelse af afferent innervation af colorectum er vigtig.

Visceral afferente, herunder kolorektal afferenterEr i stand til at reagere på kemiske / næringsstof- og termiske modaliteter (fx 7-9). Imidlertid har viscerale afferente reagerer på mekaniske stimuli (dvs. mekanosensitive afferente) været den mest grundigt undersøgt, fordi mekaniske påvirkning (f.eks luminale udspiling, stretch) er dem, der generelt giver anledning til bevidste fornemmelser, herunder ubehag og smerte 10-16. Desuden er organerne også innerveret ved mekanisk ufølsomme afferenter (MIA), almindeligvis betegnet tavse eller sovende nociceptorer 17. Under normale fysiologiske betingelser, behøver Mias ikke reagere på mekanisk stimulation eller har meget høj respons tærskler 18, men kan blive aktive og erhverve mechanosensitivity i patofysiologiske tilstande og bidrage til overfølsomhed.

Brug af in vitro forberedelse og protokol beskrevet her, vi udviklet og anvendt en elektrisk stimulus strategi til søs RCH for modtagelige slutninger, tillader uvildig identifikation af både mekanosensitive og MIA slutninger i colorectum 19. Den kolorektal innervation stammer fra lumbal splanknisk (LSN) og bækken nerve (PN) veje, og omfatter kolorektal afferente, der kan kategoriseres i fem mekanosensitive klasser (serosale, mucosal, muskuløs, muskuløs-mucosal, mesenteriske) og en MIA klasse 20. Brug af denne in vitro forberedelse, fandt vi, at colorektale MIA erhvervet mechanosensitivity (sensibilisere) efter kort eksponering af deres receptive felter til en inflammatorisk suppe (IS), som sensibiliserede 71% af MIA i PN-vejen og 23% af MIA i LSN pathway 19. Vi dokumenteret også langsigtede sensibilisering (op til 28 dage) af MIA i forbindelse med langvarig adfærdsmæssige visceral overfølsomhed (dvs. i mus, der modtog intracolon behandlinger med zymosan 21 eller 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBS) 22) .

jove_content "> Blandt mekanosensitive afferente, muskuløs og muskuløs-slimhindeirriterende afferenter er de eneste klasser, tonisk koder periferisk strækning af colorectum (dvs. er stretch-sensitive) og subserve kodningen af skadelige colorectal udspiling 23,24. Ved hjælp af en computerstyret kraft aktuator anvendte vi en standard, homogent, og reproducerbar ramped stræk i den rundtgående retning af fladtrykt colorectal væv og yderligere kategoriseret stræk-sensitive afferenter med lav tærskel og høj tærskel 23. Desuden tidsforløbet for sensibilisering af stræk -følsom afferenter efter intracolon zymosan 21 eller TNBS 22 behandling svarer til udbrud, vedholdenhed, og / eller nyttiggørelse af adfærdsmæssige visceral hypersensitivitet, hvilket tyder på en rolle stræk-følsom kolorektale afferenter i visceral smerte og overfølsomhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol blev gennemgået og godkendt af University of Pittsburgh Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Fremstilling af Modified Krebs Solution og Test Drug Aliquots

  1. Lav 6 L af modificeret Krebs-opløsning, der indeholder (i mM): 117,9 NaCI, 4,7 KCI, 25 NaHCO3, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 2,5 CaCl2, 11,1 D-glucose, 2 natriumbutyrat, 20 natriumacetat , 0,004 nifedipin (at blokere spontane muskelsammentrækninger) og 0,003 indomethacin (at blokere syntese af endogene prostaglandiner). Brug is-kolde og varme Krebs løsninger til væv dissektion og single-fiber optagelse hhv.
  2. Forbered eventuelle kemiske opløsninger (f.eks IS, capsaicin, ATP) i portioner ved ønskede koncentrationer.

2. Dissektion af Colorectum-nervevæv

  1. Bedøver og aflive hanmus (6 - 8 uger gammel, 20 - 30 g) ien CO 2 kammer ved en strømningshastighed, der fortrænger 10 - 30% af kammerets volumen per minut, indtil mus stoppe vejrtrækningen helt som indikeret ved fravær af brystet bevægelse.
  2. Umiddelbart efter eutanasi exsanguinate ved at skære åbne thorax kammer, perforering af højre atrium, og nedsænke musen kroppen i en rigelig mængde (~ 500 ml) iskold Krebs (4 ° C) opløsning gennemboblet med carbogen (95% O2 , 5% CO 2).
  3. Fjern omhyggeligt alle organer, men kolon og bækken organer. Transekt musen i halvdelen over T12 spinal segment lidt over Mellemgulvet og overføre den kaudale halvdel til en dissektion kammer indeholdende iskold boblet Krebs-opløsning.
  4. Under et stereomikroskop, fjerne blæren og de reproduktive organer ved transecting på deres kryds til urinrøret, og fjern den nedadgående / abdominale aorta, indtil den forgrener i iliaca arterier. Befri PN eller LSN fra deres natur omgivelserg væv ved stump dissektion og følg nerve udefra hoftebenskammen till dens ventrale indgang til L6 og S1 rygsøjle (for PN) eller T13 og L1 rygsøjle (for LSN).
  5. Skær skambenssammenføjning og højre og venstre acetabulumkomponenter leddene, og fjern hoftebenet. Gratis forsigtigt enten PN eller LSN fra vedlagte muskler og bindevæv fra tæt på colorectum indtil hvor nerven kommer ind i rygsøjlen.
  6. Resecere forsigtigt iliaca knoglen for at blotlægge den distale colorectum. Dissekere ud den distale colorectum med vedlagte PN eller LSN i kontinuum.
  7. Overfør colorectum med nerve fastgjort til vådrum af vævet kammeret. Fjern overdreven bindevæv ved yderligere dissektion, og åbn colorectum langs af anti-mesenteriale grænse.
  8. Med mucosal opad, pin mesenterial kant colorectum siden optagelsen rum ind i silikone bunden af ​​chambeR og fastgør antimesenteric længde colorectum en rake kroge forbundet til en kraft aktuator (illustreret i figur 1 og fotograferet i figur 2A).
  9. Forlæng PN eller LSN i optagelsen rum, som er forbundet til vådrum med en mus hul og gate. Læg forsigtigt nerve stammen på et lille glas spejl i optagelsen rum, som giver en hydrofil overflade til den frækhed at holde sig til. Superfuse den vådrum med varmt (30-32 ° C), oxygeneret Krebs-opløsning og fyld optagelsen rum med mineralolie.

3. Single-fiber Optagelse og lokalisering af det receptive Field

  1. Træk forsigtigt tilbage epineurium (nerve kappe) fra PN eller LSN under stereomikroskop ved stor forstørrelse (50 - 60X). Ved hjælp af fine tænger, drille nerve stammen i 5-8 nerve bundter af ~ 100 um tykkelse.
  2. Placer platin-iridium henvisningelektrode i kontakt med Krebs-opløsning i vævet kammeret. Sekventielt placere de enkelte nervebundter på optagelse elektrode fremstillet af det samme materiale.
  3. Brug en blød pensel til at fremkalde APs fra kolorektale afferenter ved forsigtigt strøg op og ned i kolorektal overflade. Find nerve bundt (er), der innerverer tyktarmen gennem påviselig AP (aktionspotentialet) optagelser.
    BEMÆRK: PN og LSN også innerverer urinblæren og andre bækken organer.
  4. Brug et par 30 G kanyle tips til yderligere opdele nerve bundt i fine fascicle filamenter af ~ 10 um tykkelse og placere et individuelt filament på optagelsen elektroden.
  5. Placer runde spids koncentrisk elektrode vinkelret på slimhindeoverfladen til elektrisk at excitere afferente slutninger på suprathreshold stimulus intensitet (10 mA størrelsesorden, 0,5 ms varighed @ 0,3 Hz), som frembringer en mm radius aktuelle spread ~ 2. Flyt elektroden systematisk (~ 1,5 mm trin) Langs længden og bredden af ​​den flade colorectum at lokalisere receptive slutninger.
  6. Når en afferent afslutningen er ophidset, justere elektrode position til at lokalisere stedet for aktivering (modtagelig område, RF), der kræver minimal stimulus intensitet (stimulustærskel). Kassér endelser med stimulustærskel> 3 mA 19.
  7. Beregn ledningshastigheden (CV) fra 1) afstanden mellem stimulerende elektrode på det receptive felt (RF) og registrering, og 2) overledning forsinkelse (fx figur 2B) mellem stimulus artefakt og påbegyndelsen af aktionspotentialet .
    CV (m / sek) = (mm) / ledning forsinkelse (ms).

4. Funktionel klassifikation af mekanosensitive tyktarms- afferenter

  1. Efter at finde en RF ved elektrisk stimulation, gælder følgende tre mekaniske stimuli til RF:
    1. Gennemføre tast stimulus ved at trykke spidsen af ​​en CalibraTed von Frey-lignende nylon monofilament (0,4 og 1 g kraft) vinkelret mod RF på den flade colorectum.
    2. Gennemføre den strøg stimulus ved forsigtigt strøg kolorektal slimhinde med en fine nylon endeløse streng (10 mg kraft) til at generere en lille overflade forskydningsspænding på RF.
    3. Gennemfør perifere strækning ved hjælp af en computer-kontrolleret kraft aktuator, som leverer en skrånende strækning kraft (0-170 mN på 5 mN / SEC) i rundtgående retning langs anti-mesenteriske kant af colorectum via rake kroge er beskrevet i trin 2.8 .
  2. Klassificere afferenter som serosale (kun reagerer på sløve sondering), mucosal (reagere på mucosale strøg og sløve sondering), muskuløs (reagere på omkredsen stræk og sløve sondering) muskuløs / mucosal (reagere på omkredsen strækning, mucosal strøg og sløve sondering), eller MIA (ikke reagerer på nogen af ​​de tre mekaniske stimuli).
  3. For mesenteriske afferenter (kun iLSN innervation), der er vanskelige at aktivere selektivt ved elektrisk stimulering, lokalisere deres receptive endelser ved mekanisk strøg / sondering af mesenteriet.
  4. For stræk-sensitive afferente (muskuløs og muskuløs-slimhindeirriterende), fastlægge den tærskel svar, der defineres som den kraft, der fremkalder den første AP under skrånende strækning.
  5. For serøse afferenter, registrere deres svar på stigende niveauer af punktformig sondering af det receptive felt drevet af computerstyrede force aktuator.

5. Kemisk Anvendelse / Modulation af Receptive Endings

  1. Optag en baseline reaktion på en mekanisk stimulus (dvs. svar på skrånende strækning, punktformet sondering, eller mucosal strøg).
  2. Coat den nederste kant af et stykke slange (messing eller rustfrit stål, 10 mm høj og 4 x 4 mm2 offentlig 4 - diameter 5 mm) med vaseline og placer det over modtagelige felt på colorectum.
  3. FjerneKrebs opløsning inde i slangen, og udsætte det receptive slutning i 3 - 5 min til 170 pi af opløsningen indeholdende den kemiske (r), der skal testes.
  4. Overvåg respons afferent under kemisk ansøgning (nogle afferente er chemosensitive).
  5. Fjern kemisk opløsning og slanger for at afslutte handlingen af ​​kemikaliet. Inden 4 - 6 min, teste afferent reaktion på den samme mekaniske stimulus som i baseline svar.
  6. Genanvende den mekaniske stimulus igen efter tilstrækkelig lang udvaskning (> 15 min).

6. Optagelse og påpasselig AP spikes

  1. Digitalisere elektriske signaler optaget fra axoner ved 20 kHz og gemme dataene på en computer. Overvåg signal on-line ved en audio skærm.
  2. Analyser AP pigge off-line og diskriminere enkelte enheder baseret på principalkomponentanalyse af individuelle spike bølgeformer 25.
    BEMÆRK: En record skal indeholde mere then to let discriminable aktive enheder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Opsætningen er illustreret i figur 1. Det omfatter en skræddersyet væv kammer, der huser colorectum i en silicone-foret vådrum og vedlagte nerve i en tilgrænsende mineralolie fyldt rum. De to rum kammer blev fremstillet af en solid blok af acrylplast med en CNC-maskine; i bunden af ​​begge rum blev efterfølgende beklædt med fast silicone at gøre det let pin ned af kolorektal væv. Ekstracellulære APs fra drillet nerve hæfterne registreres ved hjælp af en støjsvag, batteridrevet differential forstærker med en høj CMRR (CMRR ~ 60 dB). Forstærkningen af ​​forstærkeren er indstillet til x10,000 og båndfilter intervallet 0.3 til 10 kHz. Elektrisk stimulering af colorectum leveres af en optisk koblet stimulator konstant strøm mode via en koncentrisk elektrode i kontakt med colorectal slimhinde. Mekanisk stimulation (kolorektal stræk og punktformig sondering) leveres af ACforce aktuator omputer kontrolleret. En AD konverter og passende software overvåge både stimulering og registrering processer ved at sende spænding kommando output til at indlede mekaniske og elektriske stimuli samt registrering og digitalisering af de ekstracellulære AP signaler fra differential forstærker. For at isolere fra mekaniske og elektriske støjkilder, er vævet kammer, mikroskop og differential forstærker anbragt i et Faraday bur monteret på en pneumatisk luft bord.

Som vist i figur 2A, er colorectum med vedlagte nerve dissekeret ud fra en mus, skåret op langs den anti-mesenteriske kant og fastgjort fladt i silicone-foret væv kammer; nerven er placeret på et glas spejl i den tilstødende optagelse kammeret. Vist i figur 2B er et repræsentativt registrering af en handling potentiale (AP) som reaktion på elektrisk stimulation af RF ved tærskel. AP i denne rekord bagud i forhold til stimulus kunstifact (•) med 49 msek på grund af varmeledning forsinkelse fra RF til optagelsen elektroden, hvilket resulterer i en beregnet ledningshastighed på 0,43 m / sek, og i området af et ikke-myelinerede C-fiber. Vist i figur 2C er typiske reaktioner en afferent på stimuli afleveres (sondering af RF med von Frey-lignende monofilamenter, 1 g, og fine mucosal strøg af RF, 10 mg). Denne record indeholder to let discriminable afferenter; kun den store amplitude afferent reagerer på strøg. Som vist i figur 2D blev afferente svar på sondering også vurderet af en computer-kontrolleret kraft aktuator, der leverer til det samme sted på colorectum en række præcist timede og reproducerbare mekaniske kræfter (5, 10, 20, 40 og 80 mN, 5 sek varighed). Ligeledes rundtgående strækning af colorectum (0-170 mN på 5 mN / sek) er leveret af den samme aktuator med en repræsentant respons vist i figur 2E

Som vist i figur 3, kan colorektale afferenter være funktionelt opdelt i seks klasser baseret på deres respons profiler til tre forskellige mekaniske stimuli (se trin 4.2). Alle afferente endelser undtagen mesenteriske afferenter var placeret ved elektrisk stimulation (e-stim; kolonnen længst til venstre, pile angiver stimulus artefakt). Mekanisk ufølsomme afferente (Mias) reagerer ikke på nogen af ​​de tre mekaniske stimuli. I modsætning hertil alle mekanosensitive slutninger svare sondering (0,4-1,4 g). Blandt dem er muskulære og muskulær-mucosale slutninger også aktiveres af periferisk strækning (0-170 mN) og således kaldes stretch-sensitive afferenter; muskulære-mucosale slutninger også aktiveres ved strøg (10 mg). Mukosa endelser også aktiveres ved strøg (10 mg), men ikke strække og serøse slutninger aktiveres ikke ved enten strækning eller strøg. Mesenteriske endelser identificeres ved mekanisk bfarende mesenterium.

Vist i figur 4A er repræsentative svar fra en stræk-følsom afferent fremkaldt af tre på hinanden følgende omkredsen strækninger adskilt af 5 min. De spike numre er jævnt arkiveret lodret i tre beholdere og vises som stimulus-respons funktioner i figur 4B, afslører høj reproducerbarhed i både svar størrelsesorden (spike nummer) og tærskel respons.

Dette in vitro colorectum-nerve præparat tillader også lokal anvendelse af kemikalier til afferente modtagelige endelser. Eksponeringen for kemikalier er begrænset til regioner i afferente RF ved at placere messing eller rustfrit stålrør på toppen af ​​kolorektal slimhinde fysisk isolere RF fra resten af ​​colorectum. Typiske resultater efter kemisk ansøgning omfatter: direkte aktivering af afferenter efter ansøgning af en syre hypertonisk opløsning (AHS 26 5A), ingen aktivering, men erhvervelse af mechanosensitivity af en MIA efter anvendelse af en inflammatorisk suppe (IS 19; figur 5B), øget respons (dvs. overfølsomhed) over for mekanisk strækning efter anvendelse af IS (figur 5C), og reduceret respons på mekanisk strækning efter ansøgning af cGMP (figur 5D).

Figur 1
Figur 1. Skematisk repræsentation af forsøgsopstillingen. The colorectum-nerve placeret i en to-rums væv kammer og isoleres sammen med differensforstærkeren hoved etape fra andet elektronisk udstyr med et Faradays bur. Hver afferent RF identificeres ved elektrisk stimulering (e-stim) i colorectum og testet af tre mekaniske stimuli: nylon monofilament probing, mucosal strøg, og omkredsen stretch. ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52310/52310fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Et billede gennem stereomikroskopet af det dissekerede colorectum med vedhæftet bækken nerve (A) B -. E viser repræsentative poster. (B) En handling potentiale (AP) fremkaldt af elektrisk stimulation (stimulus artefakt, •). (C) Typiske reaktioner for håndholdte monofilament sondering og slimhinde-strøg. (D, E) Svar på sondering og til periferisk strækning med det computerstyrede force aktuator hhv. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

jove_content "FO: keep-together.within-side =" altid "> Figur 3
Figur 3. Funktionel karakterisering af kolorektale afferente klasser. Afferente ligger ved elektrisk stimulation (e-stim, ↑) i colorectum og kategoriseret i fem mekanosensitive klasser og en mekanisk-ufølsom afferent (MIA) klasse baseret på deres respektive respons profiler til tre mekaniske stimuli:. sondering, strøg, og stræk Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. afferent reaktioner på reproducerbar, computerstyret mekanisk stimulation. (A) Svar på en muskuløs-mucosal afferent til tre på hinanden følgende ramped strækninger (0-170 mN på 5 mN / sek, 5 min inter-stimulus interval). (B) Responses (aktionspotentiale spikes) blev jævnt arkiveret lodret i tre beholdere (0-57, 57-113 og 113-170 MN) og vises som stimulus-respons-funktioner; reaktionstærskel vises i indsatte. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. afferent reaktioner på lokaliseret kemisk ansøgning til modtagelige endelser. (A) Et eksempel på kemosensitivitet en serosale afferent til anvendelse af sure hypertonisk opløsning (AHS). (B) Et eksempel på erhvervelse af mechanosensitivity (overfølsomhed) ved en MIA slutter. Denne MIA svarede ikke direktetil en inflammatorisk suppe (IS), men reagerede på 1,4 g monofilament probing bagefter. (C) Sensibilisering (en stigning i svar størrelsesorden og reduktion i tærskel respons) at strække af en muskuløs afferent efter eksponering af sin slutter til ER. (D) Dæmpning af svaret at strække med en muskuløs-mucosal afferent efter eksponering af sin slutning på cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vitro colorectum-nerve præparat beskrevet her har vist sig at være en kraftig fremgangsmåde til at studere neurale koder funktioner individuelle colorektale afferenter, som pænt supplerer andre ikke-funktionelle metoder (f.eks, cellulære, molekylære og histologiske undersøgelser) på viscerale sensoriske neuroner ( se gennemgang 27 for detaljer). Neuronale mekanismer, der bidrager til nociception og langsigtet kolorektal overfølsomhed er blevet afsløret og farmakologiske manipulationer er udført som har afsløret mål, der kunne afhjælpe visceral smerte. Følgende hovedpunkter i forbindelse med en vellykket gennemførelse af dette præparat behandles nedenfor: 1) reduktion af elektrisk støj, 2) øget signaldetektion, og 3) udvælgelse af et standardiseret stimulus til at vurdere ændringer i afferent kodning. Derudover er adskillige begrænsninger ved denne teknik diskuteret.

Aktionspotentialer (APS) propagating intracellulært langs nerveaxoner har generelt en transmembrane potentiale 100-130 mV. Men på grund af den lille specifikke kapacitans af axon membranen, kun denne relativt store depolarisering resulterer i en lille elektrisk ladning forskydning over cellemembranen, som let kan spredes i det omgivende ekstracellulære væv / interstitiel væske (som har en elektrisk impedans betydeligt lavere end lipidmembranen). For ekstracellulære optagelse fra nerve filamenter / axoner, det elektriske signal er sædvanligvis i området af mikrovolt, tæt på størrelsen af ​​den termiske / hvid støj forbundet med en typisk bioelektriske optagelse setup, rendering støjreduktion første prioritet til vellykket optagelse. Til mest effektivt isolere fra omgivende elektrisk støj, kan det være nyttigt at placere væv Afdeling, optagelse og jordfor- differentialforstærkeren (DC batteridrevne) og stereomikroskop i et Faraday bur. Hvis bevægelsen artefakts forekomme, at placere Faradays bur på en pneumatisk luft bord at dæmpe mekaniske vibrationer er nyttigt. Ideelt set optagelsen og referenceelektroderne, som kommer ind på "+" og "-" havne i differential forstærker, henholdsvis burde have sammenlignelig impedans i forhold til deres fælles grundlag og være placeret tæt på hinanden. Således vil en ekstern støj registreres om ligeligt af begge elektroder og udsat for de strenge fælles mode afvisning af differential forstærker.

I vores setup (figur 2A) er referenceelektroden dyppet i Krebs perfusion opløsning i vævet kammer henviser optagelsen elektrode er i kontakt med en fin nerve filamenter af betydelig impedans. Denne enkelt-elektrode konfiguration med en nontrivial impedans mismatch er normalt ikke ideel til støjreduktion. Men denne konfiguration tilbyder bekvemmelighed placere fine nerve glødetråd til én strømode, hvilket er særlig tiltalende, når du optager fra mus kolorektale nerve filamenter af begrænset længde (10 - 15 mm). Baseret på vores erfaring, single-elektrode konfiguration er acceptable, når peak-to-peak baggrundsstøj er under 20 μV i posten. Ellers ville reduktion yderligere støj kræve en to-elektrode optagelse konfiguration, i hvilken fine nerve filamentet har at være i kontakt med både optagelse og reference elektroder placeret parallelt med hinanden. Alle de store metaldele inde i Faraday bur bør bygge på en stjerne-lignende måde til en ubestridt, en kobber blok i vores setup. Care skal tages for at undgå dannelse af ground loops.

For at sikre en ekstracellulær påvisning af AP'er, det første skridt er vellykket dissektion af colorectum-nervevæv. Klemme eller trække nerve under dissektion skal undgås, hvilket irreversibelt kan beskadige nerven og påvirke AP ledning. Den dissekeret nerve stamceller også brug to være fri for enhver tilsluttet muskelvæv, som lækker kalium når beskadiget og kan blokere nerve ledning ved depolarisering. Denne dissektion færdighed er generelt erhvervet gennem flittige praksis over uger til måneder og kræver en høj grad af øje-hånd koordination og smidighed ved håndtering og anvendelse kirurgiske instrumenter. Desuden, for at undgå beskadigelse af kolorektal væv, den elektriske søgestrategi udnytter en koncentrisk elektrode, der har en stump, afrundet spids og relativt stor diameter (udvendig Φ0.55 mm, indre Φ0.125 mm) og er forbundet til en mikromanipulator med en kompatibel bro, hvilket resulterer i en beskeden mekanisk kraft påføres slimhindeoverfladen (~ 100 mg). For at få et større signal i optagelsen spor, behov for AP-induceret transmembrane strøm kanaliseres og "fanget" på elektroden ved at skabe en lille impedans bro mellem nerveaxon (r), og elektrodeoverfladen. Således epineurium og perineuriet der isolerernerven skal dissekeret fri under processen for at opdele nerven i fine filamenter af ~ 10 um tyk. Fordi AP-induceret transmembrane strøm afleder betydeligt inden for en kort afstand fra Axon membran, en tyndere nerve filament normalt resulterer i et bedre signal-til-støj-forhold på grund af axoner 'tættere på elektrodeoverfladen. I mineralolie kammer, spejlet at nerven er placeret på ofte tiltrækker et tyndt lag af Krebs-opløsning (glasoverfladen er hydrofil). Det er derfor nødvendigt, at optagelsen elektrode og nerve filament ikke er i kontakt med spejlfladen under optagelsen. Eventuelle resterende dråber af Krebs-opløsning, som giver en lav impedans bro mellem elektroden og spejlet overflade (dvs. rangering) vil reducere signal amplitude i posten.

Denne colorectum-nerve præparat tillader undersøgelse af funktionelle ændringer af afferenter efter at udsætteRFS til en række forskellige kemiske mediatorer og fornærmelser in vitro såvel som i forbindelse med langsigtede patofysiologiske tilstande (f.eks colorectums taget fra tidligere behandlede mus). Et objektivt mål for funktionelle ændringer af afferente afhænger af følgende: 1) en standardiseret stimulus med høj præcision og reproducerbarhed og 2) afferente reaktioner, der er robuste og reproducerbare. Af de tre mekaniske stimuli anvendes på colorectum, sondering og strøg stimuli af RF ofte leveres af håndholdte von Frey-lignende monofilamenter. For sondering er monofilamentet normalt kalibreret til at levere en reproducerbar vinkelret kraft, når bøjning. Men von Frey-lignende monofilamenter (0,4 og 1 g) har små og forskellige tværsnitsdiametre (0,2 og 0,3 mm, henholdsvis), hvilket resulterer i en høj nominel spænding, når det påføres vinkelret på kolorektal overflade (124,8 kPa for 0,4 g og 138,7 kPa i 1 g), en intens, punktformet mekanisk stimulus beyond det normale fysiologiske område. Desuden den skarpe kant af glødetråden sandsynligvis forårsager ujævn fordeling af spændinger med fokal peak stress betydeligt højere end den nominelle belastning (stress koncentration). Da det typiske RF størrelse (1 mm 2) er betydeligt større end tværsnittet af et monofilament, og manglende evne til reproducerbart stimulere samme sted med en håndholdt monofilament, er det almindeligt at observere responser gentagne stimuli, der adskiller betydeligt i AP hyppighed og varighed. Som et eksempel, at svarene på probning vist i figur 2C af samme håndholdte monofilament (1 g) varierede betydeligt som sandsynligvis er bidraget til af en manglende evne reproducerbart sonde samme sted og variabel varighed og interval mellem stimuli i træk. Mucosal strøg leveret af en håndholdt filament er ligeledes udfordrende og også en tendens til at fremkalde variable svar fra samme afferent. Stimulus reproducerbarhed kan væreforbedres ved hjælp af en computer-kontrolleret kraft aktuator til at levere præcise sondering (og stræk) kræfter. For sondering, bruger vi en monofilament med en større diameter (f.eks # 6,45, 1 mm), som i højere grad dækker et typisk afferent RF 24,28. Computer-kontrollerede periferisk strækning, i modsætning til andre væv strækker fremgangsmåder rettet mod RF tillader homogen deformation over hele længden af colorectum, hvilket gør det muligt at korrelation med colorectal distension i sin oprindelige cylindrisk konfiguration baseret på sammenlignelig rundtgående mekanisk stress (dvs. 0 - 170 mN strækning svarer til 0-45 mm Hg intraluminale tryk 23). Da strækningen kraft påføres ensartet på det anti-mesenteriske kant, ikke direkte til RF, den fremkaldte lokal mekanisk belastning ved afferente RF er reproducerbar mellem hinanden følgende anvendelser af stretch. Desuden L-typen Ca 2+ kanalblokker nifedipin tilsat til badet til inhibit spontan glat muskelsammentrækning, bidrager til vedligeholdelse af kolorektal overholdelse mellem skrå stretch test 23. Endelig har de afferente reaktioner på skrånende strækning protokol vist sig at være reproducerbar med lille variation i både tærskel stimulus-response funktion og respons (fx figur 4). Således har afferente reaktioner på skrånende strækning været meget anvendt som en objektiv vurdering af ændringer i afferent funktion i at studere neuronale mekanismer visceral smerte og overfølsomhed (f.eks 19-22,24,26,28-31).

Den colorectum-nerve præparat er et stærkt værktøj til undersøgelse af kolorektale viscerale afferente. Men det har også nogle begrænsninger. Først er de axoner af cellen organer de sensoriske neuroner i dorsale ganglion gennemskæres i forberedelsen, er til hinder studiet af molekylære identiteter i disse celle organer (f.eks enkelt celle RT-PCR eller transcriptome analyse af de forskellige klasser af kolorektale afferenter). For det andet, den lave signal-støj-forholdet af single-fiber optagelse kræver optimale kirurgiske dissektion / nerve opdeling færdigheder og støjsvag optagelse, væsentligt begrænser en bredere anvendelse af denne protokol i andre laboratorier. For det tredje kan det in vitro præparat ikke anvendelse på undersøgelser af systemiske faktorer, der modulerer visceral sensation, som det autonome nervesystem, cirkulerende hormoner og cytokiner, tarm mikrobiota, og faldende graduering fra centralnervesystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica MZ16 stereo microscope Leica Microsystems Inc.
Leica IC D camera Leica Microsystems Inc.
Amplifier World Precision instruments, Inc. SYS-DAM80 Low-noise differential amplifier
Two-compartment tissue chamber Custom made
Power1401 Cambridge Electronic Design Limited Power1401 Data acquisition, analog signal input/out
Spike2 v5.02 Cambridge Electronic Design Limited Software package that works with the Power1401
Audio monitor Natus Am 8
Square pulse stimulator Natus S48 To deliver electrical stimuli
Photoelectric isolation unit Natus PSIU6 Stimulus isolation to reduce noise
Concentric bipolar microelectrode FHC Inc. CBFFG75 To deliver electrical stimuli
Dual-mode lever system Aurora Scientific Inc. Series 300C To deliver mechanical stimuli
Forceps Fine Science Tools 11252-00 Forceps with fine tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
  2. Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients. Pain. 105, 223-230 (2003).
  3. Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).
  4. Chey, W. D., et al. Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety. Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).
  5. Rao, S., et al. A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation. Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).
  6. Busby, R. W., et al. Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation. J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).
  7. Mei, N. Intestinal chemosensitivity. Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).
  8. Mei, N., Lucchini, S. Current data and ideas on digestive sensitivity. J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).
  9. Su, X., Gebhart, G. F. Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character. J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).
  10. McMahon, S. B., Morrison, J. F. Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat. J Physiol. 322, 1-20 (1982).
  11. Cervero, F., Sann, H. Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig's ureter: an in vitro study. J Physiol. 412, 245-266 (1989).
  12. Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat. J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).
  13. Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).
  14. Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat. J Physiol. 425, 545-562 (1990).
  15. Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder. Agents Actions. 25, 219-221 (1988).
  16. Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).
  17. Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey. Brain Res. 561, 252-261 (1991).
  18. Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat. J Physiol. 435, 229-242 (1991).
  19. Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).
  20. Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).
  21. Feng, B., et al. Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).
  22. Feng, B., et al. Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).
  23. Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).
  24. Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).
  25. Jolliffe, I. T. Principal component analysis. 2nd, Springer. New York, NY. (2002).
  26. La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).
  27. Christianson, J. A., et al. plasticity and modulation of visceral afferents. Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).
  28. Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).
  29. Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).
  30. Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse. Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).
  31. Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics