Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) spettroscopica Imaging di sezioni di tessuto umano verso Migliorare Patologia

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Sreedhar, H., Varma, V. K., Nguyen, P. L., Davidson, B., Akkina, S., Guzman, G., Setty, S., Kajdacsy-Balla, A., Walsh, M. J. High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology. J. Vis. Exp. (95), e52332, doi:10.3791/52332 (2015).

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Abstract

Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) di imaging spettroscopico è un approccio emergente per ottenere immagini dettagliate che sono associate informazioni biochimiche. Imaging FT-IR di tessuto si basa sul principio che diverse regioni del medio infrarosso sono assorbiti dai diversi legami chimici (ad esempio, C = O, CH, NH) all'interno delle cellule o tessuti che possono poi essere legati alla presenza e alla composizione di biomolecole (ad esempio, lipidi, DNA, glicogeno, proteine, collagene). In un'immagine FT-IR, ogni pixel all'interno dell'immagine comprende un intero infrarossi (IR) dello spettro che può dare informazioni sullo stato biochimico delle cellule che possono essere sfruttati per tipo cellulare o malattia tipo di classificazione. In questo articolo, vi mostriamo: come ottenere immagini a infrarossi da tessuti umani mediante un sistema di FT-IR, come modificare la strumentazione esistente per consentire la funzionalità di imaging ad alta definizione, e come visualizzare le immagini FT-IR. Abbiamo poi presentiamo alcune applicazioni di FT-IRper patologia utilizzando il fegato ei reni come esempi. Imaging FT-IR detiene applicazioni interessanti nel fornire un percorso romanzo di ottenere informazioni biochimiche dalle cellule e tessuti in un percorso che non generi completamente libero-label verso dando nuova visione cambiamenti biomolecolari come parte di processi di malattia. Inoltre, queste informazioni biochimiche può potenzialmente consentire un'analisi obiettiva e automatizzato di alcuni aspetti della diagnosi della malattia.

Introduction

Spettroscopia IR è stato uno strumento di analisi disponibili in qualche forma dal 1930; tuttavia, è stato solo nell'ultimo decennio che l'area di imaging dei tessuti con FT-IR è esploso. I progressi nella FT-IR per l'imaging dei tessuti sono stati guidati in gran parte da tre sviluppi fondamentali: 1) aumento della velocità di acquisizione dei dati a causa della disponibilità di grandi Focal Plane Array (FPA) rilevatori che in genere hanno migliaia di IR rivelatori sensibili 1 , 2, 2) lo sviluppo di algoritmi di elaborazione avanzate e la potenza di calcolo per gestire grandi quantità di dati iperspettrali set 3, e 3) la modellazione di sistemi di imaging FT-IR per massimizzare la risoluzione spaziale di 4,5. Ci sono stati numerosi di alta qualità e molto ampi articoli rivedere il campo della spettroscopia FT-IR recentemente 6-16, oltre a un documento di natura protocolli che illustra le fasi per ottenere punto spettri o le mappe da tessuti 17. In questo articolo, ci concentreremo sulla protocol di ottenere immagini di tessuti utilizzando un rivelatore FPA 128 x 128 in un sistema FT-IR modificato con capacità ad alta definizione.

Imaging FT-IR è stato a lungo suggerito uno strumento potenzialmente auspicabile per l'imaging cellulare e tissutale dovuta alla capacità di ottenere immagini in cui ogni pixel ha una ricchezza di informazioni biochimiche. Imaging FT-IR si basa sul principio che diverse biomolecole in un campione saranno quantitativamente assorbire diverse regioni del medio infrarosso; questo consente la derivazione di un 'impronta digitale biochimico'. Questa impronta digitale era stato dimostrato in molti studi di modificare tra i diversi tipi di cellule e stati di malattia. Diversamente pratica patologia convenzionale quando macchie e marcatori immunoistochimici devono essere utilizzati per la visualizzazione e identificare i tipi cellulari e strutture tissutali che vengono utilizzati per guidare opzioni diagnosi e trattamento, le immagini da FT-IR sono formate sulla base biochimica intrinseca del tessuto. Il techniq attualeue di tessuto colorazione per la diagnosi è in termini di tempo, distruttivo, laborioso, e richiede competenze personale di patologo, mentre FT-IR offre la possibilità di rendere questo processo rapido, non distruttivo, altamente automatizzato, e più obiettivo. Inoltre, FT-IR fornisce un nuovo percorso per ottenere ulteriori informazioni biochimiche che potrebbe non essere prontamente accessibili usando tecniche di colorazione convenzionali.

Uno dei progressi più interessanti degli ultimi anni è stata la disponibilità di approcci di imaging ad alta risoluzione che può ora permettere per la visualizzazione e la caratterizzazione di tipi di cellule e strutture del tessuto che sono fondamentali per una completa diagnosi della malattia. Una di queste tecniche è Attenuated Total Reflectance (ATR) FT-IR che incorpora un obiettivo a immersione solido (SIL) di un alto indice di rifrazione, che consente per imaging ad alta risoluzione 18, con molti studi molto interessanti che mostra le sue applicazioni 19-25. Inoltre, wcome ha recentemente dimostrato che la risoluzione spaziale maggiore associato a immagini ATR può permettere per la visualizzazione e la classificazione delle cellule endoteliali e mioepiteliali nel tessuto mammario che costituiscono una componente chiave della diagnosi di cancro al seno 26. Mentre l'imaging ATR è molto utile, questa tecnica richiede la SIL di entrare in contatto con il tessuto per formare immagini FT-IR; Pertanto, il suo uso è un po 'limitato per patologia dei tessuti in cui le grandi regioni di tessuti devono essere rapidamente ripreso.

Un secondo approccio è stata dimostrata accoppiando un obiettivo ad alto ingrandimento un sistema FT-IR esistente che utilizza un sincrotrone come fonte luminosa di IR, è possibile illuminare completamente un FPA e l'immagine con una dimensione di pixel effettiva di 0,54 x 0,54 micron. Questo ha permesso a noi di visualizzare strutture chiave in seno e della prostata tessuti che non erano risolvibili con sistemi convenzionali FT-IR 4. Mentre questi aumenti drammatici in immagine IR resolutio spazialen fosse emozionante, il suo uso è rimasto limitato a causa di richiedere un sincrotrone. Successivamente, un sistema ottimale creata che potrebbe anche consentire funzionalità di imaging ad alta definizione con una dimensione di pixel 1,1 x 1,1 micron, senza il requisito di una sorgente di sincrotrone bensì utilizzando una sorgente IR Globar tradizionale 5. In questo articolo, vi mostriamo come modificare un sistema di imaging esistente commerciale FT-IR per consentire la diffrazione IR limitato l'imaging dei tessuti con un segnale accettabile per rumore con obiettivi multipli IR (15X, 36X, e 74x). Il formato di pixel effettivi con i tre obiettivi è 5.5 x 5.5 micron (15X), 2,2 x 2,2 micron (36X) e 1.1 x 1.1 micron (74x). Abbiamo poi diamo alcuni esempi dell'importanza dei guadagni in risoluzione spaziale per la rilevazione della malattia in fegato e reni biopsie 27.

Protocol

1. La creazione di un FT-IR Microscopio e Acquisizione tessuto Images

  1. Sezione di un blocco di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina a 4 micron di spessore su un vetrino compatibile IR utilizzando un microtomo. In alternativa, la sezione azoto tessuto congelato liquido a 4 micron di spessore su un vetrino compatibile IR utilizzando un criostato.
    NOTA: In genere, una sezione di serie sarà anche acquisito su un vetrino e tinto con un speciale (ad esempio ematossilina e eosina (H & E)) o macchia immunoistochimica. Inoltre, linee cellulari in coltura possono essere coltivate su vetrini compatibili IR. Diapositive compatibili IR possono essere diapositive riflettenti IR per la modalità di riflessione per immagini (ad esempio, mirrir scivolo, oro) o IR vetrini trasparenti per la modalità di trasmissione delle immagini (ad esempio, BaF 2, CaF 2).
  2. Eliminare il microscopio FT-IR e spettrometro utilizzando aria secca o gas azoto secco per rimuovere l'acqua dal sistema atmosferica. Attendere almeno 45 minuti prima di imaging per garantire un Purg completae.
  3. Raffreddare sia il rivelatore FPA (a 79 K) e il rilevatore MCT interna al microscopio FT-IR usando azoto liquido. Raffreddare i rivelatori circa ogni 6 ore.
    ATTENZIONE! L'azoto liquido è un fluido criogenico e può causare ustioni, congelamento e in spazi chiusi asfissia.
  4. Montare il vetrino del campione sul palco microscopio per l'imaging FT-IR.
  5. Assicurarsi che la luce visibile è "ON" e poi o con il binocolo o il programma di cattura del campione (che fornisce una immagine visibile del tessuto in tempo reale), si concentrano sul campione.
  6. Aprire il pacchetto software pacchetto quali risoluzioni pro e fare clic su 'Collect', quindi su 'Diagnostica' e selezionare 'Allinea Spectrometer'. Verificare che il percorso del fascio per il rilevatore interno spettrometro non sia ostruita.
  7. Clicca su 'Imaging Setup'.
  8. Nella scheda 'Elettronica', selezionare l'appropriata 'Speed', 'Under SaRapporto mpling (UDR) 'e' Impostazioni Filtri "a seconda del sistema.
    NOTA: In questo esempio, l'impostazione è di velocità = 2,5 KHz, UDR = 4 e filtri = nessuno.
  9. Nella scheda 'Ottica' verificare che siano selezionate 'fonte Mid-IR', 'Open di apertura' e 'al 100% fascio attenuatore'.
  10. Per calibrare il sistema, nella scheda 'Ottica', selezionare 'Detector' come 'terra', 'Microscope Detector' come 'sinistra', e quindi selezionare 'trasmittanza' o 'Riflessione' sotto 'mode Optics' a seconda del tipo di scivolare in uso.
  11. Fare clic su Imposta, che aprirà la finestra 'Lancer Control'.
    NOTA: Per la modalità di riflessione seguire le istruzioni in 1.12 e 1.13 e per la modalità di trasmissione seguire le istruzioni a 1,14-1,16. Continuare a 1.17 sia per riflessione e trasmissione.
  12. Per la modalità di riflessione, in &# 8216; 'cliccare su' Lancer controllo Raw '. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell'immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), spostarsi in una zona pulita della diapositiva.
  13. Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. Successivamente, spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto, e perfezionare la messa a fuoco dell'immagine. Change 'Calore' e opzioni 'di contrasto "per formare un'immagine di migliorare la messa a fuoco, questo non avrà alcun effetto sui dati IR. Continuare dal 1.18.
  14. Per la modalità di trasmissione, in clic 'Lancer controllo' su 'Raw'. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell'immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), spostarsi in una zona pulita della diapositiva.
  15. Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi.
  16. Regolare il fondo focalizzazione / condensatore obiettivo di aumentare il numero di conteggi al suo maximum. Vedere la forma dell'immagine in basso a destra in Lancer controllo per assicurarsi che sia gaussiana aspetto e relativamente uniforme. Regolare di nuovo il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi.
    NOTA: Se uno dei pixel dell'immagine interferogramma FT-IR, a sua volta bianco, ridurre il tempo di integrazione.
  17. Spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto e perfezionare la messa a fuoco dell'immagine. Facoltativamente, modificare le opzioni di calore e di contrasto per contribuire a formare l'immagine per migliorare la messa a fuoco, ma non avrà alcun effetto sui dati IR.
  18. Utilizzando il joystick di controllo fase, spostarsi in una zona pulita della diapositiva. Premere il pulsante 'Calibra'. Garantire la 'Out Of Range (OOR)' valore è inferiore a 50 e la differenza tra il 'High Flux' e conta 'basso flusso' è di almeno 4.000 conteggi.
  19. Seleziona 'OK' due volte. Nelle schede ottiche selezionare; 'MCT' 'rivelatore' =, 'Microsfar fronte Detector '=' right 'e quindi su' Setup '. A questo punto ci sarà un interferogramma FT-IR sullo schermo. Clicca su 'Trova Centerburst'. Fare clic su 'OK'.
  20. Nella scheda 'Ottica', riselezionare 'rivelatore' = 'terra', 'Microscope Detector' = 'sinistra' e selezionare 'Setup'.
  21. In Lancer controllo - garantisce che l'immagine è ancora in una zona pulita e fare clic su 'Calibra' di nuovo. Fare clic su 'OK'.
  22. Successivamente, il ritiro immagine di sfondo FT-IR per correggere assorbanza dall'atmosfera, sistema e scivolo. Vai alla scheda 'Elettronica' e selezionare una risoluzione spettrale opportuno, tipicamente di 4 cm -1 o 8 cm -1 per tessuti.
  23. Vai alla scheda 'sfondo' e digitare 128 in "Scansioni di co-add '. Selezionare il 'Nuovo file ...' pulsante e inserire il file di sfondo in appropriate volteer. Controllare scheda 'Imaging' per garantire mosaicatura è 1 di 1. Fare clic su 'Contesto', attendere che la scansione per terminare e confermare dove salvare il file. Fare clic su una regione lo sfondo dell'immagine FT-IR e controllare lo spettro.
  24. Per fare una grande immagine mosaico del campione, selezionare la scheda 'Imaging' e inserire il numero di X e Y cornici per le dimensioni del mosaico che si desidera acquistare.
  25. Fare clic su 'Setup' e in Lancer controllo utilizzare la vista a infrarossi dal vivo per trovare l'area di interesse. Se prendere un mosaico, centrare il feed dal vivo nel centro della zona di interesse. Fare clic su 'OK'. Vai alla scheda 'Elettronica' e digitare il numero di scansioni di co-aggiungere (in genere un valore compreso tra 2 e 16 scansioni per il tessuto). Fare clic su 'Scan'.
  26. Controllare l'immagine FT-IR raccolti sullo schermo per assicurarsi che sembra mirato. Clicca sull'immagine per visualizzare uno spettro IR da quella posizione e controllare che sembra avere un segnale accettabile per il rumore. Acquire un'immagine visibile del campione.
  27. Salvare l'immagine e esportarlo nel formato richiesto, come ad esempio ENVI-IDL.

2. Adattare un FT-IR Microscopio per capacità ad alta definizione

NOTA: La maggior parte dei sistemi FT-IR sono dotati di un obiettivo di circa 15x e 0,5 apertura numerica (NA). Per l'immagine in modalità ad alta definizione, un IR compatibile 36X o 74x obiettivo può essere usato per dare la diffrazione capacità di imaging limitate.

  1. Rimuovere obiettivo 15X del sistema svitando in senso antiorario.
  2. Avvitare la obiettivo 36X o 74x al suo posto. Allineate l'obiettivo prima dell'uso. Utilizzare tubi di prolunga lente di portare l'obiettivo abbastanza vicino al campione.
  3. Collocare il tessuto sotto il nuovo obiettivo e mettere a fuoco utilizzando la luce visibile utilizzando i binocoli o programma Capture Sample.
    NOTA: per immagini ad alta definizione deve essere fatto in modo di trasmissione. La distanza molto ravvicinata funzionamento delObiettivi SE (1-2 mm) e molto poca profondità di fuoco richiede fuoco lentamente e con attenzione, prendendo tempo per abbassare l'obiettivo senza toccare il campione.
  4. Seguire le istruzioni 1,6-1,11.
    NOTA: A causa di essere molto più difficile mettere a fuoco e molto meno luce che raggiunge il sensore, il seguente protocollo è regolata sulla base di 1,14.
  5. In modalità di trasmissione, clicca su 'Raw'. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell'immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), passare al tessuto e concentrarsi (idealmente su un bordo).
    NOTA: Questo può essere difficile, quindi regolare il 'calore' e le opzioni di "contrasto" per formare un'immagine di migliorare la messa a fuoco (queste opzioni non hanno effetto sui dati IR).
  6. Una volta messo a fuoco, utilizzando il joystick di controllo fase e il live view IR recarsi in una zona pulita della diapositiva. Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. Regolare il fondo di messa a fuoco dell'obiettivo diaumentare il numero di conteggi al massimo. Regolare di nuovo il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi.
  7. Spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto, e perfezionare la messa a fuoco dell'immagine.
  8. Se mosaicatura un'immagine ad alta risoluzione, regolare la fase per consentire il movimento corretto richiesto su distanze per mosaicatura precisa. Per modificare le impostazioni della distanza di scena, andare a 'fase Setup' in Lancer controllo e regolare le impostazioni di allineamento orizzontale e verticale per consentire il corretto mosaicatura.
  9. Utilizzando il joystick passaggio di controllo fase verso una zona pulita della diapositiva. Premere il pulsante 'Calibra'. Garantire la Out Of Range (OOR) il valore è inferiore al 50 per entrambi 36X e 74x obiettivi. Assicurarsi che la differenza tra l'alto flusso e bassi valori di flusso è almeno 1000 conteggi per l'obiettivo 74x e 2.000 conteggi per l'obiettivo 36X.
  10. Continuare 1,19-1,27. Il numero di scansioni in 1.23 e1.25 dovranno essere rettificato per segnale ridotto a circa 256 scansioni per l'immagine di sfondo e 16-128 scansioni per l'immagine del tessuto.

3. visualizzare e classificare IR Datasets Spectral

NOTA: In questa sezione, parleremo di come visualizzare ed estrarre i dati da immagini spettrali utilizzando l'elaborazione delle immagini geospaziali e analisi software quali ENVI + IDL, ma il processo è molto simile per qualsiasi software alternativo come MATLAB, software libero come CytoSpec , o il software stesso dello sviluppatore strumento. Ci sono un paio di diverse tecniche di lavorazione spettrale che possono essere eseguite sui dati IR.

  1. Aprire elaborazione delle immagini geospaziali e software di analisi e caricare il file di dati a infrarossi.
  2. Applicare un algoritmo di correzione al basale ai dati IR selezionando "strumenti spettrale" e scorrere verso il basso e fare clic su "spettri di assorbimento". Osservare un menu pop-up e selezionare "Baseline correction "
    NOTA: la correzione della linea di base rimuoverà una pendenza spostamento della linea di base dai dati a causa di dispersione
  3. Eseguire normalizzazione spettrale, da ratioing i dati ad un certo picco spettrale (tipicamente Amide I (1650 centimetri -1) o Amide II (1550 centimetri -1)) o area sotto una regione definita degli spettri. Fare questo selezionando "Normal spettri" sotto i "assorbanza Spectra" Opzioni del menu.
    NOTA: Spectral normalizzazione viene eseguita in modo che eventuali differenze di spettri sono differenze reali biochimiche e non a causa di spessore o di differenze di densità tra i campioni.
  4. Utilizzare un algoritmo di riduzione del rumore per rimuovere il rumore dagli spettri, se necessario 28.
    NOTA: Ci sono diversi approcci disponibili per cui correzione al basale, la normalizzazione spettrale e riduzione del rumore possono essere raggiunti, con la maggior parte dei software con algoritmi automatizzati costruito nel In aggiunta, ci sono un numero emergente di approcci che correggerà per.aberrazioni spettrali, che sono state discusse in dettaglio 29-42; tuttavia, la comunità non è ancora d'accordo su quale di questi sono necessari.
  5. Osservare un elenco di tutte le frequenze IR raccolti all'interno dell'immagine (tipicamente di una gamma spettrale da 900 a 4.000 cm- 1). Istruzioni sulle frequenze corrispondenti alle specifiche biomolecole osservare un'immagine del tessuto alla frequenza selezionata.
    1. Per esempio, cliccare su banda 1650 centimetri -1 osservare la distribuzione delle proteine ​​nel campione. Alternativamente cliccare sulla banda 1080 centimetri -1 osservare la distribuzione degli acidi nucleici nel campione. Utilizzare wavenumber 1.650 centimetri -1.
  6. Crea immagini aggiuntive calcolando rapporti spettrali picco di altezza, rapporti zona di punta, ecc che permetteranno per la visualizzazione di diversi componenti biomolecolari. Clicca su "Strumenti spettrali 'e quindi selezionare' Rapporti di altezza di picco 'o' Calcola Area Immagine 'per creare immagini.
  7. Scansione la sezione corrispondente tessuto adiacente che è macchiato utilizza un intero sistema di scorrimento imager separato che cattura immagini brightfield. L'immagine IR Accanto, visualizzare l'immagine digitale del tessuto macchiato con un programma di immagine visibile.
  8. Fare clic destro sull'immagine in una regione di interesse e selezionare 'profilo Z'. Questo darà le informazioni spettrali al pixel selezionato.
  9. Guardate gli spettri IR di più pixel di più classi, come ad esempio il confronto tipi di cellule, stati di malattia. Segna i pixel specifici sull'immagine utilizzando il 'regioni di interesse' (ROI) strumento. Per eseguire questa operazione, fate clic destro sull'immagine e selezionare 'strumento ROI'. Creare le classi che devono essere etichettati, ad esempio normale, displasia, e le classi di cancro. Selezionare quindi, 'tipo ROI' - 'Point'. Quindi selezionare la classe di selezionare pixel per e disegnare sui pixel appropriate nell'immagine IR via. Ricavare la media spettri fo ciascuna delle classi con lo strumento 'ROI medio'.
  10. Confronta spettri derivata riportando in software grafici.

Representative Results

Imaging FT-IR consente la derivazione di immagini IR di tessuto che possono dare diversi contrasti seconda della frequenza IR di interesse. Inoltre, in un'immagine IR, ogni pixel comprende l'intero spettro IR, con differenti picchi corrispondenti a differenti biomolecole che possono dare informazioni sulle proprietà biochimiche di tipi cellulari o stati di malattia (Figura 1). Qui, abbiamo dimostrato come confrontare le firme spettrali tra le classi, ma più avanzato classificazione automatica è possibile utilizzando algoritmi aggiuntivi 3,43-50, quali la classificazione bayesiana, foreste casuali, reti neurali artificiali e gerarchiche Cluster Analysis è possibile eseguire sul dati. Approcci classificazione supervisionata consentiranno per la costruzione di un classificatore che può essere addestrato per consentire il riconoscimento automatico di tipi cellulari o stati di malattia. Approcci classificazione non supervisionata possono essere utilizzati per cercare naturale difrenze nei tessuti o cellule a causa della varianza biochimica.

Strumentazione FT-IR si è evoluta nel corso degli ultimi decenni, dalla misurazione in un unico punto modalità / mapping tramite IR aperture opachi alla modalità di imaging con obiettivi Cassegrain, utilizzando un obiettivo illuminante accoppiato con un obiettivo di raccolta nella trasmissione-mode o un unico obiettivo che entrambi illumina e raccoglie in riflessione-mode (Figura 2). È stato recentemente dimostrato che l'obiettivo di raccolta in trasmissione potrebbe essere commutata per un ingrandimento maggiore e oggettivo apertura numerica per consentire diffrazione limitata immagini IR, che porta a sostanziali aumenti la risoluzione spaziale delle immagini IR raccolti 4,5. I progressi nella risoluzione spaziale per l'imaging dei tessuti sono stati di fondamentale importanza come ora siamo in grado di identificare i tipi di cellule e strutture del tessuto, per esempio, le unità funzionali del rene, i glomeruli, utilizzando adattato in-houseSistemi FT-IR (Figura 3).

Ad alta definizione di immagini FT-IR consente di ottenere immagini dettagliate di tessuti da esaminare per identificare le regioni anormali e di identificare le differenze biochimiche tra diversi tipi di cellule. In un nucleo tessuto epatico, è possibile visualizzare epatociti e regioni di infiltrazione fibrosi che divide due distinte aree di displasia e cirrosi non displastiche (Figura 4). Stiamo lavorando per sfruttare questo per rendere gli strumenti diagnostici automatizzati per l'utilizzo in casi difficili di malattia del fegato.

È importante sottolineare che la maggiore risoluzione spaziale può ora permettere di isolare specifiche caratteristiche strutturali che possono essere modificati chimicamente dalla malattia prima alterazioni istologiche sono evidenti. Ad esempio, siamo concentrati sull'identificazione cambiamenti biochimici nelle strutture glomerulari renali come capsula di Bowman, mesangio, membrana basale glomerulare e membrana tubolare seminterrato, prima modifiche individuate dal patologo può essere osservato (Figura 5). In particolare, siamo interessati a individuare cambiamenti associati con la progressione della nefropatia diabetica e rigetto cronico nei pazienti sottoposti a trapianto, dove le tecniche attuali non riescono a identificare i cambiamenti in modo abbastanza presto per un intervento di successo.

Figura 1
Figura 1. immagini FT-IR e spettro di un nucleo fegato. Immagine di (A) H & E macchiato nucleo da biopsia epatica e immagini di assorbanza IR della sezione di serie della stessa core a (B) 3.286 centimetri -1 e (C) 2.603 cm -1, che ha evidenziato diverse caratteristiche strutturali. (D) tipico spettro IR del tessuto, con picchi importanti etichettati. Bar Scala = 100 micron.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Ottica dettaglio i modi di funzionamento microscopio FT-IR schematici. (A) in modalità di trasmissione, il campione è illuminato attraverso l'obiettivo di fondo, e la luce che passa attraverso il campione viene raccolto dall'obiettivo top. (B) In modalità di riflessione, l'obiettivo prioritario serve sia per illuminare il campione e per raccogliere la luce riflessa. L'obiettivo di fondo non viene utilizzato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Confronto di different obiettivi del microscopio sulle immagini FT-IR di un glomerulo renale a 2.925 centimetri -1. (A) 15X oggettivi raccolta con NA = 0.5 (dimensioni 5.5 x 5.5 micron pixel). (B) 36X obiettivo di raccolta con NA = 0.5 (dimensioni 2,2 x 2,2 micron pixel). (C) 74x raccolta obiettivo con NA = 0,65 (dimensioni 1,1 x 1,1 micron pixel). Bar Scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. differenze spettrali tra fibrosi e epatociti in un nucleo del fegato. (A) H & E macchiato nucleo da biopsia epatica. (B) L'immagine di un nucleo sezione seriale digitalizzata in FT-IR (36X impostazione oggettiva). (C) Repspettri rappresentativi della epatociti e fibrosi, presi dalle regioni di tessuto indicati dalle frecce in (A) e (B). Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. La differenziazione delle caratteristiche biopsia del tessuto renale attraverso l'uso di imaging ad alta definizione FT-IR. (A) periodica sezione colorata acido Schiff con le caratteristiche da estrarre etichettato. (B) ad alta definizione FT-IR immagine della regione che si estende CH 2 asimmetrica (36X configurazione oggettiva) di una sezione di serie del tessuto stesso. (C) Caratteristiche etichettato (A) estratto utilizzando l'immagine FT-IR in (B) per poter chimicamente differentiate le quattro caratteristiche del tessuto. Bar Scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

FT-IR è una modalità emergente gratis-label di imaging biochimica di sezioni di tessuto, con la possibilità di avere un ruolo importante nel migliorare l'attuale standard di diagnosi in patologia. Il gold standard attuale per la patologia richiede tessuti essere sottoposte a biopsia, fissati in formalina, inclusi in paraffina, sezionati più volte, e colorati con diversi macchie. Un patologo altamente qualificato deve valutare soggettivamente visivamente la struttura del tessuto e la morfologia cellulare per stabilire una diagnosi. Qui vi mostriamo come raccogliere immagini a infrarossi ad alta risoluzione dello stesso tipo di sezioni e discutere alcuni degli approcci computazionali per esaminare le differenze chimiche tra i tipi di cellule e stati di malattia.

I passaggi critici all'interno di questo protocollo sono di assicurare che i tessuti sono molto attentamente concentrati e che il sistema è ben calibrato per garantire dati spettroscopici di altissima qualità. La cura durante l'installazione del sistema è particolarmente Criti cal quando si lavora con gli obiettivi ad alto ingrandimento. Per facilitare la risoluzione dei problemi, il seguente elenco descrive alcuni dei potenziali difficoltà incontrate;

Problema: bassa intensità IR quando l'imaging in riflessione. Soluzione: Verificare l'orientamento diapositiva IR come il rivestimento riflettente può essere dalla parte sbagliata della diapositiva.

Problema: segnale basso / rosso segnale di avvertimento in Lancer controllo. Soluzione: rilevatori raffreddare con LN2. È richiesto azoto liquido per i rivelatori FPA per funzionare e richiede periodicamente di essere ricaricato.

Problema: Velocity errori errore / movimento. Soluzione: reimpostare spettrometro e ridurre le vibrazioni. Vibrazioni causeranno lo specchio in movimento nel interferometro essere disturbato.

Problema: picchi vapore acqueo in dati. Soluzione: Aumentare spurgo sul sistema e proteggere campione d'aria.

Problema: centerburst valido. Soluzione: Trova centerburst di nuovo.

e_content "> Problema:. bassa differenza di flusso nella trasmissione, anche se concentrato. Soluzione Regolare condensatore basso Ciò si verifica quando la luce IR non viene focalizzato in un punto sul campione.

In questo lavoro, ci siamo concentrati su come acquisire immagini ad alta definizione a infrarossi dei tessuti sia in trasmissione o in modalità trasflettanza. La natura dell'imaging FT-IR, è che ci sono molteplici modifiche che possono essere fatte per l'acquisizione dati, ad esempio, il tipo di substrato, tecniche di fissazione, spessore del campione, risoluzione spettrale, interferometro velocità specchio ecc L'effetto di questi parametri ha stato discusso in ampi dettagli recentemente 4,5,17,51.

Ci sono un certo numero di modifiche che possono essere apportate al sistema di imaging compreso l'imaging in modalità ATR 10,24,26 e utilizzando approcci termici nanoscala 52,53 per consentire imaging ad alta risoluzione IR. La limitazione principale con alta risoluzione di imaging IR è che la TIUESTIONI devono essere accuratamente preparati e abbastanza sottili per IR per passare (in genere 4 di spessore micron). Inoltre, la trasmissione e riflettanza FT-IR di imaging richiede i campioni ad essere asciutta a causa della assorbanza IR dall'acqua. Tuttavia, imaging FT-IR ha vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche, in quanto può immagine molto rapidamente grandi aree di tessuto mentre derivanti ricca e dettagliata informazioni biochimiche. Altre tecniche simili che derivano informazioni biochimiche in un modo libero-label includono la spettroscopia Raman, ma il tempo di acquisizione dei dati è molto più lento di acquisire immagini. Approcci di imaging Nuovo Raman stanno emergendo tra cui diffusione stimolata Raman (SRS) e Coherent Antistokes Raman (CARS); Tuttavia, essi hanno accesso gamma spettrale limitato o di imaging singola frequenza.

I progressi nella velocità di acquisizione dei dati, risoluzione spaziale, e la disponibilità di approcci computazionali sono stati di enorme valore nel fare FT-IR imagzione un approccio più fattibile per la traduzione come un nuovo strumento di imaging in patologia. I recenti progressi nella risoluzione spaziale sono stati particolarmente importanti per la patologia dei tessuti a causa di tipi di cellule non siano risolvibili con sistemi di imaging FT-IR convenzionali. Il recente articolo di Reddy et al. mostrato come modellare un sistema ideale per ottenere la risoluzione spaziale ottimale di un sistema di imaging FT-IR 5. L'esempio tessuto renale presentato in questo documento dimostra l'importanza di risoluzioni spaziali elevate per estrarre informazioni biochimiche dalle strutture glomerulari (Figura 3 e Figura 5). In futuro, nuovi progressi in Quantum Cascade Laser come molto luminose sorgenti di luce IR 54-57, 3D immagini spettrali 58, e innovazioni nel campo delle tecnologie su scala nanometrica IR 52,53,59,60 detengono nuovi entusiasmanti percorsi di ricerca che possono avere enormi implicazioni per il futuro di imaging dei tessuti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cary 600 Series FT-IR system Agilent Multiple configurations  Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR Edmund Optics 66-592
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