Utnytte Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder cykloaddisjon for Pretargeted PET Imaging

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

I løpet av de siste tretti årene har positronemisjonstomografi (PET) blitt et uunnværlig klinisk verktøy i diagnostisering og behandling av kreft. Antistoffer har lenge vært ansett som lovende vektorer for levering av positron-emitterende radioisotoper til svulster på grunn av deres utsøkte affinitet og spesifisitet for kreft biomarkører. 1,2 er imidlertid den relativt langsomme in vivo farmakokinetikk antistoffer forlanger bruk av radioisotoper med flere dagers fysiske halveringstider. Denne kombinasjonen kan gi høye stråledoser til de ikke-målorganene av pasientene, en viktig komplikasjon som er av spesiell klinisk betydning siden radioimmunoconjugates injiseres intravenøst ​​og derfor - i motsetning dellegems CT-skanning - resultat i absorberte doser i alle deler av kroppen, uavhengig av avlest vev.

For å omgå dette problemet, har betydelig innsats vært dedikert til utvikledepment av PET avbildning strategier som isolerer radioisotop og målsøkende gruppe, og dermed utnytte fordelaktige egenskaper av antistoffer samtidig lister deres iboende farmakokinetiske begrensninger. Disse strategiene - oftest kalt pretargeting eller flertrinns målretting - anvender typisk fire trinn: (1) administrering av et antistoff som kan binde både et antigen og en radioligand; (2) akkumulering av antistoffet i målvevet og dets fjerning fra blodet; (3) at behandling av et lite molekyl radioligand; og (4) i in vivo-ligering av radioliganden til antistoffet etterfulgt 3-8 I noen tilfeller ved hurtig fjerning av overskudd av radioligand., er en ytterligere clearingmiddel injiseres mellom trinnene 2 og 3 for å påskynde utskillelsen av enhver antistoff som har ennå å binde svulsten og forblir i blodet. 5

Stort sett two typer pretargeting strategier er mest utbredt i litteraturen. Mens begge har vist seg vellykket i prekliniske modeller, de også har viktige begrensninger som har hindret deres kliniske anvendbarhet. Den første strategien er avhengig av den høye affiniteten mellom streptavidin-konjugerte antistoffer og biotin-modifisert radiomarkører; har imidlertid immunogenisiteten av streptavidin-modifiserte antistoffer vist seg å være bekymringsfull problem med hensyn til oversettelse. 5,6,9,10 Den andre strategi, i motsetning til dette anvender bispesifikke antistoffer som er blitt genetisk konstruert til å binde både en cancer biomarkør antigen og et lite molekyl radiomerket hapten. 3,11-14 Selv om dette sistnevnte rute er absolutt kreativ, er dens brede anvendbarhet begrenset av kompleksitet, kostnader og mangel på modularitet av systemet.

Nylig har vi utviklet og utgitt en pretargeted PET avbildning metodikk basert på den inverse elektron etterspørsel Diels-Alder (jegEDDA) cykloaddisjon reaksjon mellom trans -cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz;. Figur 1) 11 Mens reaksjonen i seg selv har vært kjent i flere tiår, har IEDDA kjemi opplevd en renessanse de siste årene som et klikk kjemi bioconjugation teknikk, som illustrert ved den fascinerende arbeidet i grupper av Ralph Weissleder, Joseph Fox, og Peter Conti blant andre. 12-15 The IEDDA cykloaddisjon har blitt benyttet i en rekke innstillinger, inkludert fluorescens bildebehandling med peptider, antistoffer, og nanopartikler samt atom bildebehandling . med både radiohalogens og radiometaller 16-26 Liger er høytytende, ren, rask (k 1> 30000 M -1 sek -1), selektive, og - kritisk -. bioorthogonal 27 Og mens en rekke typer klikk kjemi - inkludert Cu-katalysert azid-alkyn cycloadditions, stamme forfremmet azid-alkyn cycloadditions og Staudinger lyasjon -. er bioorthogonal også, det er den unike kombinasjonen av raske reaksjonskinetikk og bioorthogonality som gjør IEDDA kjemi så godt egnet til pretargeting applikasjoner i hele organismer 28,29 Langs disse linjene, er det viktig å merke seg at den siste rapporten fra vår laboratorier var ikke den første til å gjelde IEDDA kjemi til pretargeting: den første rapporten om pretargeted bildebehandling med IEDDA oppsto fra et verk av Rossin, et al og inneholdt en SPECT metodikk ansette en 111-merket tetrazine 30..

Som vi diskuterte ovenfor, har pretargeting metodikk fire ganske enkle trinn (figur 2). I protokollen for hånden, vil en pretargeted strategi for PET avbildning av tykktarmskreft som sysselsetter en 64 Cu-NOTA-merket tetrazine radioligand og en TCO-modifisert konjugerte av huA33 antistoff beskrives. Men til syvende og sist den modularitet av denne metodikken er en av sitt greter av eiendeler, som trans -cyclooctene delen kan legges til enhver ikke-intern antistoff, og tetrazine kan festes til et bredt utvalg av radioaktive journalister.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ETIKK UTTALELSE: Alle de in vivo dyreforsøk beskrevet ble utført i henhold til godkjent protokoll og under de etiske retningslinjene for Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. Syntese av Tz-Bn-NOTA

  1. I en liten reaksjonsbeholder oppløses 7 mg NH2 -Bn-NOTA (1,25 x -2 10 mmol) i 600 ul NaHCO3 buffer (0,1 M, pH 8,1). Kontroller pH-verdien av oppløsningen. Hvis nødvendig, justere pH i løsningen til 8,1 ved bruk av små porsjoner av 0,1 M Na 2 CO 3.
  2. Tilsett NH2 -Bn-NOTA løsningen til 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) i et 1,7 ml mikrosentrifugerør.
    MERK: Tz-NHS kan enten veies ut tørr eller lagt fra en stamløsning av tørr DMF eller DMSO (<50 mikroliter).
  3. Tillat den resulterende reaksjonsløsning for å reagere i 30 minutter ved romtemperaturmed svak omrøring.
  4. Etter 30 min, rense produktet ved hjelp av reversfase C18 HPLC-kromatografi for å fjerne ureagert NH2 -Bn-NOTA. Den NH2 -Bn-NOTA kan bli overvåket ved en bølgelengde på 254 nm, mens Tz-NHS og Tz-Bn-NOTA er best overvåket ved en bølgelengde på 525 nm.
    MERK: Retensjonstider er selvsagt sterkt avhengig av HPLC-utstyr oppsett av hvert laboratorium (pumper, søyler, rør, etc.). Imidlertid, for å presentere et eksempel, hvis en gradient fra 0: 100 MeCN / H2O (begge med 0,1% TFA) til 100: 0 MeCN / H2O over 25 min, og en analytisk 4,6 x 250 mm C-18 kolonne benyttes , retensjonstidene av Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS og NH2 -Bn-NOTA vil være rundt 15 minutter, 16,5 minutter og 10 minutter henholdsvis. Produktet kan bli renset fra de andre reaksjonskomponenter i enten en enkelt kjøring eller flere omganger ved hjelp av en semi-preparativ eller preparativ C-18 HPLC-kolonne. 1H-NMR, analytical HPLC, og ESI-MS er alle fremgangsmåter som kan brukes for å kontrollere renheten av det ferdige Tz-Bn-NOTA forløper. 11
  5. Fryse den oppsamlede HPLC-elueringsmiddel ved hjelp av flytende nitrogen.
  6. Pakk den frosne samling rør i ugjennomsiktig aluminiumsfolie.
  7. Plasser den frosne oppsamlingsrøret i en lyofilisere beholder O / N for å fjerne HPLC mobil fase.
  8. Oppbevar det rensede produkt (et lys rosa, fast stoff) i mørket ved -80 ° C.
    MERK: Dette er en akseptabel stoppestad i prosedyren. Det utfylte Tz-Bn-NOTA forløper er stabil i minst ett år under disse forholdene.

2. Utarbeidelse av huA33-TCO immunokonjugat

  1. I en 1,7 ml mikro tube, forberede en 1 mg / ml (2,7 mm) løsning av TCO-NHS i tørr DMF.
  2. I et 1,7 ml mikrosentrifugerør, forberede en 2 mg / ml (13,3 mM) oppløsning av huA33 i 1 ml fosfat-bufret saltvann, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3-,
  3. Ved hjelp av små porsjoner (<5 pl) 0,1 M Na 2 CO 3, justere pH i den antistoffløsning til 8,8 til 9,0. Bruk enten pH papir eller et pH-meter med en microelectrode å overvåke pH, og være forsiktig for ikke å tillate pH å stige over pH 9,0.
  4. Når antistoffløsningen er i riktig pH, tilsett et volum av TCO-NHS løsning tilsvarende 8 molar ekvivalenter av den aktiverte ester. For eksempel legge 7,9 mL av 1 mg / ml TCO-NHS-løsning (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) til 1 ml 2 mg / ml huA33 antistoff løsning (1,33 x 10 -8 mol huA33). Må ikke overstige 5% DMF etter volum av løsningen.
  5. Bland forsiktig løsningen ved å invertere mikrosentrifugerør flere ganger.
  6. Pakk mikrosentrifugerør i ugjennomsiktig aluminiumsfolie.
  7. Tillat løsningen å inkubere i 1 time ved romtemperatur med forsiktig røring.
  8. Etter 1 time ved romtemperatur, rense den resulterende immunkonjugat ved hjelp av en pre-pakket disponibel size utelukkelse avsalting kolonne. Først, skyll størrelseseksklusjonskolonne den som er beskrevet av leverandøren for å fjerne eventuelle konserveringsmidler er tilstede på kolonnen under lagring. Deretter legger reaksjonsblandingen til størrelseseksklusjonskolonne den skylles kolonnen med 1,5 ml 0,9% steril saltoppløsning, og deretter samle opp produktet ved å bruke 2 ml 0,9% steril saltløsning som elueringsmiddel.
    MERK: Dette trinnet vil gi den ferdige huA33-TCO som en 2 ml oppløsning.
  9. Måle konsentrasjonen av den resulterende huA33-TCO på et UV-Vis spektrofotometer.
  10. Hvis en høyere konsentrasjon er ønsket, konsentrere huA33 TCO-løsning ved hjelp av en sentrifugal-filterenhet med en 50000 molekylvekt cut-off.
    MERK: Det er viktig å merke seg at mens huA33 og en rekke andre kjente antistoffer (f.eks bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, og J591) er svært tolerant av å være konsentrert, kan aggregering og nedbør oppstå ved konsentrasjon i andre tilfeller. Forskere prøver dette procedure med et nytt antistoff som skal stole litteraturen eller sin egen kunnskap av antistoffet i spørsmålet med hensyn til hvorvidt eller ikke å konsentrere antistoffet.
  11. Oppbevar den ferdige huA33-TCO immunkonjugat ved 4 ° C i mørket.
    MERK: Dette er en akseptabel stoppestad i prosedyren. Det utfylte mAb-TCO konjugat må være stabilt i minst tre måneder under disse lagringsforhold.

3. 64 Cu Radiomerking av Tz-Bn-NOTA

MERK: Dette trinnet av protokollen involverer håndtering og manipulering av radioaktivitet. Før du utfører disse trinnene - eller utføre annet arbeid med radioaktivitet - forskere bør rådføre seg med sin hjemmeinstitusjonens Radiation Safety Department. Ta alle mulige skritt for å minimere eksponering for ioniserende stråling.

  1. I en 1,7 ml mikro tube, forberede en 0,5 mg / ml (723 mm) løsning av Tz-Bn-NOTA.
  2. I en 1,7 ml MicroCentrifuge rør, legge til 10 mL av Tz-Bn-NOTA løsning (5 mikrogram) til 400 mL av 0,2 M NH4OAC pH 5,5 buffer.
  3. I interesse av riktig radiokjemisk note-holder, måle og registrere hvor mye radioaktivitet i prøven ved hjelp av en dose kalibrator før og etter de påfølgende trinnene i protokollen under (3,4-3,8). Dette vil hjelpe til med nøyaktig bestemmelse av radiokjemiske avkastning.
  4. Legg 2000 uCi (74 MBq) av 64 Cu til Tz-Bn-NOTA løsning.
    MERK: Typisk [64 Cu] CuCl 2 tilføres i et lite volum (<30 ul) av 0,1 N HCl, og dermed bare små mengder (<10 ul) av denne lagerløsning er nødvendig for radiomerkingsreaksjonen. Hvis større mengder av [Cu 64] CuCl to lager er nødvendig, er en radiomerkingsreaksjon tolerante for å øke den totale reaksjonsvolum. Imidlertid bør pH i radiomerkingsreaksjonsløsningen overvåkes nøye for å sikreat det ikke faller under pH 4,0.
  5. La oppløsningen inkuberes i 10 minutter ved RT med svak omrøring.
  6. Etter 10 min inkubasjon rense produktet ved hjelp av reversfase C18 HPLC-kromatografi. Retensjonstider er selvsagt sterkt avhengig av HPLC-utstyr oppsett av hvert laboratorium (pumper, søyler, rør, etc.). Imidlertid, for å presentere et eksempel, hvis en gradient på 5:95 MeCN / H2O (begge med 0,1% TFA) til 95: 5 MeCN / H2O over 15 min brukes, retensjonstid på 64 Cu-Tz- Bn-NOTA bør være rundt 9,8 min mens gratis, ukompleksert 64 Cu vil eluere med løsemiddel foran på rundt 2-4 min.
  7. Ved hjelp av en rotasjonsfordamper, tar HPLC-elueringsmiddel.
  8. Oppløses på nytt 64 Cu-Tz-Bn-NOTA produkt i 0,9% sterilt saltvann.
    MERK: Gitt 12.7 timers fysisk halveringstid på 64 Cu, dette er ikke en akseptabel stoppestad i prosedyren. Utføre syntese av 64 Cu-Tz-Bn-NOTEn umiddelbart før injeksjon av radioligand, og følg trinn 3.7 umiddelbart by Step 4,5.

4. I ​​Vivo Pretargeted PET Imaging

MERK: Som i protokoll del 3, dette trinnet av protokollen involverer håndtering og manipulering av radioaktivitet. Før du utfører disse trinnene forskere bør rådføre seg med sin hjemmeinstitusjonens Radiation Safety Department. Ta alle mulige skritt for å minimere eksponering for ioniserende stråling.

  1. I en kvinnelig atymiske naken mus, subkutant implantat 1 x 10 6 SW1222 tykktarmskreftceller og 11 tillate disse å vokse inn i en 100-150 mm 3 xenograft (9-12 dager etter vaksinasjonen).
  2. Fortynn en aliquot av huA33-TCO løsning fra protokoll § 2 til en konsentrasjon på 0,5 mg / ml i 0,9% steril saltoppløsning.
  3. Injisere 200 ul av huA33 TCO-oppløsning (100 ug) i halevenen på xenograft-bærende mus.
  4. Tillate 24-timers for akkumulering av huA33-TCO i svulsten av musen.
  5. Fortynn 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand til en konsentrasjon på 1,5 mCi / ml i 0,9% steril saltoppløsning.
  6. Injisere 200 ul av 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand-oppløsning (300 uCi; 11,1 MBq, 1,6 nmol av 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, forutsatt at en spesifikk aktivitet på 6,7 MBq / nmol) i halevenen av xenograft-bærende mus.
  7. På det ønskede avbildnings tidspunkt (f.eks, 2, 6, 12, eller 24 timer etter injeksjon), bedøve mus med 2% isofluran: oksygengassblanding.
  8. Plasser musen på senga av den lille dyret PET-skanner. Opprettholde anestesi under skanning ved hjelp av en 1% isofluran: oksygen gassblanding. Før plassere dyret på skanneren, verifisere anestesi ved bruk av tå-pinch metode og anvende veterinær salve til øynene til musen for å hindre uttørking under anestesi.
  9. Erverve PET data for mus via en statiskskanner med et minimum på 20 millioner sammenfallende hendelser ved hjelp av en energivinduet 350-700 keV og for et sammentreff tidsvindu på 6 ns. Etter å ha fullført oppkjøpet av bildet, ikke la musen uten tilsyn, og ikke legg den i et bur med andre mus før den har kommet til bevissthet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De første tre trinn av forsøket - syntese av Tz-Bn-NOTA, konjugering av TCO til huA33, og radiomerking av Tz-Bn-NOTA konstruere (figurene 3 og 4) - er svært pålitelig. I tilfellet med fremgangsmåten ovenfor, ble Tz-Bn-NOTA konstruksjonen syntetiseres i høyt utbytte og renhet. Den huA33 antistoff ble modifisert med 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, og Tz-Bn-NOTA ble radiomerket med 64 Cu for å gi det rensede radioligand i> 99% radiokjemisk renhet> 85% råte-korrigert utbytte, og en spesifikk aktivitet på ~ 6,7 MBq / nmol (Figur 5). Reaktiviteten av huA33-TCO konjugat og tetrazine radioligand kan testes ved hjelp av radioaktiv øyeblikkelig tynnsjiktskromatografi (ITLC). Dette gjøres ved å blande den radiomerkede tetrazine (100 uCi; 0,55 nmol, forutsatt at en spesifikk aktivitet på 6,7 MBq / nmol) med et lite overskudd av huA33-TCO (50 pg; 0,66 nmol) i phosphate-bufret saltløsning (pH 7,4) ved RT i 5 min. Deretter tilsettes omtrent 1 uCi av løsningen flekket på en reversfase C 18 TLC-plate og fikk tørke. TLC drives på 9: 1 MeCN: H2O, og platen analysert ved anvendelse av en radioaktiv TLC-plate-leser. Hvis klikk reaksjon fungerer som planlagt, bør ligert 64 Cu-NOTA-A33 ligge på baseline; Hvis, på den annen side reaksjonen svikter, vil fri 64 Cu-Tz-Bn-NOTA vises ved eller nær løsningsmiddelfronten.

Går videre til in vivo bildebehandling eksperimenter, i protokollen beskrevet ovenfor, ble atymiske nakne mus med A33 antigen-uttrykke, SW1222 kolorektal kreft xenografts ansatt. Både akutte biodistribusjon (n = 5 per tidspunkt) og PET billeddiagnostikk (n = 12) eksperimenter avslører at pretargeting strategien er i stand til opptegning av kolorektal tumorvekst med utmerket bildekontrast og høye tumor-til-bakgrunn aktivitetsforhold (Figur 6). Opptak av 64 Cu-Tz-Bn-NOTA i svulsten er tydelig på tidlige tidspunkter: 3,5% ± 0,6% ID / g og 4,1% ± 0,6% ID / g på 1 time og 4 timer etter injeksjonen, henholdsvis. Men ved disse tidlige punkter, er det lett skjules av mengden radioaktivitet lysning gjennom tarmkanalen hos mus (11,9% ± 4,4% ID / g og 8,8% ± 3,4% ID / g i avføringen på 1 time og 4 hr pi, henholdsvis). I løpet av flere timer, fjerner overflødig radioligand gjennom avføringen (1,4% ± 0,5% ID / g ved 24 timers pi), og svulsten blir den mest fremtredende trekk i bildet (4,0% ± 0,9% ID / g på 24-timers pi). På disse senere tidspunkter, er svulsten godt avgrenset i bildet, og tumor-til-bakgrunn aktivitetsforhold er ganske høy; for eksempel, gir strategien svulst: muskel forholdstall på 26.6 ± 6.6 på 12 timers pi og 27,0 ± 7,4 ved 24-timers pi Ikke overraskende kontroll eksperimenter ved hjelp av bare 64 Cu-Tz-Bn-Nota, ikke-spesifikke antistoffer, or huA33 uten konjugert TCO-grupper alle resulterte i minimal opptak i svulsten.

Som det vil bli nærmere omtalt nedenfor, dette pretargeting strategi - har en rekke variabler som vil kreve optimalisering når den brukes til nye antistoff / antigen systemer - som alle pretargeting strategier. To av de viktigste er massen av mAb-TCO konstruksjonen injisert og lengden av intervallet mellom injeksjon av mAb-TCO konstruere og injeksjon av radioliganden. Hvis mengden av mAb-TCO konjugat er for høy eller intervallet mellom injeksjonene er for kort, hvor mye ledig mAb-TCO i blodet går opp og sannsynligheten for klikk reaksjoner som oppstår i blodet i stedet for på tumor øker. For eksempel, i den 64 Cu / huA33 system omtalt her, både administrering av 300 ug av huA33 (i stedet for 100 ug), eller ved bruk av en 12 timers intervall tid (i stedet for 24 timer) resulterte i merkbare økninger i tHan mengden radioaktivitet synlig i sentrum av mus (figur 7A og 7B, henholdsvis). I begge disse tilfeller blir klikket reaksjonen fortsatt tydelig skjer på tumor, som vist ved mengden av tumoropptak ved tidlige tidspunkter; Imidlertid er dannelsen av radiomerket antistoff i blodet også tydelig. Selv om dette er fristende å avvise fordi det radiomerkede antistoff som er dannet i blodet, vil likevel til slutt finne veien til tumoren, noe tap av dette er hensikten med å bruke en pretargeting metodikk, som det radiomerkede antistoff vil sirkulere langsomt før den når tumoren og derved øke dosehastigheter til ikke-målorganer. Omvendt, hvis for lite antistoff blir anvendt, er mengden av opptak i tumoren vil naturligvis lide. Altfor lange intervaller kan også redusere nivåene av tumoropptak som et resultat av langsom antistoff internalisering, transcyclooctene isomerisering eller antistoff / antigen shedding. Diagnostisering av thESE problemer er mer utfordrende og kan ikke oppnås bare gjennom undersøkelse av PET-data. Åpenbart må en hårfin balanse opprettholdes. Derfor anbefales det at eventuelle etterforskere forsøker å anvende denne strategien til et nytt antistoff / antigen system bruker store mengder mAb'et-TCO konstruksjon (≥ 200 mikrogram) og korte intervaller (≤ 24 hr) som utgangspunkt og optimalisere derfra.

Figur 1
Figur 1. Den inverse elektron-demand Diels-Alder [4 + 2] cykloaddisjon klikk ligation mellom tetrazine og transcyclooctene.

Figur 2
Figur 2. En illustrasjon av de fire trinnene i pretargeting metodikk. Dette tallet er basert på forskning opprinnelig publisert i JNM. Zeglis, BM et al. A pretargeted PET avbildning strategi based på bioorthgonal Diels-Alder klikk kjemi. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 av Society for nukleærmedisin og molekylær avbildning, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. En ordning for endring av huA33 med TCO-NHS.

Figur 4
Figur 4. En ordning for syntese og 64 Cu radiomerking av Tz-Bn-NOTA. Dette tallet er basert på forskning opprinnelig publisert i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET avbildning strategi basert på bioorthgonal Diels-Alder klikk kjemi. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). &# 169; 2013 av Society for nukleærmedisin og molekylær avbildning, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. En radio-HPLC spor av renset 64 Cu-Tz-Bn-NOTA.

Figur 6
Figur 6. PET-bilder av 64 Cu-Tz-Bn-NOTA / A33-TCO pretargeting strategi. Mus peiling subkutane SW1222 xenografts (100-150 mm 3) ble administrert huA33-TCO (100 mikrogram) via halevenen injeksjon. Etter 24 timer ble de samme musene administrert 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2 til 12,0 MBq [275-325 my Ci]) via halevenen injeksjon og deretter avbildes 2, 6, 12 og 18 timer etter administrering av radiofarmasøytikum. Transverse (øverst) og koronale (nederst), plane bilder skjærer sentrum av svulstene. Høye nivåer av opptaket i tarmen ved tidlige tidspunkter (dvs. 2 og 6 hr) stort sett klare etter 12 timer, forlater tumor (hvit pil) klart avgrenset fra alle ikke-målvev ved 12 og 18 timer etter injeksjon. Dette tallet er basert på forskning opprinnelig publisert i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET avbildning strategi basert på bioorthgonal Diels-Alder klikk kjemi. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 av Society for nukleærmedisin og molekylær avbildning, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. PET-bilder av suboptimale pretargeting eksperimenter. (A) Mus bearing subkutane SW1222 xenografts (100-150 mm tre, pil) ble administrert huA33-TCO (100 mikrogram) via halevenen injeksjon. Etter 12 timer ble de samme musene administrert 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2 til 12,0 MBq [275-325 uCi]) hale vene injeksjon. (B) mus med subkutane SW1222 xenografts (100-150 mm tre, pil) ble administrert A33-TCO (300 mikrogram) via halevenen injeksjon. Etter 24 timer ble de samme musene administrert 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2 til 12,0 MBq [275-325 uCi]) hale vene injeksjon. I begge tilfeller ble musene avbildes 12 timer etter injeksjon av 64 Cu-Tz-Bn-NOTA. I begge paneler, tverrgående (topp) og koronale (bunn), plane bilder som skjærer sentrum av tumorene. Mens pretargeting strategi tydelig markerer tumoren i begge tilfeller resulterer i begge disse bildene er sub-standard i forhold til de som er vist i figur 6. I begge 7A og 7B, er det enbetydelig mengde bakgrunns aktivitet opptak i hjertet. Under betingelsene ifølge figur 7A, er dette mest sannsynlig resultatet av huA33-TCO konstruere ikke blir gitt tilstrekkelig tid til å lokalisere i tumoren. Under betingelsene ifølge figur 7B, er dette sannsynligvis en konsekvens av å injisere for mye huA33-TCO og som har overskudd av immunkonjugatet fortsatt sirkulerer i blodet, selv 24 timer etter injeksjon. Dette tallet er basert på forskning opprinnelig publisert i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET avbildning strategi basert på bioorthgonal Diels-Alder klikk kjemi. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). 2013 av Society for nukleærmedisin og molekylær avbildning, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den prinsipielle fordel ved denne pretargeted PET avbildning strategien er at den er i stand til opptegning tumorer med target-til-bakgrunnsbildekontrasten på bare en brøkdel av den bakgrunnsstråling dose produsert ved direkte merkede antistoffer. For eksempel, i kolorektal kreft imaging system beskrevet her, data fra akutte biofordelingsstudier eksperimenter ble ansatt for å utføre dosimetri beregninger for 64 Cu-baserte pretargeting strategi sammen med direkte-merket 64 Cu-NOTA-huA33 og 89 Zr-DFO-huA33. Disse beregningene viser tydelig de dosemålende fordelene ved pretargeting system, spesielt sammenlignet med de mer klinisk relevant 89 Zr-merket antistoff. Den effektive dose av pretargeting strategi er 0,0124 mSv / MBq, mens det av 89 Zr-DFO-huA33 er over 30 ganger høyere: 0,4162 mSv / MBq. Den dosimetrisk fordel for pretargeting er mindre uttalt når du sammenligner til 64 Cu-merket enntibody (0,0359 mSv / MBq), selv om den fordelaktige effekten eksisterer fortsatt.

En av de mest betydelige styrker av dette IEDDA pretargeting metodikken er dens modularitet: trans -cyclooctene kan legges til ethvert antistoff som ikke er internalisert, og et bredt utvalg av last kan festes til tetrazine. Faktisk, er vår viktigste motivasjon for å skrive denne protokollen til å aktivere andre forskningsmiljøer for å bruke denne metoden med forskjellige antistoff / antigen / radioisotop-systemer. Langs disse linjene, mener vi det er viktig å ta opp en rekke problemstillinger som forskere bør vurdere når tilpasse denne metodikken for andre systemer.

Først, er utvalget av antistoffet uhyre viktig. Enkelt sagt, må antistoff være ikke-internalisert eller internalisert på en svært langsom hastighet. Mens de ideelle kinetiske parametre har ennå ikke bestemt, antistoffet og det reaktive trans -cyclooctene det bærer må være påslåttutsiden av cellen, for internalisering og håndtering av antistoffet før injeksjonen av radioliganden vil dramatisk redusere antall in vivo klikk reaksjoner. I det system som er beskrevet her, huA33 antistoff gjenkjenner og binder seg til A33-antigen, et transmembran-glykoprotein uttrykt i> 95% av kolorektal kreft. Viktigere er det blitt vist at selv etter å binde dets mål, forblir huA33 antistoff / antigen-komplekset på overflaten av cellen i flere dager. 31-33 Mens nødvendigheten av en ikke-internalisert antistoff er riktignok begrenset til strategien, en bredt utvalg av ikke-internalisert antistoffer er kjent, kanskje mest kjent TAG72 målretting CC49 antistoff som Rossin, et al. har utforsket i deres utmerket pretargeting arbeid. 30,34,35

Sekund, dette pretargeting strategi - som alle andre - krever betydelig optimalisering. I tillegg til identiteten til enntibody og tetrazine radioligand, må to viktige variabler tas i betraktning: mengden av antistoff injisert og intervallet mellom injeksjonene av antistoffet og radioliganden. Vi har tatt tak i begge disse variable i den Representative resultater avsnittet ovenfor, men for å gjenta en kort stund, hvis enten for mye antistoff eller for kort intervall tid anvendes, betydelige mengder av mAb-konjugat TCO vil forbli i blodet ved tidspunktet for injeksjonen av radioligand. Dette i sin tur vil føre til in vivo-klikk ligering som forekommer i blodet i stedet for på tumoren, danner sirkulerende, radiomerket antistoff som vil bare langsomt akkumuleres i svulst over tid. Motsatt, hvis enten for lite eller for lang antistoff et intervall tid anvendes, vil den endelige mengden av radioaktivitet i tumor være suboptimal. Etter vår mening, utfører strenge bildebehandling, eller aller helst, akutte biofordelingsstudier eksperimenter med direkte merket antistoff itself før eventuelle pretargeting eksperimenter er den mest pålitelige måten å lære om mengden av antistoff nødvendig og ideell intervall tid etter den første injeksjonen av antistoff konstruere. For forskjellige injiserte masser av radioaktivt merket mAb, vil disse forsøk gi konkrete data om både klaring av radioimmunkonjugat fra blodet og dets konsentrasjon i tumoren, noe som muliggjør utvelgelse av de mest lovende betingelser for pretargeting eksperimenter.

Til slutt må farmakokinetikken til tetrazine baserte radioligand vurderes når du velger en passende radioisotop. I det systemet som er beskrevet her, blir det radiomerkede Tz-Bn-NOTA rest utskilles fra kroppen via tarmen med en biologisk halveringstid på ca 3-4 timer, noe som gjør 64 Cu i positron-emitterende radioisotoper med den mest komplementære fysiske halv- liv. Dessverre er den biologiske halveringstid for den tetrazine delen for lang for å være kompatibel med the hurtigere råtnende radiometall 68 Ga (t halvdel = 68 min). I dette tilfelle vil enhver radioaktivitet i tumor forfalle gjennom flere halveringstider før den overskytende radioligand ferdig avskjære fra kroppen. Som et resultat, ville bildene må være kjøpt på tidlig tidspunkt, når tumor-til-bakgrunn aktivitetsforhold forblir lav 36 Ideelt sett ville fremtidige generasjoner av tetrazine radioligander være konstruert -. Kanskje via PEGylering, glycation, eller på andre måter - for å skille ut fra kroppen raskere. Dette ville tillate for radiomerking med hurtigere råtnende radioisotoper så som 68 Ga og 18 F, som i sin tur ytterligere forbedrer de dosemålende fordelene ved pretargeted avbildnings strategi. Til slutt, som forskere tilpasse denne teknologien for bruk med andre radioisotoper for avbildning (f.eks, 124 I, 111 I, 18 F, 89 Zr, 68 Ga, etc.) eller behandling (f.eks 177 Lu, 225 Ac, 125 I, etc.), vil nye tetrazine baserte ligander må utvikles for å innlemme ulike kelater eller radiomerking protese grupper. Den grundig undersøkelse av farmakokinetikken til disse nye konstruksjoner vil være avgjørende for å sikre fordelaktige matcher mellom klaringsegenskapene til ligandene og fysisk halveringstid av radionuklider.

Til slutt, vi veldig mye håper at andre forskere se løftet om dette pretargeting teknologi og ansette den med nye antistoff / antigen systemer. Mens de foregående avsnitt illustrerer at denne tilpasningen ikke alltid er enkelt, er det vår oppfatning at denne metodikken kunne ha en betydelig innvirkning på kjernefysisk bildebehandling, målrettet radionuclide terapi, og utover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).
  3. Hollander, N. Bispecific antibodies for cancer therapy. Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).
  4. Liu, G., et al. Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog. Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).
  5. Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step. Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).
  6. Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).
  7. Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides. Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).
  8. Sharkey, R. M., et al. Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods. Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).
  9. Schultz, J., et al. A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy. Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).
  10. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).
  11. Zeglis, B. M., et al. A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).
  12. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).
  13. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).
  14. Devaraj, N. K., Weissleder, R. Biomedical applications of tetrazine cycloadditions. Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).
  15. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging. Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).
  16. Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors. ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).
  17. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).
  18. Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method. Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).
  19. Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).
  20. Selvaraj, R., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21, (3), 5011-5014 (2011).
  21. Liu, S., et al. Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).
  22. Han, H. S., et al. Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).
  23. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).
  24. Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals. Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).
  25. Reiner, T., Zeglis, B. M. The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry. Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).
  26. Li, Z., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes. Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).
  27. Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation. Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).
  28. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).
  29. Bosch, S. M., et al. Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice. Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).
  30. Rossin, R., et al. In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice. Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).
  31. Ackerman, M. E., et al. A33 antigen displays persistent surface expression. Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).
  32. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).
  33. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).
  34. Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).
  35. Rossin, R., et al. Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems. Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).
  36. Emmetiere, F., et al. 18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting. Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics