Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dilworth, D., Nelson, C. J. Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (98), e52345, doi:10.3791/52345 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het bepalen van het werkingsmechanisme van bioactieve stoffen is van belang om een breed scala van academische, farmaceutische en industriële wetenschappers. Saccharomyces cerevisiae, of gist is een modeleukaryoot waarvoor een complete collectie van ~ 6000 gendeletie mutanten en hypomorfe essentieel gen mutanten zijn commercieel verkrijgbaar. Deze verzamelingen van mutanten kan gebruikt worden om systematisch detecteren chemische geninteracties, dwz genen noodzakelijk een chemische tolereren. Deze gegevens zijn beurt verslagen over de waarschijnlijke werkingsmechanisme van de verbinding. Hier beschrijven we een protocol voor de snelle identificatie van chemische-genetische interacties in gist. We demonstreren de werkwijze met het chemotherapeutische middel 5-fluorouracil (5-FU), die een goed gedefinieerde werkingsmechanisme heeft. Onze resultaten tonen dat de nucleaire TRAMP exosome RNA en DNA repair enzymen zijn nodig voor proliferatie in de aanwezigheid van 5-FU, hetgeen in overeenstemming met eerdere microarray gebaseerd barcoderingssysteem chemische genetische benaderingen en de wetenschap dat 5-FU negatieve invloed op zowel RNA en DNA-metabolisme. De vereiste valideringsprotocols deze high-throughput schermen worden ook beschreven.

Introduction

De genetische instrumenten en middelen die beschikbaar zijn in het model organisme Saccharomyces cerevisiae hebben grootschalige functionele genomica studies die gezamenlijk zorgen voor nieuw inzicht in hoe genen functioneren als netwerken om aan de eisen van biologische systemen voldoen ingeschakeld. De hoeksteen van deze tools was het collectief creëren van een complete set van niet-essentiële gendeleties van alle open reading frames in gist 1,2. Een opvallende observatie was dat slechts ~ 20% gist genen vereist voor levensvatbaarheid wanneer gegroeid haploïden onder standaard laboratoriumomstandigheden. Dit wijst op het vermogen van een cel buffer tegen genomische verstoringen door het gebruik van alternatieve biologische routes. Genetische mutanten die levensvatbaar zijn individueel, maar dodelijk in combinatie, signaleren aangesloten of convergente parallel biologische pathways en vormen genetische interactie netwerken die biologische functie te beschrijven. Met de ontwikkeling van conditionele temperature-gevoelige en hypomorphic allelen van essentiële genen technologie is niet beperkt tot de studie van niet-essentiële genen 3,4. Dit concept is toegepast op genomisch schaal produceren van een zuivere genetische interactie kaart illustreert hoe genen betrokken bij soortgelijke cellulaire processen cluster samen 5.

Chemische verstoringen van genetische netwerken nabootsen gen deleties (figuur 1) 6. Opvragen groeiremmende verbindingen tegen een array met hoge dichtheid van deletie stammen voor overgevoeligheid wordt een chemisch-genetische interactie profiel, bijvoorbeeld een lijst van genen die nodig is om chemische belasting verdragen. Zoals genetische interacties grote schermen van chemische bibliotheken hebben aangetoond dat verbindingen met een soortgelijk werkingsmechanisme cluster samen 7. Daarom is door de oprichting van de chemische-genetische interactie profiel van een verbinding het werkingsmechanisme kan worden afgeleid door het te vergelijken met de LARge-schaal synthetische genetische en chemische genetische interactie datasets 8,9.

Zijn op grote schaal chemische-genetische screens, waar scores van verbindingen worden ondervraagd, uitgevoerd door barcode competitie assays. In deze benadering wordt de gepoolde verzameling van deletie stammen gekweekt massaal meerdere generaties in een kleine hoeveelheid medium met een chemische stof. Aangezien elke deletie mutant herbergt een unieke genetische barcode, wordt de levensvatbaarheid / groei van individuele mutanten binnen de pool van deletiestammen bijgehouden door microarray of high-throughput sequencing 10.

Afleiden van fitness door het monitoren kolonie grootte van fysiek gekleed mutanten gegroeid op vaste agar dat een bioactieve verbinding is ook een effectieve methode om de chemische-genetische interacties 11,12 identificeren. Deze benadering verschaft een kosteneffectief alternatief voor concurrentie gebaseerde screening en is zeer geschikt voor het testen van kleine bibliotheken van chemische stoffen.Hier geschetst is een eenvoudige methode voor het produceren van een lijst van chemisch-genetische interacties in S. cerevisiae die niet afhankelijk moleculaire biologie manipulaties of infrastructuur. Het vereist slechts een gist deletie verzameling, een robot of handmatig pinning apparaten en vrij beschikbare beeldanalyse software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: De algemene werkstroom van deze procedure is beschreven in figuur 2.

1. Vaststelling van groei-remmende dosis

  1. Voorbereiding van gist overnacht cultuur
    OPMERKING: De gist-extract-pepton-dextrose groeimedia (YEPD) gebruikt in dit protocol is een standaard recept 13.
    1. Streak uit BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) cellen op een YEPD agar plaat en incubeer gedurende 48 uur bij 30 ° C of tot zichtbare kolonies vormen.
    2. Bereid nachts culturen door het enten van 5 ml YEPD vloeibare media in een steriele cultuur schip met een enkele kolonie. Incubeer overnacht bij 30 ° C onder voortdurend draaien of schudden. De cultuur wordt gewoonlijk bereikt verzadiging van de ochtend (~ 2 x 10 8 cellen / ml).
  2. Solid agarmedia preparaat met wisselende chemische doses
    1. Bereid een aantal voorradende chemische stof worden getest bij 100x gewenste eindconcentratie in een geschikt oplosmiddel.
      OPMERKING: Effectieve concentraties hangt af van de chemische en moet empirisch worden bepaald. Het is daarom aan te raden om eerst te testen een breed uiteindelijke concentratie range; dat wil zeggen, van laag uM tot hoge mM.
    2. Voor elke concentratie van de chemische stof te testen monster 3 ml gesmolten YEPD agar een enkele steriele cultuur buis. Plaats in de 55 ° C waterbad te houden van het stollen.
    3. Voor elke concentratie van de chemische stof te testen voeg 30 ul van de 100x verbinding gesmolten media, vortex 2-3 seconden mengen en pipet 1 ml in elk paar duplo putjes in een 12-wells plaat. Zorg ervoor dat u een voertuig behoren alleen controle. Laat platen een nacht op kamertemperatuur is gebracht. Gooi alle extra media.
  3. Spread plating cellen
    1. Inoculeer 10 ml YEPD vloeibare media met 2 pi van een verzadigde gistcultuur, overnacht gekweekt zoals in stap 1.1.2.
    2. Plaat 25 ul van de verwaterde gistcultuur per well, gelijkmatig verdelen met behulp van steriele glazen kralen of staaf, en laat de plaat te drogen onder een vlam. Incubeer plaat bij 30 ° C gedurende 48 uur.
    3. Evalueer de groei van gist (zowel totaal aantal en grootte van de kolonies) op de platen. Selecteer een sub-letale concentratie van de verbinding die geen groei remt met meer dan 10% -15% aan het scherm worden.

2. Systematische Chemische genetische screen

  1. Onderhoud van deletie-mutant-array (DMA) en Voorbereiding Bron Plaat van
    1. Voor een gedetailleerde beschrijving op de aanleg van deletie mutant arrays uit glycerol voorraden verwijzen wij u naar Baryshnikova et al. 14. Zodra deletiemutanten werden bekleed met een dichtheid van 384 kolonies per plaat, kan de DMA worden enkele maanden opgeslagen bij 4 ° C. Repliceren op YEPD agar die 200 ug / ml G418 nodig om kolonies voorkomen groeien in elkandere.
      OPMERKING: meerdere seriële replicaties moet worden vermeden om verlies van langzaam groeiende stammen voorkomen en minimaliseren van de verschijning van suppressor mutanten. Dit is met name relevant als het behoud van de collecties als haploiden.
    2. Voer alle replica-plating stappen met behulp van een microbiële arraying robotsysteem. Als alternatief, te manipuleren getooid kolonies met behulp van handmatige pinning gereedschappen.
      OPMERKING: De gist deletie collectie is verkrijgbaar haploïden en diploïde van verschillende commerciële bronnen en wordt gewoonlijk geleverd als glycerol voorraden in 96-well platen.
  2. Condenseren van de deletie mutant-array
    1. Maak 250 ml YEPD agar medium dat 200 ug / ml G418. De effectieve concentratie van G418 kan variëren en elke partij moet empirisch worden getest.
    2. Bereid vijf YEPD agarplaten door gieten 50 ml YEPD agar die 200 ug / ml G418 per plaat. Doe dit een dag voor het condenseren van de array en laat de platen afkoelen bij kamertemperatuurerature overnachting op een plat vlak oppervlak.
      OPMERKING: Vier platen nodig zal zijn voor de collectie van 1536-stam dichtheid, is de vijfde plaat gegoten als een extra.
    3. Verwijder de 16 platen met de deletie mutant collectie bij een dichtheid van 384 kolonies per plaat en de kamertemperatuur (~ 1 uur) komen.
    4. Veeg condens die gevormd op het deksel van elke plaat met een delicate taak vegen. Als u dit niet doet, kunnen er waterdruppels worden afgezet op de array en kruisbesmetting van gekleed mutanten.
    5. Met behulp van een microbiële scala pinning robot, condenseren de DMA uit een dichtheid van 384 kolonies per plaat (16 petrischaaltjes) tot 1536 kolonies per plaat (4 petrischaaltjes). Voer deze zodat de 1 ste kolonie plaat 1 kunnen tot 1 kolom 1 van de gecondenseerde matrix rij, de 1e kolonie plaat 2 tot 1 kolom 2, de 1e kolonie plaat 3 naar rij 2 en kolom 1, rij, en de 1 ste kolonie plaat 4 tot rij 2kolom 2.
    6. Incubeer de geconsolideerde matrix bij 30 ° C geïncubeerd.
    7. Onderzoek de array om uniforme overdracht van kolonies van bron platen zorgen. Er zullen verschillende lege posities, met opzet in de matrix opgenomen, die als leidraad dienen om ervoor te zorgen de DMA is gecondenseerd correct (figuur 4A).
      Opmerking: Dit zijn de bron platen voor replica plating op medium met de testverbinding. Een enkele bron plaat kan worden gebruikt voor meerdere pinnings. Ook veel robots zullen hebben een compenserende functie, die zal zorgen voor vergelijkbare aantallen van gist worden telkens overgedragen.
  3. Replica plaat deletie mutant-array
    1. Bereid 700 ml controle (voertuig alleen) en 700 ml van experimentele media (-chemische stof). Dit is voldoende voor het uitvoeren van de assay in drievoud (12 platen per toestand, plus twee extra).
    2. Giet 50 ml YEPD agar met teststof of de controle per plaat. Laat de platen to afkoelen bij kamertemperatuur op een vlak en gelijkmatig oppervlak.
    3. De robot replica plaat beënt de DMA op drie sets van platen met chemicaliën de experimenteel bepaalde concentratie, en drie sets van platen met de dragercontrole. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 24-48 uur.

3. Imaging Platen en Data Analyse

  1. Verwijder platen uit incubator en laat ze op kamertemperatuur (~ 1 uur) voorafgaand aan de beeldvorming te komen. Dit voorkomt condensvorming, terwijl de beeldvorming van de platen.
  2. Afbeelding platen bij 24 en 48 uur door het verwijderen van het deksel en het gezicht naar beneden op een flat bed scanner. Maak foto's met een resolutie van minimaal 300 dpi. U kunt ook gebruik maken van een digitale camera om beelden vast te leggen. Als dit te doen, plaats platen open op een donkere achtergrond en verwijder de deksels op de foto.
    OPMERKING: De bestandsformaat en positionering van de platen zal afhangen van de kwantificering gebruikte programma. Voeren kwantificering en vergelijking van array-kolonie maten met behulp van een van de verschillende open source-programma's, waaronder Balony 15, SGAtools 16, en ScreenMill 17.

4. Validatie van het Scherm

OPMERKING: In dit stadium meerdere gist schrappingen mutanten als overgevoelig zijn voor de chemische belangstelling zal scoren. Deze chemische-genetische interacties Vervolgens moet worden gevalideerd op twee manieren. Eerst de identiteit van gevoelige stammen moeten worden bevestigd door PCR. Ten tweede moeten chemische gevoeligheid onafhankelijk worden gescoord. Hieronder volgt een overzicht is een kort protocol voor het uitvoeren van het spotten van assays om spanning overgevoeligheid, een techniek die veel voor in gist biologie valideren.

  1. Streak uit gewenste (overgevoelig) mutanten uit de gist verwijdering collectie op YEPD agar met 200 ug / ml G418. Incubeer bij 30 ° C tot kolonies vormen. Controleer het genotype van de stam met diagnostische PCR met primers volgensprotocol van de fabrikant.
  2. Inoculeer 5 ml YEPD vloeistof voor elke stam en incubeer overnacht bij 30 ° C met rotatie of schudden.
  3. Meet OD 600 en vul elke stam aan OD 600 = 1 in steriele dH 2 O. Dit zijn nu de genormaliseerde gistkweken.
  4. Breng 100 pi van genormaliseerde wild-type gist (BY4741) cultuur en A1 van een 96-wells plaat. Doseer 100 ul van maximaal zeven extra onder druk te putten B1-H1.
  5. Gebruik een multichannel pipet 90 ul steriele dH 2 O afzien putjes A2-H2 door A6-H6. Tot slot, bereiden een reeks van 1:10 verdunningen van genormaliseerde gistculturen. Begin met serieel pipetteren 10 pl kolom 1 tot kolom 2 met een multichannel pipet, en verder over de 96-well plaat tot zes verdunningen gemaakt (bijvoorbeeld, 10 0 tot 10 -5).
  6. Transfer 2-5 pi van verdunde gist culturen in een raster met een multichannelpipet op YEPD vaste media die chemische en controle over het voertuig. Incubeer de platen bij de geschikte temperatuur gedurende 24-48 uur.
  7. Inspecteer platen en vergelijkt de gevoeligheid van geselecteerde mutanten chemische (ten opzichte BY4741 controle). Afbeelding platen 24 en 48 uur zoals in stap 3.2.
    OPMERKING: Terwijl de identificatie van verschillende overgevoelig stammen met bijbehorende gen ontologieën of functies leent het vertrouwen om de geldigheid van het scherm, transformatie van een overgevoelig verwijdering stam met een plasmide met een wild-type kopie van het gen is vereist om formeel vast te stellen dat een gen verwijdering van belang (en niet verborgen tweede plaats mutaties) veroorzaakt drug gevoeligheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Als validatie van deze benadering hebben we een representatieve chemische genetische interactie scherm van het chemotherapeutische middel 5-fluorouracil (5-FU) na bovengenoemde protocol. 5-FU is bekend thymidylaatsynthase en DNA- en RNA-metabolisme 18 verstoren. De chemische genetische interacties van 5-FU zijn goed bestudeerd en zijn onderzocht door gist barcode microarray-technieken met behulp van zowel heterozygote en homozygote deletie collecties 8,19. Hier laten we zien dat soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen door vergelijkende kwantificering van mutant koloniegrootte.

Opgemerkt zij dat het scherm uitgevoerde gebruikt de niet-essentiële haploïde gendeletie collectie. Dit type scherm kan ook worden uitgevoerd met diploïde stammen temperatuurgevoelige mutanten en hypomorphic allelen, waardoor de opname van essentiële gen mutanten. Een voordeel van het gebruik van de haploïde verwijdering collectie wordt verhoogd drug sensitivheid van doel paden, aangezien de volledige afwezigheid van het genproduct. Echter twee belangrijke nadelen zijn dat essentiële gen overgevoeligheid niet kan worden opgevraagd, en de haploïde collectie is vatbaar voor spontane suppressor mutaties die geselecteerd worden over meerdere propagations. Dit kan leiden tot een verslechtering van de collectie. Er is dus een inherente afweging tussen de integriteit en de breedte van de array en gevoeligheid voor geneesmiddel effect. Dit moet in aanmerking worden genomen en de meest geschikte mutant collectie geselecteerd op basis van de gewenste toepassing.

Ten eerste, de passende sub-letale concentratie van 5-FU voor gebruik in het scherm werd bepaald op 10 uM van toenemende BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) cellen van toenemende concentratie van 5-FU en visueel evalueren gist kolonie groei ( Figuur 3A). Als alternatief kunnen vergelijkbare resultaten worden verkregen door groeiende yeast in microtiterplaten in vloeibare cultuur en frequente controle van de culturen optische dichtheid met behulp van een microplaataflezer (figuur 3B), zoals die door de vorige groepen 10,20.

Met behulp van de Singer ROTOR, werd de gist DMA gerepliceerd in 1536 kolonies per plaat dichtheid op media met 10 uM 5-FU of dimethylsulfoxide (DMSO) controle (Figuur 4A). Deze platen werden gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geroerd en afgebeeld op een flat bed scanner. Koloniegrootte maat voor elke mutant zowel de experimentele en controle platen werd uitgevoerd met het beeld Balony analyseprogramma 15. De Balony software berekent de grootte verhouding van kolonies op de experimentele matrix ten opzichte van controle. De gebruiker kan een verhouding drempel en als het scherm wordt uitgevoerd in ten minste triplo een p-waarde wordt toegekend aan elke mutant. In onze vertegenwoordiger scherm mutanten die een verhouding van ≤0.8 vertoonden, werden overwegened te klappen. De resultaten van de kolonie kwantificering kan grafisch door het uitzetten van de grootte verhouding voor elke kolonie op de y-as en de gendeletie gesorteerd matrix positie (Figuur 4B) of ratio (figuur 4C) op de x-as worden gepresenteerd.

Synthetische ziekte / letale mutanten die in het scherm kunnen worden gegroepeerd op basis van functionele beschrijvingen door het uitvoeren gen ontologie (GO) analyse. Er zijn verschillende publiekelijk beschikbare tools voor GO analyse van de lijsten van S. cerevisiae genen; waaronder Funspec 21, DAVID Bioinformatics Database 22,23, en de Saccharomyces Genome Database (SGD) Ga Term Finder 24. Gendeleties een verhouding van minder dan of gelijk aan 0,8 in het scherm 5-FU was gebruikt als input lijst Funspec. Funspec accepteert een lijst van stelselmatige of gemeenschappelijke gistgen namen en uitgangen samenvattingen van gen ontologieën, functionele indelingen, lokalisatie, eiwitcomplexen evenals othaar nuttig classificaties die zijn verrijkt in die lijst. De vertegenwoordiger scherm uitgevoerd toonde een verrijking van ontologieën voor RNA metabolisme, met inbegrip van tRNA wiebelt, uridine- modificatie en RNA surveillance machines, en de respons op DNA-schade (tabel 1). Deze resultaten komen overeen met eerdere studies die hebben aangetoond dat 5-FU behandeling resulteert in de accumulatie van gepolyadenyleerd noncoding RNA's, die worden verwerkt door de nucleaire Trf / Rrp6 / Air / Mtr4 Polyadenylatie (LANDLOPER) exosome 25. Dus deze bevindingen zijn in overeenstemming met eerdere chemische genetische screens en de bekende mechanisme van 5-FU bioactiviteit 8,19.

Zoals bij alle high-throughput functionele genomische benaderingen moet de resultaten valideren. Te valideren chemische genetische interacties gistmutanten moet eerst worden PCR-gevalideerd met primers die gloeien binnen promotor het doelwit-gen en KANMX verstoring cassette. Selectie van stammen voor geldigeatie is enigszins arbitrair, echter prioriteit mutanten die een sterke fenotype laten zien en de groep biedt praktisch een goed uitgangspunt. Vervolgens wordt overgevoeligheid voor een chemische bevestigd met behulp van het spotten van assays, een gemeenschappelijke aanpak voor het meten van fitheid van gist mutanten. Hiertoe worden seriële verdunningen van giststammen gespot in een raster op media die de geschikte chemische dosering en controle. Als voorbeeld, bevestigen wij de chemische genetische interactie van 5-FU met lucht1 en trf5 mutanten van de Vagebond complex (Figuur 5). Deze genen coderen voor componenten van de Vagebond nucleaire exosome. We merken op dat de rrp6 stam, ontbreekt de kern 3'-5 'exonucleaseactiviteit van TRAMP, werd verloren in high-density DMA collectie ons lab's. Bij het ​​verkrijgen van een nieuw rrp6 mutant bevestigen wij dat rrp6 en 5-FU een chemische genetische interactie geven, wordt vastgesteld dat TRAMP activiteit vereist 5-FU tolereren. Dit illustreertdat de integriteit van grote deletie verzamelingen kunnen verminderde loop van de tijd, waardoor goede DMA onderhoud en zeef validatie kritisch.

Onze scherm ook geïdentificeerd mutanten in verschillende DNA-reparatie-enzymen (waaronder RAD50, rad52 en MRE11) als 5-FU gevoelig. Scoring van koloniegrootte aangegeven de relatieve geschiktheid van deze mutanten op 10 pM 5-FU 0,7, 0,65 en 0,42 in vergelijking met wild type. Op basis van onze bevestigende spotting assays (figuur 5), deze waarden zijn waarschijnlijk een onderschatting vanwege het beperkte dynamische bereik van fitness meting door koloniegrootte scoren. Dit wijst op een tweede reden om onafhankelijk te bevestigen interacties door seriële spotten: de omvang van sommige chemische genetische interacties kunnen worden onderschat in de primaire data-analyse. Onze resultaten laten zien dat een op groei gebaseerde chemische genetische screen uitgevoerd met ~ 4800-stam haploïde verwijdering collectie, in drievoud, biedt voldoende resol ution om met vertrouwen te isoleren specifieke chemische genetische interacties.

Figuur 1
Figuur 1:. Schematische weergave van chemische genetische interacties gen deleties die resulteren in overgevoeligheid voor chemische verstoring zorgen voor de identificatie van biologische processen doelwit van een chemische stof. (A) Convergente trajecten kan worden verstoord door een van beide gendeletie (genea) of chemisch (geneB). Individueel kunnen deze cellulaire beledigingen getolereerd vanwege de inherente redundantie in biologische pathways. In combinatie cellevensvatbaarheid wordt aangetast hetgeen resulteert in hetzij een synthetisch zieke of letale fenotype. (B) Schrapping van genen (geneC) van cruciaal belang voor het inperken van chemisch geïnduceerde spanning ook overgevoeligheid veroorzaken en geven aan biologische pathways verstoord door een chemische behandeling. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: workflow Chemische genetische screen (A) Bepaling van sub-remmende dosis. Ouderlijke giststammen worden gekweekt tot stationaire fase, verdund 1: 5000, en uitgespreid geplaat op vaste YEPD media die toenemende chemische dosis. De hoogste concentratie die niet groter dan 10-15% groeiremming is geselecteerd voor het screenen tegen de DMA. (B) Systematische Chemische Genetische Scherm: Met behulp van een high-throughput-array pinning robot de S. cerevisiae DMA is replica uitgeplaat op medium met de juiste concentratie van de teststof. De platen worden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 24-48 uur, afgebeeld, en relatieve koloniegrootte bepaald.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3 :. Bepaling van de Sub-remmende concentratie. (A) De groei van BY4741 cellen op vaste media met 5-fluouracil. Verzadigde BY4741 cultuur verdund 1: 5000 en uitgeplaat op toenemende concentraties van 5-fluorouracil. (B) De groei curve van BY4741 cellen in vloeibare media met 5-flurouracil. ~ 4 x 10 4 cellen werden gedeponeerd in drievoud in toenemende concentraties van 5-FU en OD werd gemeten elke 10 min gedurende 22 uur.

Figuur 4
Figuur 4: Chemische genetische screen van 5-Fluorouracil. (A) S. cerevisiae deletiemutant matrix gerepliceerd op YEPD agar met 10 pM 5-FU (rechts) en DMSO controle (links). (B) De resultaten van het chemisch Genetische Screen: Relatieve groei van mutanten op 10 uM 5-FU vergeleken met DMSO controle bevolen door array-positie. (C) Relatieve groei van mutanten van 10 pM 5-FU vergeleken met DMSO controle gesorteerd koloniegrootte ratio. Een verhouding drempel van ≤0.8 is aangegeven op beide grafieken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5: Validatie van Chemical Genetische Interacties. Seriële verdunningen van verschillende geïsoleerde mutante stammen gekweekt op DMSO controle (A), 10 uM 5-FU ( C).

GO Categorie P-waarde Genen geïdentificeerd (hits) # Treffers Totaal van genen in het GO Categorie
tRNA wobble uridine- modificatie [GO: 0002098] 2,24 x 10 -6 SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 7 24
transcriptie, DNA-afhankelijke [GO: 0006351] 1.69 x 10 -5 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3- ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 32 540
vertaling [GO: 0006412] 4.28 x 10 -5 RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A 22 318
tRNA wobble positie uridine- thiolering [GO: 0002143] 1,88 × 10 -4 NCS6 URM1 TUM1 3 5
regulatie van transcriptie, DNA-afhankelijke [GO: 0006355] 4,98 × 10 -4 PDR3 LDB7 HIR1 HAP3- ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 27 507
eiwit urmylation [GO: 0032447] 6.33 × 10 -4 NCS6 URM1 URE2 3 7
mRNA export van kern in reactie hittestress [GO: 0031990] 2,04 x 10 -3 RPB4 NUP120 NUP133 3 10
nucleaire polyadenylerings-afhankelijke CUT katabool proces [GO: 0071039] 2,04 x 10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 10
tryptofaan metabolisme [GO: 0006568] 2.15 x 10 -3 TRP5 TRP3 2 3
vroeg endosoom naar Golgi transport [GO: 0034498] 2,75 x 10 -3 ENT5 TCA17 RCY1 3 11
ribosomale kleine subunit biogenese [GO: 0042274] 3.63 x 10 -3 SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A 4 24
chromatine modificatie [GO: 0016568] 3,64 x 10 -3 LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 9 114
ATP stofwisselingsproces [GO: 0046034] 4,23 x 10 -3 VMA2 VMA1 2 4
vacuole-proton transport van V-type ATPase complexe assemblage [GO: 0070072] 4,23 x 10 -3 VMA21 VPH2 2 4
chromosoom lokalisatie [GO: 0050000] 4,23 x 10 -3 NUP120 NUP133 2 4
mRNA transport [GO: 0051028] 4,59 × 10 -3 DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 6 58
vacuolair verzuring [GO: 0007035] 4,89 x 10 -3 VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 4 26
rRNA uitvoer uit nucleus [GO: 0006407] 5,63 x 10 <sup> -3 NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A 4 27
endocytose [GO: 0006897] 6,57 x 10 -3 SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 End3- 7 82
mRNA bewaking van mRNA 3'-end verwerking nucleaire [GO: 0.071.031] 6,92 x 10 -3 AIR1 MPP6 2 5
ncRNA polyadenylerings [GO: 0043629] 6,92 x 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
nucleaire polyadenylerings-afhankelijke snoRNA katabool proces [GO: 0071036] 6,92 x 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
nucleaire polyadenylerings-afhankelijke snRNA katabool proces [GO: 0071037] 6,92 x 10 -3 AIR1 TRF5 2 5
tryptofaan biosynthetische proces [GO: 0000162] 6,92 x 10 -3 TRP5 TRP3 2 5
eiwit inbrengen in ER membraan [GO: 0045048] 6,92 x 10 -3 GET1 GET4 2 5
mRNA stabilisatie [GO: 0048255] 6,92 x 10 -3 ATP25 IGO1 2 5
respons op DNA-schade stimulus [GO: 0006974] 7,05 x 10 -3 MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 Def1 MMS22 rad52 MRE11 RAD50 RMI1 12 197
in "> # treffers
GO Categorie P-waarde Genen geïdentificeerd (hits) Totaal van genen in het GO Categorie
nucleaire polyadenylerings-afhankelijke rRNA katabool proces [GO: 0071035] 8.46 x 10 -3 AIR1 TRF5 MPP6 3 16

Tabel 1: Gene ontologie (GO) Karakterisering van 5-fluorouracil Sensitive Mutants.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier geschetst is een aanpak voor het genereren van chemisch-genetische interactie profielen. De werkwijze is eenvoudig: bij het vergelijken kolonie groottes van elke stam in uitgebreide gendeletie collecties in de aanwezigheid en afwezigheid van een chemische stof, worden alle genen nodig om een ​​chemische insult tolereren geïdentificeerd. Annotatie verrijking analyse van de resulterende lijst van gevoelige stammen kunnen vervolgens worden gebruikt om inzicht in een chemische werkingswijze. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor gist kan ook worden aangepast voor gebruik met andere bekleed microbiële verwijdering verzamelingen zoals de E. coli Keio verzameling, die met succes is gebruikt voor honderden cellulaire storingen 26,27 sonde.

Chemisch-genetische profielen in gist en andere organismen is goed ingeburgerd. De meerderheid van deze studies hebben vertrouwd op competitietesten dat kwantificeren gepoolde deletiemutanten door middel van microarray-analyse of high-throughput lovertvloeden van unieke genetische barcodes. Deze aanpak is succesvol in het produceren van robuuste chemisch-genetische profielen van grote chemische bibliotheken bewezen. De hier beschreven methode een bruikbaar alternatief voor chemisch-genetische analyse van kleinere aantallen testverbindingen. De test is een eenvoudige uitlezing die minder dan onbetaalbaar hoge doorvoer sequentiebepaling of microarray en niet lijdt sequentie vertekening. Terwijl het protocol zoals beschreven vereist een robotic instrument voor colony manipulatie, worden dergelijke systemen steeds betaalbaar en afwisselend het protocol kan worden aangepast voor gebruik met handmatige pinning instrumenten, waarvan voorbeelden zijn opgenomen in de lijst van materialen.

Het is belangrijk om bewust van de beperkingen van deze benadering en chemische genetische profilering in het algemeen. Ten eerste moet de verbinding een effect op de levensvatbaarheid hebben gist, of de specifieke organisme wordt gebruikt. Terwijl vele fundamentele biologische processenen functies zijn goed geconserveerd tussen eukaryoten kunnen organisme specifieke chemische genetische interacties sterk variëren, evenals de opname van stoffen in cellen. Ook moet worden opgemerkt dat verschillende deletiestammen zijn gevonden gevoelig meerdere drugbehandelingen 8 zijn. Deze omvatten genen betrokken bij drug efflux, vacuole functie en membraan integriteit. Het is belangrijk om rekening te houden met meervoudige geneesmiddelresistentie bij het maken conclusies met betrekking tot directe en indirecte werking.

Het scherm hier beschreven werd uitgevoerd met behulp van de haploïde verwijdering collectie, een gemeenschappelijke aanpak voor de chemische-genetische analyse in gist. Er zijn nu meerdere verzamelingen van gist mutanten beschikbaar verdere steun de bepaling van mode een chemische verbinding van beroep. Dit omvat niet alleen de volledige homozygote en heterozygote diploïde verwijdering collecties, ook voorwaardelijke temperatuurgevoelige essentiële gen mutanten, de Decreased Overvloed door mRNA Perturbation (vochtige) gistmutant bibliotheek en een synthetische histon H3 en H4 mutant collectie, die kunnen worden gebruikt om epigenetische gebaseerde moleculaire therapieën 3,4,28 onderzoeken, gezien de ongelooflijke diepte van de beschikbare instrumenten, het gemak van de methodologie en de beperkte infrastructuur vereist deze aanpak levert een toegankelijk formaat om rijke functionele informatie met betrekking tot het mechanisme van een chemische verbinding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Onderzoek in de CJN lab wordt ondersteund door exploitatiesubsidies uit NSERC, de Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI), en de Canadese Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract BioBasic G0961 For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder BD Biosciences 211820 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose Anachemia 31096-380 For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A Bio Basic FB0010 For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418 A.G. Scientific Inc. G-1033 Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. 
12-well plate Greiner Bio One 655180
5 ml culture tubes Evergreen Scientific 222-2376-080
10 cm Petri Dish VWR 25384-302
ROTOR HDA Singer Instruments  ROT-001 high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish Singer Instruments  PLU-001 Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-384 Box of 1,000 pads
1536 Short-Pin RePad Singer Instruments  RP-MP-1536 Box of 1,000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems S&P robotics http://www.sprobotics.com Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools V&P Scientific http://www.vp-scientific.com Handheld replication tools and accessories. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
  2. Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
  3. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
  4. Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  6. Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  7. Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
  8. Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
  9. Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
  10. Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
  11. Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
  12. Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10, (6), (2010).
  13. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  14. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
  15. Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
  16. Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
  17. Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
  18. Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
  19. Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
  20. Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
  21. Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
  22. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
  24. Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
  25. Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
  27. Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
  28. Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics