Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge
Published 12/27/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wagner, M., Koester, H., Deffge, C., Weinert, S., Lauf, J., Francke, A., et al. Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes. J. Vis. Exp. (94), e52347, doi:10.3791/52347 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Denne studien ble utført med tillatelse av staten Sachsen og Sachsen-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, i henhold til § 8 i den tyske loven for dyrevern (24D-9168,11 til 1 / 2008-24).

En Cell Isolation

1.1 Utarbeidelse av Femur og Tibia

  1. Bedøve mus ved hjelp av en 5% isofluran konsentrasjon ved å fordampe isofluran i en lukket kasse. Etter at musen har sluttet å bevege seg i 3 sekunder, utfør halshugging.
  2. Desinfisere baklemmene med etanol (96%). Fjerne hud og muskler og skille bein med en steril skalpell.
    1. Start med en lyske snitt i huden, og forlenge snittet mot mediale malleol og utføre en sirkulær disseksjon av huden rundt nedre kalv. Fjerne huden av benene helt ved å trekke den proksimalt.
    2. Løsne quadriceps muskel fra femur med en skarp skalpell, fjerne både fremre peroneusog gastrocnemius muskelgrupper og disarticulate beinet på hofteleddet ved å finne og dissekere leddbånd.
    3. Begynn anteriorly og fortsett rundt leddet ved forsiktig rotere beinet og transecting leddbånd, og dermed disarticulating leddet.
  3. Vask femur og tibia med 96% etanol i minst 90 sekunder for å sikre aseptisk cellepreparat. Fortsett vaskeprosessen med steril PBS å skylle av resterende etanol.
    Merk: Alle etterfølgende trinn må være sterilt for å unngå forurensning.

1.2 Høsting av Bone Marrow

  1. Skjær den proksimale og distale ende av hvert ben med et par av fine sakser for å få tilgang til de femorale og tibiale aksler. Vær forsiktig med dette trinnet, siden disse bein bryte veldig enkelt.
  2. Spyl bein med varmt medium (M199 + 10% føtalt kalveserum (FCS) + 1% penicillin / streptomycin). Bruke en steril 28-G nål, en 1 ml sprøyte, og mellom 10 til 15 ml medium prbein for skylling.
  3. Hold benet med en fin pinsett og skyll en etter en til den blir semi-gjennomsiktig. Nøye trykk til enden av sprøytestemplet for å minimalisere stress i cellene.
  4. Filtrere benmargen gjennom en 70 mikrometer nylon web og samle filtratet. Å hente ut det maksimale mengden av benmarg, skyll gjentatte ganger fra de fjerne og nære ender.
  5. Skylle sikten med PBS og samles filtratet. Løsne nøye rusk og cellulære konglomerater av forsiktig omrøring og pipettering.

1.3 Dyrking

  1. Sentrifugere cellesuspensjonen ved 250 xg i 10 min ved RT Kast supernatanten og resuspender cellene med omtrent 25 ml av medium. Gjenta en gang.
  2. Resuspender cellene i 6 ml medium etter det andre vasketrinn. Bland 50 ul av celleløsningen med 50 ul av trypanblått. Tell cellene i et tellekammer under et lysmikroskop. Beregne antallet calen i løsningen ved hjelp av denne formelen:
    Ligning 1
  3. Seed cellene på 6-brønners ultra-low-festeoverflateplatene for å forhindre permanent adhesjon til bunnen av platen. Bruke en konsentrasjon på 10 6 celler pr ml med opp til 6 ml per brønn.
  4. Supplement av suspensjonen med 20 ng / ml M-CSF for å fremme celledifferensiering.
  5. Kultur av cellene i 5 dager ved 37 ° C og 5% karbondioksyd og observere daglig.

1.4 Høsting av celler

Merk: Disse trinnene bør utføres på is. Fortsett med enten 1.4.1 eller 1.4.2 tilsvarende.

  1. På dette punktet, høste hele kulturen, inkludert differensierte makrofager som vil forholde seg til de kultur-plater, selv om de er ultra-lave festeoverflate plater.
    1. Høste hele kulturen ved forsiktig pipettering og løsne med en løsning av 4 ° C PBS, 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA. Gjenta til platene er klar av gjenværende heftende celler - bekrefte under et mikroskop hvis usikker.
  2. Alternativt kast heftmakrofager ved å høste supernatanten med cellene i suspensjon, som hovedsakelig inneholder monocytter.
    1. Høste de ikke-adherente celler med en oppløsning av EDTA-fri PBS og 0,5% BSA. Ikke bruk for mye kraft for å unngå å flytte mildt tilhenger makrofager.

1,5 FACS-analyse (valgfritt)

Merk: Det er mulig å utarme cellesuspensjonen av CD117 + stem- og stamceller ved bruk av MACS. Bruke produsentens protokoller for denne prosedyren.

  1. Høste celler i henhold til enten trinn 1.4.1 eller 1.4.2.
  2. Sentrifuger cellene ved 250 x g i 10 min ved 4 ° C og gjenta dette trinnet på nytt.
  3. Resuspender minst 250 000 celler i 300 ul FACS bUffer per sonde.
  4. Overfør celleløsningen på en 96-brønns-plate (30 ul per brønn).
  5. Sentrifugere cellesuspensjonen ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  6. Fjern supernatanten og tilsett 25 pl av antistoff til hver brønn (bruk produsenten fortynning).
  7. Flekk cellene med antistoffer (etter produsentens protokoller for celle fenotyping etter trinn 1.5.1-1.5.6. Vanlig brukte markører for monocytt- / makrofag identifikasjon inkluderer CD11b, F4 / 80 (figur 3), CD115 (figur 2), og Gr- 1.
    Merk: For en nærmere beskrivelse av celleløsninger, er bruk av markører som CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G, og CD192 anbefales. Cellulære karakteristika ble tidligere beskrevet 12.
  8. Inkuber prober for 20 min ved 4 ° C.
  9. Sentrifuger prober ved 250 xg i 5 min ved 4 ° C og resuspender med 200 ul FACS-buffer. Gjenta ther trinn to ganger.
  10. Overfør sondene inn FACS rør og utfører FACS analyse 12.
  11. Utføre FACS-analyse 12 på dag 0, 3 og 5 for å analysere celledifferensiering.

2. Tail Vein Injection

2.1 Forberedelse

  1. Varm dyrene på en varmeplate ved 37 ° C i omtrent 10 min. Observere dyrene mens varmer å gjenkjenne tegn på overoppheting.
  2. Resuspender monocytter, isolert i trinn 1.1- 1.4, i 150 ul av NaCl, og laste cellene i en 1 ml insulinsprøyte med en 30G nål. Lett vortex løsningen før du legger sprøyten å sikre at alle monocytter er injisert. Alltid håndtere celler på is for å unngå varme mediert vedlegg og aktivering av monocytter.

2.2 besøksforbud

  1. Unngå å forstyrre andre mus i bur når du velger en mus for intravenøs injeksjon.
  2. Plasser musen inn i rainer. Unngå for mye prEssure og være forsiktig med baklemmene. (Figur 4)
    Merk: Alternativt kan du bruke narkose for å garantere stress gratis håndtering av dyrene.
  3. Kontroller at musen har plass til å puste før du lukker rainer.

2.3 Injeksjon

  1. Desinfiser injeksjonsstedet med desinfeksjonsmiddel. Spray på halen av musen og la stå i minst 1 min.
  2. Stoppe veneblodstrøm i halen ved å påføre forsiktig trykk til den laterale halesiden over injeksjonsstedet, for å bedre synligheten av årer.
  3. Slå halen 90 grader, før injeksjon. (Figur 5)
  4. Injisere i en 45 graders vinkel. Injisere langsomt og ikke mer enn fem mikroliter per g for å unngå å skade dyr.
  5. Hvis det er en blemme, som er et tegn på en mislykket injeksjon, slutte umiddelbart og gjenta injeksjonen mer proximally.
  6. Stoppe blødning på injeksjons side ved å bruke milde prykk i ca 1 min.
  7. På slutten av prosedyren, åpnes tilbaketrekkingshylsen og plassere musen i buret.
  8. Legg merke til mus i 20 min for å sikre at dyret ikke ble skadet av injeksjonen og sternum recumbency opprettholdes. Forlenge tiden observasjon inntil musen gjenvinner tilstrekkelig bevissthet. Returnere musen til selskap med andre dyr bare etter at det er fullstendig restituert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den celleløsning ekstrahert fra den murine benmargs består av forskjellige celletyper. De store celletyper er lymfocytter, granulocytter og monocytter. Celletyper kan anslås ved størrelse og kornethet, som er vist i figur 1 for både innfødte suspensjoner og celler høstet etter 5 dager med differensiering. Legg merke til skiftende cellulære sammensetningen under dyrking. Imidlertid må nøyaktig klassifisering av bestander stole på særegne uttrykk for cellulære markører.

Den viktigste markør som brukes til å identifisere celler av MPS-systemet er CD115, som fungerer som M-CSF-reseptor, og er spesielt uttrykt på monocytter stamceller, monocytter og makrofager. Derfor kan den ikke brukes til å identifisere karakteristiske MPS-undergrupper, men kan på en pålitelig måte estimere absolutte mengden av celler som drives inn i monocytt / makrofag differensiering. Se figur 2 for en tidslinje av CD115 uttrykk under avvikeentiation.

Markøren modenhet F4 / 80 er nyttig å skille juvenile monocytter, modne monocytter og makrofager. Makrofager viser sterkt uttrykk av F4 / 80 i forhold til juvenile monocytter stamceller, som er negative for markøren. Modne monocytter viser mellom uttrykk for F4 / 80. En kombinasjon av CD115 og F4 / 80 markører representerer derfor en mulig metode for å kvantifisere og overvåking av celledifferensiering (se figur 3).

Kombinasjonen av CD115 og F4 / 80 er tilstrekkelig for rutine kultur observasjon og kvalitetskontroll før påføring av cellene. En mer detaljert undersøkelse av benmarg-deriverte monocytter på dag 5 av dyrking bekrefter deres strukturelle og funksjonelle egenskaper i konkordans til de av perifert blod monocytter 12.

Det er viktig å løse musen omhyggelig i rainer, unngå spenning på halen. Begrense Freedom av bevegelse så mye som mulig uten å inhibere puste for å lette injeksjonen.

Figur 1
Figur 1. Venstre panel.: Sammensetning av celletyper på dag 1 i kultur Cell typer inkluderer lymfocytter, monocytter og granulocytter. Høyre panel: Legg merke til skiftende cellulære sammensetningen under dyrking. Cellepopulasjon inkluderer monocytter og makrofager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Tidslinje av CD115 uttrykk under differensiering. Legg merke til at> 95% av alle cellene er CD115 positiv etter fem dager med differensiering, noe som indikerer at de aller Flertallet av cellene er enten monocytter eller makrofager. Klassifisering kan være basert på celle størrelse og detaljnivå, men bestemte cellulære markører er mer pålitelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Økende uttrykk Dag 5 av monocytt- / makrofag modenhet markør F4 / 80:. Legg merke til utseendet av en befolkning med mellom F4 / 80 uttrykk, som er konsistent med monocyte fenotype. Dag 7:. Legg merke til høyre forskyvning av F4 / 80 uttrykk, i samsvar med makrofag modning Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

e 4 "src =" / files / ftp_upload / 52347 / 52347fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Mouse fast i rainer for halevenen injeksjon. Etter nøye besøksforbud musa, roter halen 90 grader til venene er synlige på ryggsiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Skjematisk tverrsnitt av musehale. Bildet viser plasseringen av skip i musehale. Arteriene (rød) er plassert på ventral og ryggsiden, og venene er på den laterale side av halen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en enkel og kostnadseffektiv metode for å isolere store mengder av murine monocytter fra benmarg. I forhold til andre protokoller ved hjelp av perifert blod, som får monocytter gir 5 av 1.4 x10 6, er vi i stand til å oppnå høyere avkastning på 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocytter fra en enkelt donor mus.

Ved vurdering av utfordringene med denne metoden, er det viktig å nevne muligheten for forurensning når det arbeides under ikke-sterile betingelser. Hvis skylling og de følgende vasketrinn følges ikke riktig, forurensning av bakterier og sopp er sannsynlig. I tillegg består benmarg av heterogene cellesuspensjoner, inkludert granulocytter, lymfocytter og erytroide celler. Normalt er disse cellene forsvinne mellom dag 2 og 3 av dyrkning på grunn av mangel på vekstfaktorer. Etter vekstfaktor drevet differensiering, makrofager er den viktigste kilden til forurensning. For å holde tHan antall makrofager lav og for å minimalisere differensieringen av monocytter til makrofager, bruk av ultralave festeplatene og vasketrinn som er nevnt ovenfor, er kritisk.

Det er vanskelig å identifisere en markør som er utelukkende monocytt-spesifikke. Interferens mellom markørene nødvendiggjør anvendelse av mer enn en markør, og det er variasjon i detaljene og størrelse på cellene i å analysere cellesuspensjoner. Markører og beskrivelser vist i figurene 1-3 er gode alternativer for representative celletyper i kultur. Det kan være vanskelig å skille mellom de forskjellige celletyper, spesielt etter dag 5. Derfor er det viktig å benytte andre markører som CD115 og F4 / 80.

Vurderer utvidelse av benmargceller i henhold vedheft frie forhold, kan makrofag differensiering forlenges og udifferensierte monocytter kan akkumulere. Makrofag differensiering indikerer forurensning; Men due til sin klebende karakter, selv om ultra-low-festedyrkingsflater, kan de lett bli forkastet mens bare høsting ikke-klebende celler i kultur. I tidligere eksperimenter 1,3, og forurensning av makrofager ikke ført til alvorlige kliniske bivirkninger. Histologisk opparbeiding av organer og muskler av mus etter celletransplantasjon viste at injisert makrofager assimilert i organer som milt, lever eller lunge. Assimilering av makrofager i disse organene viste ingen observerbare kliniske effekter i mus. Den molekylære mekanismen utløses av disse makrofager kan være interessante spørsmål for videre undersøkelser.

Monocytter samt makrofager påvirke arteriogenesis i perifer arteriell sykdom, særlig når den brukes systemisk. Kliniske bivirkninger som emboli eller massive systemisk inflammasjon kunne ikke observeres selv etter injeksjon av mer enn 2,5 millioner monocytter, men disse cellene kan forårsake betennelse og potentially forårsake alvorlige systemiske effekter. I menneskelige forsøk, disse effektene er sannsynlig å ha klinisk betydning. Utløsning av arteriogenesis kan påvirke tumorvekst eller diabetisk retinopati, og slike mulige systemiske effekter av injiserte celle løsninger bør utforskes i fremtidige studier.

Tidligere publikasjoner 9 beskrive forskjellene mellom egenskapene til perifere blod- og benmarg-avledede monocytter, som forklarer hvorfor egenskapene til monocytter fra benmarg kan avvike fra de som er isolert fra perifere blodceller.

Metoden for isolasjon er av klinisk interesse. Tegning blod i stedet for å ekstrahere human benmarg er mer praktisk i sammenheng med klinisk medisin. Det er viktig å se etter at dyrenes velferd og for å søke analgesi hvis nødvendig. For intravenøse injeksjoner, er det avgjørende å praktisere håndtering både dyr og sprøyten samtidig. Hvis en enkelt animal gjennomgår multiple injeksjoner, kvaliteten av årer og huden av halen lide.

Til tross for disse ulemper, er denne metoden meget nyttig for å studere oppførselen og karakteristikker av monocytter. Forsøk i marken av aterosklerose, immunologi eller betennelse kan dra nytte av denne fremgangsmåten. Kun 30 min er pålagt fra utvinning av benmargen til seeding av celler på seks-brønns ultra-lave festeoverflate plater. Etiske hensyn er minimalisert, fordi det høye utbyttet av denne protokollen minimaliserer antallet dyr som kreves som celledonorer. Denne nye metode vil være nyttig for mange studier som involverer monocytter.

Vi har vært fokusert på terapeutisk styrking av sivile vekst fartøy via transplantasjon av monocytter. Den multifaktoriell natur denne prosessen kan forklare hvorfor enkeltfaktor tilnærminger for styrking av arteriogenesis har generert blandede resultater 13,14. Dette har ført til igranskning av celle-baserte terapier. Autolog benmargavledede stilk og stamceller har blitt identifisert som potensielle celler for transplantasjon, men bare moderate kliniske fordeler har blitt rapportert 15. Foruten forskning på dosering, isoleringsmetoder, og administrasjonsveier, er ytterligere forskning fortsatt nødvendig for å fastslå den optimale celletype. En ulempe ved autolog celletransplantasjon kan være deres manglende evne til å aktivere det medfødte og / eller adaptive immunrespons, og begge er kritiske for arteriogenesis. Økende lokal betennelse kan representere den beste stimulans for arteriogenesis 16.

Intravenøs injeksjon av monocytter er en vanlig metode for celletransplantasjon i musemodeller hvis systemisk legemiddelavlevering er ønsket. På grunn av systemiske effekter, kan bivirkninger forekomme også. Sørg for at venen er målrettet for injeksjon. Det er vanlig å forveksle arterier og vener, spesielt når sprøyte tungt pigmentert mice. Arteriell injeksjon kan forårsake emboli, noe som fører til strukturelle endringer i omløp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well-ultra-low-attachment plate Corning Incorporated, NY, USA 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine GE Healthcare, Freiburg, Germany Fraction V, pH 7.0
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 28G, 30G
CD115 eBioscience, San Diego, USA 12-1152
CD11b eBioscience, San Diego, USA 53-0112
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany With cap, steril
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%  Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80 AbD Serotec, Düsseldorf, Germany MCA497APC
FACS buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD FACS Canto II
FACS tubes     Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1 eBioscience, San Diego, USA 53-5931
Heating plate  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany Incu safe
Isofluran Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Mechanical shaker IKA, Staufen, Germany ms2 minishaker
Medium 199 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Monocyte wash buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer Various
NaCl Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany pH 7.4, sterile
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany 15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany Julabo SW22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15, (1), 1-12 (2004).
  2. Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391, (2), 72-82 (2006).
  3. Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5, (2), 155-169 (2013).
  4. Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103, (7), 2668-2676 (2004).
  5. Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
  6. Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
  7. Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99, (5), 1517-1526 (2002).
  8. Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43, (6), 367-371 (1981).
  9. Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359, (1-2), 1-10 (2010).
  10. Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28, (6), 766-772 (2007).
  11. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206, (3), 595-606 (2009).
  12. Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59, (9), 813-825 (2011).
  13. Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108, (4), 753-761 (2009).
  14. Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55, (1), 17-25 (2009).
  15. Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53, (2), 445-453 (2011).
  16. Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3, (2), e000611 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats