चूहे में hippocampal क्षेत्र के दांतेदार गाइरस में वृक्ष के समान द्रुमायण का आकलन

1VA Palo Alto Health Care System, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 3Department of Physical Therapy, Arkansas State University
Published 3/31/2015
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Neuroscience

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Summary

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Das, D., Phillips, C., Lin, B., Mojabi, F., Akif Baktir, M., Dang, V., et al. Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52371, doi:10.3791/52371 (2015).

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Abstract

Introduction

Synapses के नंबर और संरचना में गतिशील परिवर्तन विकास, उम्र बढ़ने की पहचान है, और कई neurodegenerative विकारों 1-3 कर रहे हैं। अन्तर्ग्रथनी जानकारी प्राप्त करने और एकीकृत करने के लिए न्यूरॉन्स की क्षमता वृक्ष के समान आकृति विज्ञान और synaptic कनेक्शन में गतिशील परिवर्तन पर निर्भर करता है। दरअसल, एक सकारात्मक संबंध संज्ञानात्मक समारोह 4 को प्रभावित, जो दोनों के वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी और अन्तर्ग्रथन संख्या के बीच मौजूद है। इस प्रकार, यह वृक्ष के समान रीढ़ संख्या में decrements वृक्ष के समान रीढ़ मात्रा का ठहराव में बहुत रुचि उत्साह, तंत्रिका संबंधी विकारों में 5-7 की संख्या में संज्ञानात्मक रोग के साथ संबद्ध किया गया है कि आश्चर्य की बात नहीं है। फिर भी, रीढ़ की हड्डी के घनत्व की मात्रा का ठहराव वृक्ष के समान पेड़ भर synapses के स्थलाकृति और वितरण के बारे में उपयोगी जानकारी उत्पन्न करने में विफल रहता है कि एक समय लेने वाली और कठिन काम रहता है। सौभाग्य से, धुंधला तरीकों (जैसे, गोल्गी-कॉक्स और doublecortin (DCX)) संयोजन के रूप मेंपरिष्कृत इमेजिंग तकनीक के साथ मौजूदा बाधाओं पर काबू पाने और एक विश्वसनीय और शीघ्र तरीके से वृक्ष के समान द्रुमायण की उच्च संकल्प छवियों का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। गोल्गी-कॉक्स धुंधला विधि सभी न्यूरॉन्स 8 में वृक्ष के समान द्रुमायण की स्थिति का आकलन करने के लिए तैनात किया जा सकता है, DCX न्यूरोजेनेसिस दोनों में होता है यह देखते हुए कि विशेष रूप से दांतेदार गाइरस और subventricular जोन 9, एक महत्वपूर्ण विचार में नव जन्मे न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए तैनात किया जा सकता है उम्र 10,11 भर में इन क्षेत्रों के।

धुंधला के बाद, दो तरीकों इमेजिंग वृक्ष के समान विशेषताओं का आकलन करने के लिए तैनात किया गया था: मैं) वास्तविक समय इमेजिंग (आरटीआई) और क्षेत्र इमेजिंग (EDFI) की द्वितीय) बढ़ाया गहराई। आरटीआई तकनीक का पता लगाने और अलग-अलग वृक्ष के समान क्षेत्रों और शाखाओं के साथ द्रुमायण की लंबाई और आदेश यों के लिए एक मतलब प्रदान करता है। इस प्रकार यह कुल क्षेत्रफल और प्रत्येक वृक्ष के समान पेड़ के कब्जे में मात्रा का अनुमान लगाने के लिए एक सक्षम बनाता है। अधिक हैpecifically, आरटीआई विधि में उपयोगकर्ता लगातार खंडों की पहचान करता है और सॉफ्टवेयर अनुरेखण न्यूरॉन वृक्ष के समान संरचना की एक्स, वाई, जेड और निर्देशांक एकत्र करता है के रूप में iteratively refocuses और 3 डी में वृक्ष के समान संरचना के प्रक्षेपवक्र reconstructs। तुलनात्मक रूप से, EDFI विधि, एक समग्र छवि पैदा करने के लिए पूरे Z अक्ष पर जानकारी उपलब्ध कराने के द्वारा नहीं बल्कि मोटी ऊतक नमूनों में वृक्ष के समान घनत्व का आकलन करने के लिए एक नहीं बल्कि सरल और तेजी लाई साधन प्रदान करता है। ऐसा करने के लिए, उपयोगकर्ता खंड की मोटाई में उच्च परिभाषा वीडियो फ़ाइलों को रिकॉर्ड करता है और फिर एक पिक्सेल ध्यान में पूरी तरह से है जिसमें बिंदुओं की पहचान करने के लिए वीडियो फ्रेम खोज करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है। बाद में, ध्यान केंद्रित पिक्सल का विलय कर दिया और एक उच्च संकल्प, समग्र 2 डी छवि में एकीकृत कर रहे हैं। यह संयुक्त छवि की परवाह किए बिना z अक्ष में अपनी स्थिति की में ध्यान केंद्रित किया गया है कि सभी पिक्सल होते हैं। इन 2 डी छवियों के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण घनत्व निर्धारित करने के लिए बाद में इस्तेमाल किया जा सकता हैके वृक्ष के समान हर क्षेत्र में शाखाओं में बंटी।

अन्त में, हम ब्याज की एक पूरे क्षेत्र में विश्लेषण और dendrites के आकलन के लिए अत्यंत उच्च संकल्प छवियों पैदा करने के लिए एक मनोरम विधि प्रस्तुत करते हैं। यह तकनीक बहुत उच्च संकल्प और महंगे डिजिटल कैमरों के लिए उपयोग की कमी को दूर करने के लिए तैनात किया जा सकता है। इस विधि का प्रयोग, एक एक्स और वाई axes साथ विभिन्न स्थानों पर सीरियल कब्जा छवियों और फिर स्वचालित रूप से उन्हें एक साथ एक फ्रीवेयर का उपयोग कर टांके (जैसे, छवि समग्र संपादक)। विशेष रूप से, इस विधि का नहीं बल्कि एक व्यापक क्षेत्र में वृक्ष के समान द्रुमायण के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: प्रयोगों दिग्गजों मामलों पालो अल्टो स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली में पशु अनुसंधान पर समिति द्वारा अनुमोदित नैतिक मानकों के अनुसार आयोजित की गई।

1. गोल्गी-कॉक्स धुंधला

  1. ब्रेन निष्कर्षण और धुंधला
    1. 1 दिन, गहरा exsanguination के माध्यम से euthanizing से पहले 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine के साथ चूहों anesthetize।
    2. ध्यान से calvarium को हटाने और मस्तिष्क बाहर काटना।
      1. सबसे पहले सेरिबैलम के शीर्ष पर एक घुमावदार कैंची रखकर, खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा को हटाने और धीरे घ्राण बल्ब की ओर दिशा में चलती है, जावक बताया कैंची की नोक के साथ केंद्रीय परिखा को calvarium समानांतर माध्यम से काटा। दोनों पक्षों पर इस प्रक्रिया को दोहराएं।
      2. घ्राण बल्ब की ओर मोड़, जबकि calvarium उठा और इसे दूर तोड़ने के लिए एक शल्य pincet का प्रयोग करें। फिर, उल्टा खोपड़ी फ्लिप और ऑप्टिक के माध्यम से कटौती करने के लिए एक लेने का उपयोगनसों और दिमाग ढीला। अंत में, रंध्र मैग्नम के स्तर पर रीढ़ की हड्डी से मस्तिष्क अलग करने के लिए लेने का उपयोग करें।
    3. इसके तत्काल बाद वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध है, undiluted गोल्गी-कॉक्स समाधान के 15 मिलीलीटर में मस्तिष्क विसर्जित कर दिया। अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक छाया, 20 मिलीलीटर कांच की बोतल में गोल्गी समाधान में मस्तिष्क की दुकान।
    4. 2 दिन पर, धीरे-धीरे समाधान उंडेल और 15 मिलीलीटर ताजा गोल्गी-कॉक्स समाधान के साथ बदलें। दिमाग युक्त बोतल हालात और अंधेरे में एक और 9 दिनों तक अछूता छोड़ दें।
  2. सेक्शनिंग और embedment
    1. 11 वें दिन पर, निर्जलीकरण के लिए DDH 2 ओ में तैयार 30% sucrose के समाधान में दिमाग, जगह है। 12 घंटे के बाद हौसले से तैयार 30% sucrose के साथ समाधान बदलें। 4 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिनों के लिए एक 30% sucrose के समाधान में दिमाग को सेते हैं।
    2. ब्लेड कवर किया जाता है जब तक 14 वें दिन में, एक 30% sucrose के समाधान के साथ vibratome के जलाशय को भरने। एक मीटर करने के लिए गति सेट करेंएम / एस .95 मिमी के आयाम के साथ।
    3. अतिरिक्त नमी को दूर करने और coronally कटौती करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग सेरिबैलम दूर करने के लिए एक Kimwipe साथ दिमाग दाग।
    4. मजबूती superglue का उपयोग कर vibratome मंच पर पूरे दिमाग माउंट और यह 2-4 मिनट के लिए निर्धारित करने की अनुमति देते हैं। जलाशय में पालन मस्तिष्क के साथ मंच डालें और मस्तिष्क के शीर्ष पर ब्लेड समायोजित करें।
    5. Vibratome का उपयोग, हर 3 मस्तिष्क के बाद ब्लेड बदलने के लिए याद, कमरे के तापमान पर 150 माइक्रोन मोटी वर्गों में मस्तिष्क टुकड़ा।
    6. एक छोटे से इत्तला दे दी ब्रश का उपयोग कर जलाशय से वर्गों उठाओ और DDH 2 ओ में की गई 0.3% जिलेटिन युक्त एक पेट्री डिश में उन्हें विसर्जित वर्गों पेट्री डिश में रहते हैं, प्रत्येक स्लाइड पर 0.5 मिलीलीटर 0.3% जिलेटिन की जोड़ सकते हैं और फैला है और कोट Superfrost + स्लाइड के लिए एक ब्रश का उपयोग करें।
    7. धीरे पेट्री डिश से डूबे वर्गों उठाओ और gelatinized स्लाइड्स पर उन्हें जगह है। द्वारा मस्तिष्क वर्गों पूरबीकेवल अपने पक्ष पर नहीं है और सबसे ऊपर है पर उन्हें छू।
    8. के बारे में दस मिनट के बाद, कोट ऊतक पूरी तरह से सूख जाता है 30% sucrose के साथ वर्गों से पहले। फिर हवा तीन दिनों के लिए एक स्लाइड रैक में एक अंधेरी जगह में तैयार स्लाइड सूखी।
    9. DDH 2 का उपयोग कर ओ 1x करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 10x का विकास समाधान पतला 7-10 मिनट के लिए समाधान विकसित करने में स्लाइड विसर्जित कर दिया। DDH 2 ओ में स्लाइड्स तीन बार कुल्ला
  3. निर्जलीकरण
    1. आसुत DDH 2 ओ का उपयोग कर 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, और 95% इथेनॉल समाधान तैयार
    2. 10 मिनट प्रत्येक के लिए तेजी से उच्च इथेनॉल समाधान में स्लाइड्स भिगोएँ।
    3. 10 मिनट प्रत्येक समय के लिए 100% इथेनॉल समाधान में 3 बार स्लाइड भिगोएँ।
    4. वे कवर फिसल कर रहे हैं जब तक अंतिम समाधान में वर्गों रखने, 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100% में xylene लगातार 3 बार स्लाइड भिगोएँ।
    5. DPX (xylene में डि-एन-Butyl phthalate) बढ़ते मध्यम (अटल बिहारी के एक उदार राशि प्लेसएक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet का उपयोग प्रत्येक स्लाइड पर बाहर 1-1.5 मिलीलीटर)। ध्यान से बुलबुले से बचने के लिए coverslips जगह है।
    6. शुष्क हवा कवर फिसल-मस्तिष्क वर्गों क्षैतिज 3 दिनों के लिए।

2. Doublecortin धुंधला

  1. गहरा (कदम 1.1.1 देखें) जानवरों anesthetize।
  2. फॉस्फेट बफर 12 में किए गए हौसले से तैयार 4% paraformaldehyde के साथ हृदय छिड़काव प्रदर्शन करते हैं।
  3. एक कमाल प्रकार के बरतन पर रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde के 45 मिलीलीटर में दिमाग (1.1.2 देखें) और दुकान निकालें।
  4. एक 30% sucrose के समाधान के लिए दिमाग स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए पूरी तरह निर्जलीकरण के लिए प्रतीक्षा करें। सूक्रोज से दिमाग निकालें और सूखी बर्फ पर रखा तांबे ब्लॉक पर सीधे उन्हें जगह है।
  5. इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) परिसर के साथ ब्लॉक भरें और एक मील का पत्थर के रूप में घ्राण बल्ब का उपयोग कर मस्तिष्क के उन्मुखीकरण के निशान।
  6. एक cryostat का प्रयोग, -20 डिग्री सेल्सियस पर 70 माइक्रोन मोटी वर्गों में कटौती और उन्हें जगहcryoprotectant समाधान (0.05 एम सोडियम फॉस्फेट बफर में 25% इथाइलीन ग्लाइकॉल, 25% ग्लिसरॉल, 7.4 पीएच) और में -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करें जब तक रहते हैं।
  7. 50% cryoprotectant और 50% मेथनॉल का समाधान करें। इस समाधान के लिए 0.5% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (खंड / खंड) जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अस्थायी वर्गों सेते हैं।
  8. एक ऊतकीय उन्हें ओवन में रखकर 30-40 मिनट के लिए टीबीएस में 37 डिग्री सेल्सियस (Tris बफर खारा) में गर्म वर्गों।
  9. पूर्व immunostaining के लिए कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन और 3% सामान्य घोड़े सीरम के साथ वर्गों सेते हैं। 0.3% ट्राइटन और 1% सामान्य घोड़े सीरम के साथ टीबीएस में 500: रातों रात एक पतला DCX एंटीबॉडी के 3 मिलीलीटर समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों सेते हैं।
  10. अगले दिन टीबीएस में वर्गों (10 मिनट प्रत्येक) लगातार 3 बार धो लो।
  11. कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए: (टीबीएस में 200 1) एक biotinylated घोड़ा विरोधी बकरी के साथ वर्गों सेते हैं। टीबीएस में वर्गों (10 मिनट प्रत्येक) लगातार 3 बार धोएं।
  12. टी सेतेकमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए: एबीसी लाइट (1000 1) के साथ हेम।
  13. 2 2 हे थपका की 10 मिलीग्राम 1 एम Tris-एचसीएल (पीएच 7.6) के 15 मिलीलीटर में भंग (3,3 "-Diaminobenzidine) समाधान की एक गोली के लिए 30% के एच 5 μl जोड़ें। 5 मिनट के लिए इस समाधान में तुरंत वर्गों सेते हैं।
  14. ठंडा टीबीएस के साथ कमरे के तापमान पर टीबीएस में एक धोने के द्वारा पीछा तीन बार उन्हें धोने से प्रतिक्रिया को समाप्त।
  15. Xylene में स्पष्ट इथेनॉल समाधान की एक श्रृंखला (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 मिनट प्रत्येक), का उपयोग कर वर्गों निर्जलीकरण, और फिर 1.3 चरण में के रूप में dpx का उपयोग कर पर्ची को कवर किया।

3. दृश्य

  1. वर्गों का पूरा सुखाने के बाद, एक तेज ब्लेड के साथ स्लाइड के शीर्ष पर अतिरिक्त DPX हटाने, और माइक्रोस्कोप की स्कैनिंग के मंच पर उन्हें जगह है। सिस्टम को स्कैन मंच, जॉयस्टिक, और एक रंग 12 बिट कैमरा से लैस एक माइक्रोस्कोप से बना है।
  2. कार्यक्रम की शुरुआत करें। एक नए डेटा फ़ाइल खोलें।
  3. जगहकिसी भी स्थान पर माउस सूचक के साथ क्लिक करके स्क्रीन पर एक संदर्भ बिंदु। इस कार्यक्रम की खिड़की के उपकरण पैनल से सभी माउस को सक्रिय करेंगे।
  4. उपकरण पट्टी पर "जॉयस्टिक नि: शुल्क" आइकन पर क्लिक करें और फिर प्रथम खंड में हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस पता लगाने के लिए जॉयस्टिक का उपयोग करें।
  5. प्रोग्राम विंडो के "उपकरण" टैब में, "सीरियल धारा प्रबंधक" का चयन करें। विंडो के निचले बाएं कोने पर "नई धारा 'आइकन पर क्लिक करें। यह "सीरियल धारा सेटअप" विंडो खुलेगा।
  6. सीरियल धारा सेटअप विंडो का चयन करें और फिर हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों में होते हैं कि वर्गों की कुल संख्या दर्ज करें। मूल्यांकन के अंतराल का चयन करें। अनुभाग में कटौती मोटाई (DCX के लिए 70 माइक्रोन और गॉल्जी से सना हुआ वर्गों के लिए 150 माइक्रोन) दर्ज करें।
  7. टूल बार में 'मुक्तहस्त कंटूर ड्राइंग "आइकन पर क्लिक करके दांतेदार गाइरस क्षेत्र अनुरेखण शुरू करो। दांतेदार बारीक सेल परत को रेखांकित करें। </ ली>
  8. "आवर्धन" मेनू से "100X" का चयन करें। खंड पर विसर्जन के तेल की एक बूंद जोड़ें और 100X के लिए उद्देश्य स्विच। इस उद्देश्य के तहत दांतेदार ग्रेन्युल सेल शरीर और dendrites का पता लगाएँ।
  9. एक चयनित न्यूरॉन पर ध्यान दें और उपकरण पट्टी पर "न्यूरॉन अनुरेखण" आइकन पर क्लिक करें। दांतेदार ग्रेन्युल सेल शरीर की परिधि ट्रेस। अनुरेखण समाप्त होने पर, सही "समाप्त सेल शरीर" का चयन करने के लिए क्लिक करें।
  10. एक्स, वाई, जेड और दिशाओं में मैन्युअल रूप डेन्ड्राइट अनुरेखण शुरू करें और जॉयस्टिक और जेड मोटर का उपयोग कर घुंडी प्रत्येक शाखा का पालन करें। एक विभाजन या तीन भागों में बांटने नोड पर, सही क्लिक पर लटकती मेनू से संबंधित विकल्प चुनें। इन नोड्स से उठता है कि शाखाओं में से प्रत्येक ट्रेस। प्रत्येक शाखा के अंत में ठीक क्लिक करें और लटकती मेनू से "समाप्त" का चयन करें।
  11. सॉफ्टवेयर विंडो में तीर कुंजी चिह्न का उपयोग बेतरतीब ढंग से एक और दांतेदार ग्रेन्युल सेल का चयन करें और Descr रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करेंकदम 3.9-3.10 में ibed। पूरे ट्रेसिंग बचाओ।
  12. न्यूरोनल ट्रेसिंग सॉफ्टवेयर शुरू करो।
  13. प्रायोगिक समूह की पहली माउस से पहले NRX डेटा फ़ाइल खोलें। प्रायोगिक समूह की दूसरी माउस का NRX फ़ाइल संलग्न करें। इस समूह से सभी NRX फ़ाइलों को संलग्न कर रहे हैं जब तक जारी रखें।
  14. विश्लेषण टैब के तहत, "प्रशंसक में-आरेख" का चयन करें। इस प्रशंसक इन-विश्लेषण खिड़की खोलता है। मार्क "डेन्ड्राइट" जाँच करें और चूहों के इस समूह (चित्रा 1) के लिए dendrites की लंबाई और शाखाओं में बंटी पैटर्न को दर्शाया गया है जो प्रदर्शन, क्लिक करें।

4. EDFI

नोट: इस विधि तेजी से हर क्षेत्र के Z अक्ष के माध्यम से चित्रों की एक बड़ी संख्या रिकॉर्ड और जेड अक्ष भर में सभी ध्यान केंद्रित पिक्सल में शामिल है कि एक 2 डी छवि उत्पन्न करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है। परिणाम एकत्र छवियों से सभी ध्यान केंद्रित पिक्सल में शामिल है कि एक समग्र छवि हो जाएगा।

  1. एक डिजिटल कैमरा के लिए माइक्रोस्कोप कनेक्टयुग। माइक्रोस्कोप से जुड़ा स्कैनिंग मंच पर पहली वर्गों प्लेस और फिर एक 10x उद्देश्य के लिए स्विच। रुचि के क्षेत्र के लिए मंच ले जाएँ।
  2. एक वीडियो कैप्चरिंग कार्यक्रम शुरू करो।
  3. रिकार्ड बटन दबाएँ। जैसे ही रिकॉर्ड बटन दबाया जाता है, के रूप में 4 सेकंड की कुल के लिए खंड के ऊपर से नीचे तक ले जाने के लिए मैक्रो-ध्यान घुंडी का उपयोग करें। परिणामस्वरूप वीडियो फ़ाइल सहेजें।
  4. फ़ाइल खोलने और असम्पीडित फ़ाइल प्रारूप में उन्हें बचाने के द्वारा एक असम्पीडित प्रारूप में AVI वीडियो फ़ाइलों को परिवर्तित करने के लिए ImageJ फ्रीवेयर का प्रयोग करें।
  5. एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम शुरू करने और AVI फ़ाइल को खोलने के। "प्रक्रिया" मेनू पर जाएँ और "क्षेत्र की विस्तारित गहराई" पर क्लिक करें। इसी वीडियो फ़ाइल का चयन करें। "उत्पादन" विकल्प में, "समग्र सर्वश्रेष्ठ फोकस छवि उत्पन्न" का चयन करें।
  6. "फोकस विश्लेषण" विकल्प में, "सामान्यीकृत रोशनी 'और' मैक्स स्थानीय कंट्रास्ट" विकल्प का चयन करें। फिर, "रचनात्मक चयन"खा लिया। परिणामस्वरूप छवि Z अक्ष भर में सभी ध्यान केंद्रित पिक्सल (चित्रा 2) का प्रतिनिधित्व करता है।
  7. परिणामस्वरूप छवि को बचाओ।

5. अत्यंत उच्च संकल्प छवियों सृजन

नोट: इस विधि उपयोगकर्ता स्वचालित रूप से एक automatized फैशन में कम बढ़ाई और उच्च बढ़ाई उच्च संकल्प छवियों से अत्यंत उच्च संकल्प छवियों उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है।

  1. माइक्रोस्कोप से जुड़ा स्कैनिंग मंच पर पहली वर्गों रखें। माइक्रोस्कोप एक डिजिटल कैमरे से जुड़ा है। रुचि के क्षेत्र के लिए मंच ले जाएँ।
  2. एक छवि अधिग्रहण कार्यक्रम शुरू करो।
  3. एक 10x उद्देश्य का प्रयोग करें और अधिग्रहण और कम से कम 10% ओवरलैप है सुनिश्चित करने के लिए ब्याज के क्षेत्र से उच्च संकल्प (एक्स 3116 4076) छवियों को बचा लो।
  4. भागो छवि समग्र संपादक छवियों सिलाई करने के लिए।
  5. फ़ाइल मेनू पर जाएँ, और "नई पैनोरमा" पर क्लिक करें। छवियों सेंट रहे हैं जिसमें फ़ोल्डर का चयन करेंored। एक ही क्षेत्र और प्रेस "ठीक है" के लिए संबंधित छवियों कि चयन करें।
  6. प्रेस "निर्यात डिस्क" बटन और छवि बचाने के लिए। इस छवि विश्लेषण और / या प्रदर्शन (चित्रा 3) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ब्याज के क्षेत्र की एक अत्यंत उच्च संकल्प तस्वीर का प्रतिनिधित्व करता है।

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Representative Results

मौजूदा और नए पैदा हुए दांतेदार ग्रेन्युल कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाली द्रुमायण की हद गोल्गी-कॉक्स या DCX धुंधला (चित्रा 1) का उपयोग या तो जंगली प्रकार चूहों में विश्लेषण किया गया था। DCX पॉजिटिव कोशिकाओं के वृक्ष के समान खंडों 13-36 माइक्रोन लंबे समय से होना पाया गया है। वृक्ष के समान लंबाई की सामान्य वितरण के Kolmogorov-स्मिर्नोव परीक्षण का उपयोग कर परीक्षण किया गया था (डी = 0.1217, पी <0.01, Liliefors पी <0.001; आंकड़े 4 और 5)।

द्रुमायण के आदेश के अनुसार खंडों की लंबाई के विश्लेषण में, सबसे लंबे समय तक खंडों द्रुमायण (38.38 + 1.45 माइक्रोन) के पहले के आदेश में पाए गए। इसी तरह के पैटर्न सतह (111.98 + 3.93 वर्ग माइक्रोन) और मात्रा (27.93 + 1.03 क्यूबिक मीटर) के लिए पाए गए। इन क्षेत्रों के कब्जे में खंडों की लंबाई और सतह क्षेत्र और / या मात्रा के बीच रैखिक संबंध भी परीक्षण किया गया। दोनों सतह (पी = 0.001, आर 2 = 0.873) और मात्रा (पी = 0.001, आर = 0.621 2) सीप्रत्येक वृक्ष के समान खंड की लंबाई के साथ काफी orrelated।

चित्र 1
चित्रा 1:। यहाँ फैन आरेख हिप्पोकैम्पस में दांतेदार ग्रेन्युल कोशिकाओं के वृक्ष के समान लंबाई का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था इस दृश्य उपकरण वृक्ष के समान लंबाई पर विभिन्न उपचारात्मक उपायों या जीनोटाइप के प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। माप की इकाई माइक्रोन है।

चित्र 2
चित्रा 2: (ए) के बिना वृक्ष के समान द्रुमायण के दृश्य और EDFI (बी) के तरीकों के साथ। सबसे अच्छा फोकस विमान को खोजने का पारंपरिक विधि EDFI के साथ तुलना में किया गया था (नहीं दिखाया डेटा) और EDFI विधि (पी = 0.02) का उपयोग वृक्ष के समान क्षेत्र की काफी उच्च मूल्यों पाया। पैमाने पर पट्टी= 100 माइक्रोन।

चित्र तीन
चित्रा 3:। एक माउस में हिप्पोकैम्पस क्षेत्र के एक उच्च संकल्प छवि यह अत्यंत उच्च संकल्प छवि स्वचालित रूप से 10 (4076 एक्स 3116) -pixel छवियों सिलाई से निर्माण किया है। नंगे = 100 माइक्रोन पैमाने।

चित्रा 4
चित्रा 4:। शाखाओं के विभिन्न आदेशों में डेन्ड्राइट के कब्जे में लंबाई और मात्रा की मात्रा का ठहराव अधिकतम लंबाई और मात्रा क्रम एक में प्राप्त किया गया।

चित्रा 5
चित्रा 5:। डी के वृक्ष के समान क्षेत्रों की दांतेदार ग्रेन्युल कोशिकाओं के वृक्ष के समान लंबाई के हिस्टोग्राम बहुमतCX-दाग डेन्ड्राइट लंबाई में 13-26 थे। लाल बिंदीदार रेखा प्रस्तुत आंकड़ों के सामान्य वितरण दर्शाया गया है।

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Discussion

इधर, दो तरीकों आरटीआई और EDFI के साथ संयोजन के रूप में पारंपरिक धुंधला तरीकों का उपयोग कर परिपक्व और नव जन्मे न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान द्रुमायण की हद तक यों को वर्णित किया गया। न्यूरॉन्स की उच्च संकल्प छवियों के अधिग्रहण के बदले में, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स लक्ष्य है कि चिकित्सीय रणनीतियों का आकलन करने के लिए एक साधन प्रदान करता है, neurodegenerative विकारों के हानिकारक प्रभावों के परीक्षण के लिए एक अत्यंत उपयोगी तरीका प्रदान करता है और।

आरटीआई विधि में गहराई से डेटा द्रुमायण और स्थलाकृति की हद से संबंधित कब्जा करने के लिए उपयोग किया गया था, वहीं EDFI विधि व्यक्तियों खंडों या पेड़ों की जटिलता से संबंधित जानकारी प्रदान करने के लिए विफल रहता है। फिर भी, EDFI विधि का लाभ यह महंगा हार्डवेयर की खरीद की आवश्यकता नहीं है और कम समय लगता है कि वास्तव में झूठ बोलते हैं।

एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम वीडियो फ़ाइलों में EDFI प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। उच्च संकल्प और तेजी से करने के लिए उपयोगकैमरों प्रत्येक क्षेत्र की मोटाई भर में छवियों की एक बड़ी संख्या के संग्रह की अनुमति देता है और सही मायने में एक्स, वाई, जेड और आयाम का प्रतिनिधित्व करते हैं कि छवियों को उत्पन्न करता है। EDFI विधि से एक दोष एक से अधिक पिक्सेल (एक ही एक्स और वाई) Z अक्ष भर में विभिन्न विमानों में ध्यान केंद्रित हो सकता है कि इस तथ्य से संबंधित है। एक विधि ठीक 2 डी छवियों में 3 डी प्रोफाइलों की हद तक का प्रतिनिधित्व करने के लिए इन पिक्सल के लिए अलग अलग रंग आवंटित करने के लिए कल्पना की है। यह EDFI विधि भी सेलुलर प्रोफाइल (जैसे, अन्तर्ग्रथन, microglia, और astrocytes) के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, इस विधि से एक धारा 7 की मोटाई भर microglial वितरण की हद तक का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ वर्णित दो तरीकों एक पूरक फैशन में इस्तेमाल किया जा सकता है। आरटीआई विधि पैटर्न शाखाओं की स्थलाकृति पर सटीक जानकारी प्रदान करता है, EDFI अमेरिका में के एक क्षेत्र में dendrites के घनत्व का आकलन करने के लिए एक नहीं बल्कि सरल और तेजी लाई विधि देता हैब्याज। विशेष रूप से, EDFI के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि वर्गों की मोटाई EDFI की सीमाओं माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के ऑप्टिकल ध्यान देने के साथ संयोजन में खुर्दबीन मंच पर Z ध्यान देने की सीमा के रूप में अत्यधिक चर हुक्म हैं।

इस के साथ साथ वर्णित विधि संभावित कई संदर्भों में तैनात किया जाना है। EDFI microglial सक्रियण 7 यों के लिए इस्तेमाल किया गया था, जबकि इस अध्ययन में हम, वृक्ष के समान द्रुमायण से पहले और बाद के हस्तक्षेप में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक साधन प्रदान की है। इस प्रकार, इस तकनीक का अंतिम लक्ष्य कई परतों में पाया जा सकता है कि छोटे प्रोफाइल में परिवर्तन का आकलन करने के लिए है, जिसमें किसी भी आवेदन करने के लिए उत्तरदायी है।

अंत में, इन तकनीकों का बहुत उच्च संकल्प और महंगे डिजिटल कैमरों के लिए उपयोग की कमी को दूर कर सकते हैं। संक्षेप में, एक विधि एक साथ अंत में, एक फ्रीवेयर का उपयोग कर yieldin एक नमूना भीतर स्थानों के विभिन्न बिंदुओं पर धारावाहिक छवियों पर कब्जा करने और फिर उन्हें सिलाई करने के तरीके पर दिखाया गया थाकहीं अधिक विश्वसनीय और शीघ्र पारंपरिक तरीकों की तुलना में है कि एक तरह से जी उच्च संकल्प छवियों।

महत्वपूर्ण कदम

गोल्गी धुंधला

शेयर गोल्गी की मात्रा और विकासशील समाधान धुंधला और ऊष्मायन प्रोटोकॉल समाधान कमरे के तापमान पर उपयोग किया जा करने की आवश्यकता है अभी तक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा है और कर रहे हैं। गोल्गी शीतलक और बर्फ पर या फ्रिज में समाधान के विकास पर प्रतिकूल वृक्ष के समान धुंधला की गुणवत्ता को प्रभावित करता है। इसके अलावा, यह है कि हम तेजी से विकसित गोल्गी समाधान इस्तेमाल किया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इस अध्ययन में इस्तेमाल गोल्गी-कॉक्स समाधान की सटीक संरचना स्वामित्व है, वहीं कई स्रोतों गोल्गी-कॉक्स 13 धुंधला प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विस्तार प्रोटोकॉल में उस सूची से कर रहे हैं। हालांकि, अन्य गोल्गी-समाधान का उपयोग काफी तदनुसार बनाया जाना चाहिए इन चरणों के लिए durations और संशोधनों धुंधला बदल जाएगा। इसके अलावा, हम साथ में अन्य लोगों के साथ हमें हैयह आम तौर पर इस मोटाई coronally और दांतेदार ग्रेन्युल सेल arborizations के समानांतर में के वर्गों को काटने के वृक्ष के समान शाखाओं को काटने के जोखिम को कम करता है कि सहमति व्यक्त की है के रूप में एड 150 माइक्रोन मोटी वर्गों क्लब न्यूरॉन्स 14,15 विश्लेषण करने के लिए।

DCX धुंधला

DCX धुंधला प्रोटोकॉल के तापमान को स्पष्ट ध्यान की आवश्यकता है। Preincubation अवधि के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस का हल करने के लिए गर्मी में विफलता काफी धुंधला ख़राब और वृक्ष के समान दृश्य का नुकसान होगा। इसके अलावा, खंड मोटाई की ओर ध्यान warranted है। इस अध्ययन में हम DGCs वृक्ष के समान द्रुमायण की अधिकतम सीमा पर कब्जा करने के लिए 70 माइक्रोन मोटी वर्गों का इस्तेमाल किया। यह काफी अस्थायी वर्गों की मोटाई भर में एंटीबॉडी के प्रवेश की सुविधा के रूप में हमारे अनुभव में, 0.3% ट्राइटन के उपयोग की आवश्यकता है। दरअसल, पूर्व के अध्ययन में 70 माइक्रोन मोटी 16 घुसना ट्राइटन का इस्तेमाल किया है या भी मोटा (120 माइक्रोन) 17वर्गों जब लेबल क्लब डेन्ड्राइट। DCX 18 धुंधला की पूरी जानकारी के लिए हुसैनी देखें।

अंत में, यह विकल्प खुला स्रोत कार्यक्रमों (जैसे flNeuronTool या Simple_Neurite_Tracer) एक्स, वाई, जेड और दिशाओं में मंच के आंदोलन को रिकॉर्ड करने की क्षमता के साथ मौजूद हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इस तरह के कार्यक्रमों के रूप में लंबे समय तक वे स्कैनिंग मंच के साथ संवाद करने में सक्षम हैं, के रूप में वृक्ष के समान पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

इस लेख के लिए प्रकाशन फीस बी एफ बायोसाइंस द्वारा प्रायोजित कर रहे हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified Golgi-cox staining solution  Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x) Weill Cornell Medical College NA store at 4°C till use
30% Sucrose, Sigma CAS # 57-50-1 make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin Sigma CAS # 9000-70-8 NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) Sigma CAS 603-003-00-5 NA
Xylene Sigma CAS # 1330-20-7 NA
DPX Medium EMS  #13510 NA
Superfrost (+) white Electron Microscopy Sciences 71869-10 NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) VWR  #4811-703 NA
DCX Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-8066 4 C
DAB Sigma CAS Number 91-95-2   -20
OCT Tissue-tek 4583 NA
Tris Sigma CAS Number 77-86-1   NA
ABC Lite Vector PK4000 NA
Microscope Nikon Eclipse 80i
Digital Camera Nikon DS-Ri1
12 bit Camera  QImaging  01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System MBF Bioscience V.10
Image Composite Editor Microsoft 1.4.4.0
NIS Elements Nikon F 3.0
Image Pro Plus Mediacy Versin 7.00

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References

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