배려의 아교 모세포종 표준의 맥락에서 입양 치료에 대한 자동차 T 세포의 생성

Immunology and Infection

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Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

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Abstract

Introduction

교 아세포종 (GBM)은 가장 흔한 원발성 뇌종양이며 늘 치명적이다. 치료 화학 요법과 방사선 치료의 비 특정 표준과 함께 수술 적 절제에는이 병 1 명 적은 15 개월 실력 예후 결과, 악성 세포를 제거 할 수 없습니다. 대조적으로, 면역 요법은 특히 종양 세포를 표적으로하는 정확한 방법을 제공하고, 이에 부수적 인 독성 2-4의 위험 감소와 매우 효과적인 치료 플랫폼 역할을 할 가능성이있다. T 세포 항원 수용체 키메라 (자동차), 종양 면역을위한 다용도 전략을 제공 표현을 생체 공학적. 자동차 복잡한 전장 주요 조직 적합성 대신, 하나 이상의 세포 내 T 세포 신호 전달 분자 (들)과 항체의 세포 외 가변 영역을 융합시킴으로써 생성된다 (MHC)는 T 세포 수용체 5 -restricted. 항체와 같은 항원 인식 및 시상식이 모드반응성 항원 - 특이 T 세포는 MHC 인식의 부재하에 종양 항원에 반응 사실상 무한 항원 레퍼토리를 위해 적응 될 수있는 데에 대해 허용.

종양 항원에 대해 다양한 설계 CAR의 T 세포 병원 6-9 전임상 효능과 우수한 가능성을 보여 주었다. 구체적으로는, GBM의 맥락에서, CAR T 세포 플랫폼 타겟팅 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII)는, 종양 특이적인 변이는 세포 표면 (10) 상에 표현 된 신경 교종 - 함유 마우스 (11)의 생존 기간을 연장시키는 것으로보고되었다. 그 다양성에도 불구하고, CAR 대체 요법의 임상 적 이점은 완전히 인해 종양 - 관련 면역 억제 및 면역 회피 12-16뿐만 아니라 생체 내 (in vivo)에서 확립하는 항원 - 특이 T 세포를 유지하는 문제에 대한 부분적으로 실현되지 않았다. 면역 요법으로 치료 (SOC)의 표준을 활용하여 잠재적으로 이러한 리터의 몇 가지 극복 할 수있다모방, 모두 전임상 및 임상 설정에서 강화 된 효능의 결과.

후 절제 GBM에 대한 SOC는 고용량 테모 졸로 마이드 (TMZ), DNA 알킬화제 (17), 및 뇌 전체 조사 (WBI)로 구성 1. 이러한 치료는 종양 MHC 발현 18 ~ 20의 상향 조절과 죽은 종양 세포 17,19,21,22에 의해 항원의 흘림을 통해 종양 백신과 시너지 효과로 추정된다. 실제로, 임상 설정에서 면역 기반 치료의 향상된 항 종양 효능에 TMZ 20,23 또는 WBI 18,24 리드의 추가. 또한, 많은 비 특정 세포 독성 화학 요법처럼, TMZ는 대체 요법 플랫폼 27 ~ 29에 대한 호스트 조절의 수단으로 활용할 수있는 전신 림프구의 (25), (26)을 유발하는 것으로 알려져있다. TMZ 매개 lymphodepletion는 ADOP 효능의 증가로 이어지는, 항원 특이 적 T 세포의 주파수 및 기능을 향상시키는 것으로 밝혀졌다두개 내 종양 (30)에 대하여적인 치료 플랫폼입니다. CAR 요법의 맥락에서 lymphodepletion 모두 그러므로 항 종양 활성 11,34 향상 내인성 억제 T 세포 (31)의 수를 줄이고, 사이토 카인 (33)에 대해 감소 된 경쟁을 통해 항상성 확산 (32)을 유도함으로써 호스트 컨디셔닝 수단을 구성한다. SOC의 맥락에서 새로운 입양 치료 및 백신 플랫폼을 평가하는 효능에 대한 의미있는 결론을 도출 중요하다, GBM의 SOC 및 면역 요법 플랫폼 간의 상승 작용을 감안할 때.

이 프로토콜에서는 EGFRvIII 양성 두개 내 종양 (처리 타임 라인에 대한도 1 참조) 마우스에서 TMZ 베어링과 함께 WBI 뮤린 EGFRvIII CAR에 특이 T 세포의 생성 및 정맥 내 투여를위한 방법을 설명합니다. 간략하게, CAR T 세포가 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 생체 외에서 이루어진다. 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포를 수확 및 병렬에서 배양되어 활성화 된 쥐의 비장 세포를 형질 도입하는 데 사용되는 바이러스를 생산하는 (CAR 벡터 및 PCL-에코 플라스미드를 포함) DNA / 지질 복합체를 이용하여 형질 전환된다. CAR 생성하는 과정에서 EGFRvIII 양성 두개 내 종양을 갖는 쥐의 호스트는 임상 SOC에 비해 용량으로 분류 된 전체 뇌의 X 선 조사 및 전신 TMZ 치료를 투여한다. CAR T 세포는 lymphodepleted 호스트로 정맥 내 전달된다.

다음 절차에 따라 7 개의 별개의 단계로 설명되어 담암, 담암 마우스의 (2) 전뇌 조사, 마우스, (3) 형질 감염 테모 졸로 마이드 (1) 관리, (4) 비장 절제술 및 T 세포의 제조, (5 종양 베어링 마우스에 (6) 자동차 T 세포 배양 및 수확하고, (7) 자동차 T 세포 관리) 형질 도입,. 이 단계 6-7 일에 걸쳐 동시에 수행되는 여러 단계로 구성되어 있습니다.

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Protocol

이 프로토콜은 쥐 10 10 7 CAR T 세포로 처리하여 각각의 실험 디자인에 기초한다. 이것은 108 CAR의 T 세포가 필요함을 의미한다; 수율은 생존의 손실을 계정에 5 × 10 7 -1 × 10 (8)에 의해 과대 평가되어야한다. 다음 프로토콜은 약 200 × 10 6 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 세포를 기존 KR158B 성상 세포종 또는 B16 흑색 종 세포주에서 개발 구일 설립 동계 EGFRvIII 양성 두개 내 종양 암컷 C57BL / 6 마​​우스에 정맥 내 투여한다. 부수적 CAR T 세포의 생성과, 담암 마우스 lymphodepletive TMZ 하였다 (60 mg / kg) 및 WBI (Gy를 16.5)의 임상 적 투여 량을 투여한다.

마우스는 유지 듀크 대학 의료 센터 (DUMC)에서 무균 조건에서 사육 하였다. 모든 동물 실험은 듀크 대학 기관에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다알 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC).

담암 마우스에 테모 졸로 마이드 1. 관리

일 0-4 :

  1. 마우스의 총 수가 분사되도록 계산하고 스필 (16.5 ml의 TMZ을 고려하여 (예를 들어, 30 마우스 X 0.5 ml의 = 15 ml의 TMZ) 필요한 TMZ 용액의 양을 결정하고,이 부피를 1.5 mL로 추가 0.5이 곱 ).
  2. 3 MG하여 총 부피를 곱 / ㎖ 필요 TMZ의 동결 건조 중량을 결정하기 위해서 (예 16.5 49.5 × 3 = MG TMZ). 50 ML 원뿔로이 무게.
    주의 : TMZ는 흡입, 섭취, 눈, 피부 접촉 및 점막에 의해 독성. 노출의 위험을 감소에 대한 권장 사항에 대한 기관의 산업 안전 및 / 또는 환경 보건과 복지 부서에 문의하십시오.
  3. 디메틸 설폭 시드의 양을 결정하기 위해 0.15 총 체적을 곱 (DMSO)는 (예를 들어, 16.5 X 필요0.15 = 2.475 ml의 DMSO). 필터 멸균 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 DMSO의 양이 (플러스 스필 오버를 고려하여 추가로 2 ml)에 살균. TMZ 분말에 멸균 DMSO의 2.475 ML을 추가합니다.
  4. 10 ~ 15 분 동안 65 ° C에서 뜨거운 접시 위에 물을 비이커에 TMZ / DMSO 솔루션을 놓습니다. TMZ가 완전히 용해되면, 용액의 색은 담황색하게한다; 용액이 분홍색이되면 그때 TMZ이 저하되고, 새로운 TMZ 용액의 신선한 많이 준비되어야한다.
  5. 총 부피 (0.85 X 16.5 ml의 = 14.025 ml의 생리 식염수)에 의해 0.85를 곱하여 필요한 멸균 식염수의 적절한 볼륨을 계산합니다. 50 ML 원뿔에 멸균 생리 식염수 15 ML을 추가합니다. TMZ는 DMSO, 65 ° C의 열 식염수에 용해된다.
  6. 소용돌이 TMZ / DMSO 솔루션은 TMZ 분말이 완전히 용해 천천히 TMZ / DMSO 용액에 따뜻하게 식염수를 추가되어 있는지 확인합니다.
  7. 즉시 준비 후, 완전히 15 X 1 ML의 투베르쿨린 syring를로드사일 설립 종양 베어링 생쥐에게 투여 TMZ 솔루션 말이지.
  8. 다섯 TMZ 행정의 총에서 4 일 1에서이 절차를 반복합니다.

종양 베어링 마우스 2. 뇌 전체 조사

일 2 ~ 4 :

  1. X 선 조사 장치 전원을 켜고 워밍업하는 전체 전압 수 있습니다. 적절한 필터가 장소와 입력 적절한 전압 및 전류 설정 (그림 2A)에 있는지 확인합니다.
    참고 : 조사부의 선량은 전압 설정 및 그리드 레이아웃 (그림 2A, B) 해당을 결정하기 위해 사전에 수립되어야한다.
  2. 5.5 Gy의 X 선 조사 될 필요가있는 시간을 계산한다. X 선 2 Gy의 / 분의 속도로 전달되는 경우, 예를 들어, 2.75 분 후, 5.5 Gy의 총을 제공하는 것이 필요하다. 입력 적절한 지속 시간.
    참고 : 표 2는 마우스 WBI는 도스 제공인간의 차 임상 등가물. 고급 교종의 맥락에서, 60 Gy를가 WBI (6 주 2 Gy의 분획 5 일 / 주) 분획 치료 임상 표준이며, 여기에 사용 된 뮤린 동등한 16.5 Gy를 (Gy의 X 3 5.5)이다.
  3. 2 ml의 케타민과 최종 솔루션은 10 ㎎ / ㎖ 케타민 1 ㎎ / ㎖ 자일 라진 (xylazine)가되도록 1 ml의 자일 라진 (xylazine) 17 ㎖에 식염수를 첨가하여 전신 마취에 대한 케타민 / 자일 라진 (xylazine)의 새로운 솔루션을 준비합니다.
  4. 마우스를 체중 동물은 100 ㎎ / ㎏ 및 10 ㎎ / kg 자일 라진으로 케타민 도즈를 수용하도록 체중 그램 당 복강 케타민 / 자일 라진 10 μL를 관리. 마우스는 완전히 진정과 눈에 띄게 케타민 / 자일 라진 관리의 2 분 이내에 호흡해야합니다.
  5. 진정제 동물 안과 수분을 유지하기 위해 각각의 눈에 부드럽게 인공 눈물 연고 소량 발라.
  6. 헤드들은 가장 높은 X 선을 수신하고 영역 내에 위치되도록 상기 그리드에 배치 진정제 생쥐긴장 (그림 2B, C). 아래로 적절하게와 목에서 방패 몸은 전신 X 선 전달 (그림 2D)를 차단하는 리드 튜브 크기.
  7. 그리드 레이아웃에 X 선 빔의 초점을 나타내는 레이저 좌표 (0,0)이되도록 X 선 빔 아래에 위치 쥐를 놓는다. X 레이 전달을 시작합니다.
  8. X 레이 배달이 완료되면, 따뜻한 가열 패드의 조사 장치 및 장소에서 동물을 제거합니다. 동물 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 의식이있는 동물과 진정 동물을 수용하지 마십시오. 동물, 흉골 드러 누움을 유지 다시 자신의 적절한 케이지에 민감한 동물을 배치 할 수 있습니다하면.
  9. 방사선의 세 가지 분류 된 용량의 총 일 3, 4에이 절차를 반복합니다.

3. 형질

일 -1 :

  1. 둘 베코 M 500 ㎖를 50 ㎖의 소 태아 혈청 (FBS)을 첨가하여 D10 매체를 준비odified 독수리 중간 (DMEM).
  2. 500 ml의 RPMI-1640 미디어에 5.5 ml의 L- 글루타민, 5.5 피루브산 나트륨, 5.5 ml의 비 필수 아미노산, 및 5.5 ml의 pencillin / 스트렙토 마이신 (PEN / 연쇄상 구균)을 첨가하여 T 세포 매체 (TCM)를 준비한다. 다음으로, 2- 머 캅토 에탄올 550 μL 겐타 마이신의 550 μl를 추가합니다. 마지막으로, 50 ㎖의 FBS를 추가합니다.
  3. 수확 체외 배양 된 세포 및 HEK293T은 D10 배지에서 7.5 × 106 세포 / ml의 농도로 가져온다.
  4. 플레이트 10 ㎖의 D10 매체 및 16 × 10cm 폴리 D 라이신 (PDL) 코팅 된 플레이트에 각각 HEK293T 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다.
  5. 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어.

일 0 :

  1. 세포를 형질 감염 전에 10 ml의 신선한 D10 최소 30 분으로 용지를 교체하십시오.
  2. (1) + (16 + 17 = 1)에 의해 판 14.1 μg의 총 수를 곱하여 형질 전환에 필요한 플라스미드 벡터의 양은, PCL-에코 벡터 및 리포좀 형질 감염 시약을 결정벡터 플라스미드 (14.1 X 17 = 239.7 μg의), 9.9 μg의 PCL-에코 벡터 (9.9 X 17 = 168.3 μg의), 60 μL 리포좀 형질 전환 시약 (60 X 17 = 1,020 μL). 모든 시약은 솔루션을 준비하기 전에 실온에 있어야합니다.
  3. 튜브에 두 튜브 A와 B 레이블 239.7 μg의 벡터 플라스미드 (1.5 × 17)에 168.3 μg의 PCL-에코 벡터를 추가 감소 혈청 독수리의 매체 (RS-MEM)를 수정 ML. 튜브 B에서 (1.5 × 17) ml의 RS-MEM에 1,020 μL 리포좀 형질 전환 시약을 추가합니다.
  4. 실온에서 5 분간 별도로 및 B 부화.
  5. (1-2 초 동안 소용돌이를 수회 반전)와 함께 부드럽게 B를 혼합하고, 지질 / DNA 복합체를 형성하기 위해 실온에서 20 분 동안 배양한다.
  6. 10cm 접시에 HEK293T 세포에 현명한 지질 / DNA 복합체 드롭을 추가합니다.
  7. 6 ~ 8 시간 동안 37 ° C에서 품어 또는 하룻​​밤 (24 시간을 초과하지 않음).
  8. 6-8 시간 배양 한 후, 바이러스 생산을위한 신선한 TCM 12 ml로 매체를 교체하십시오. 이 미디어를 도금T 세포 전달에 대한 바이러스 상등액으로 2 일에 사용될 것이다.

4. 비장 절제술 및 T 세포의 준비

일 0 :

  1. 비장 수집을위한 얼음에 50 ML 원뿔 제자리에 TCM 10 ㎖를 붓고.
  2. CO 2 질식 및 보조 잘린 동물의 적절한 수의 희생 : 찾는 동물 미국 수의학 협회 지침 (5 개 이하 동물 수 없다 당 10-30% 케이지 용적 / 분의 유속에서 CO 2 수신 케이지 호흡이 종료 될 때까지 그 후 2 분)을 동시에 희생. CO 2 챔버에서 동물을 제거하고 목을 벨.
    참고 : 약 4.5-5 × 10 7 비장 세포를 얻을 것입니다 6-12 주 된 여성 C57BL / 6 마우스의 비장 한. 여기, 4 비장는 약 200 × 10 6 세포를 수확한다.
  3. 오른쪽면이 위를 향하도록 마우스를 마련하고,70 % 에탄올로 스프레이. 집게로, 왼쪽 갈비뼈 아래에 피부의 얇은 배를 잡고 가위로 약간의 절개를 잘라. 껍질은 다시 피부는 조심스럽게 집게로 복막의 얇은 배를 잡아, 작은 구멍을 잘라.
  4. 비장은 평평 콩과 유사한 작은, 연장, 어두운 붉은 기관이다; 섬세 주변의 결합 조직을 멀리 절단 집게와 소비세와 비장을 잡아. 얼음에 TCM 10 ㎖를 포함하는 원추형으로 절제 비장를 놓습니다.
  5. 메쉬 70 μm의 셀 스트레이너 비장 위에 붓고, 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 5 ㎖ 주사기의 내부 무딘 단부들을 분해하여 당화. 두 비장의 최대 메쉬 스트레이너별로 세분화되어야한다.
  6. 주의 깊게 남아있는 비장 세포를 수집 세분화를 다음 여과기를 씻어 TCM의 작은 볼륨을 사용합니다. 단일 세포 현탁액 내로 모든 분해 된 비장을 풀. 하나의 세척을위한 TCM와 50ml로 최종 볼륨을 가져와10 분 동안 300 XG에 스핀 거라고.
  7. 5 ml의 10 배 용해 완충액 45 ㎖의 멸균 수를 첨가하여 용해 1X 버퍼 용액을 준비한다. 부드럽게 피펫 팅 아래로 잘 혼합 적혈구, 50 ML 원뿔의 비장 당 1 배 용해 버퍼 5 ㎖에 재현 탁 펠렛을 제거합니다. 5 비장를 초과하는 경우, 250 ml의 원심 분리기 튜브를 사용합니다. 5 분 37 ° C의 물을 욕조에 원추형 또는 원심 분리기 튜브를 놓습니다.
  8. 수조에서 용해 반응을 제거하고 1 TCM을 추가 반응을 중화 용해 버퍼와 1의 비율. 10 분 동안 300 XG에서 회전시켜 세척 할 것.
  9. 로 pipetting 아래로 TCM에서 기음 뜨는 완벽하게 재현 탁 펠렛 (2 ㎖ / 비장, 4 비장 8 ml의 총).
  10. 190 ㎕의 트리 판 블루 (1시 20분 희석)으로 세포 현탁액 10 μL를 첨가하여 세포를 카운트. 총 세포 수를 얻기 위해 20 X 10 X 4 전량 (8 ㎖)에 의해 리딩 된 네 개의 사각형 중 하나에서 얻은 수를 곱 (예를 들어, 셀 (125) × 20 × 104 6 비장 세포).
  11. 2 ㎍ / ml의 콘 카나 발린 A (ConA에) 및 50 IU / ml의 재조합 인간 인터루킨 -2 (rhIL-2)가 보충 된 TCM에서 2 × 106 세포 / ml의 농도로 세포를 희석. 따라서, 200 × 10 6 비장 세포에 대해, 8 ml의 세포, 200 μg의 ConA에, 5,000 IU rhIL-2 92 ml의 미디어를 추가 할 수 있습니다.
  12. 4 × 106 세포를 각 웰이되도록 24 웰 조직 배양 처리 된 플레이트의 각 웰에 2 ㎖의 세포를 추가 (예를 들면, 셀은 약 100 ㎖ (4) 판을 필요로한다).
  13. 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어.

5. 형질 도입

1 일 :

  1. 비 - 조직 배양의 수는 (2)에 의해 수확 된 비장의 수 (8 판이 4 비장에 필요한) 곱하여 전달에 필요한 24- 웰 플레이트를 계산하는 처리.
  2. 다음에, 재조합 인간 피브로넥틴 프래그먼트 (RHFF) 용액의 필요한 부피를 계산곱하여 코트 판에 필요한 (우물의 총 수 + 3) 0.5 ml의 X (8 판을 X 24 우물 = 192 + 3 = 195) 0.5 ml의 = 97.5 ml의 X.
  3. 25 μg의 (= 97.5 × 25 μg의 2437.5)에 의해 총 부피를 곱하여 25 ㎍ / ml의 농도로 함유 RHFF 97.5 ml의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. 97.5 ml의 PBS에 RHFF이 금액을 추가합니다.
  4. 코트 비 - 조직 배양은 웰 당 0.5 ml의 PBS / RHFF 용액을 첨가하여 24- 웰 플레이트를 처리 하였다.
  5. 4 ℃에서 밤새 품어.

제 2 일 :

  1. 비 조직 배양에서 PBS / RHFF 솔루션을 덤프 24 웰 플레이트를 처리 하였다.
  2. PBS로 1 ㎖ / 웰 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)를 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 배양한다.
  3. 단단히 판을 upending에 의해 BSA를 제거합니다. 2 ml의 PBS를 추가하여 씻으십시오.
  4. 250 ml의 원심 분리기 튜브에 각 HEK293T PDL 판에서 미디어를 전송하여 바이러스 상층 액을 수집하고 500 x g에서 10 분 스핀.
  5. 조심스럽게 바이러스 SU를 전송확실히 형성 할 수있는 세포 펠렛을 방해하지되고, 신선한 250 ml의 원심 분리기 튜브에 pernatant.
  6. 최종 볼륨이 RHFF 코팅 우물에 필요한 양보다 3 ㎖ 이상이되도록 바이러스 상층 액에 신선한 TCM을 추가합니다. 예를 들어, 192 RHFF 코팅 우물 192 + 3 = 195 ㎖를 가하여 바이러스 상청액의 부피를 가져온다.
  7. 각 3 회에서 잘 - 부드럽게 피펫 아래 (2)에 의해 보육과에 resuspend에서 배양 된 비장 세포를 제거합니다. 250 ML 원뿔로 전송합니다. 이 단계를 신속하게 도움이 될 것입니다 전송하기 전에 멸균 용기를 사용하여 멀티 채널 피펫을 사용하는 경우. 앞서 10 분 동안 300 XG에 설명 스핀을 계산합니다.
  8. rhIL-2를 추가 바이러스 상등액 50 IU / ㎖의 농도로. 예를 들어, 추가 50 X 195 = 9,750 IU 바이러스 상층 액의 195 ML-2 rhIL.
  9. 1 × 106 세포 / ml의 바이러스 상등액에서 비장 세포를 재현 탁
  10. RHFF 코팅 된 24 웰 플레이트에 / 잘 비장 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다.
  11. 다음 설정에 따라 90 분 동안 스핀 : 770 XG, 가속도 = 4, 브레이크 / 감속 = 0, 32 ° C.
  12. 50 IU / ml의 rhIL-2와 TCM 솔루션을 준비합니다. 예를 들어, 10,000 IU rhIL-2를 첨가하여 200 TCM 용액을 조제. 원심 분리 후 각 웰에 rhIL-2 / TCM의 1 ML을 추가합니다.
  13. 5 % CO 2 37 ° C에서 하룻밤 문화.

6. CAR T 세포 배양 및 수확

3 일 및 4 :

  1. T 세포는> 80 %를 달성 합류하면, 세포 (이것은 일반적으로 제 3 일 또는 4 일에 의해 발생) 분할 될 수있다. 세포 분열, 부드럽게 피펫과 각 웰 2 ~ 3 회에서 아래로, 그리고 신선한 24 잘 조직 문화 처리 플레이트의 새로운 우물에 각 우물에서 1 mL로 이동합니다. 그런 다음, 최종 부피가 모든 웰에 2 ml의 것을 각 웰 등 50 IU / ㎖의 IL-2와 신선한 TCM 1 ㎖를 추가합니다.
  2. 세포는> 80 % 합류점에 도달하지 않으면 서서히 각각의 상부로부터 용지 1 ㎖를 피펫 팅하여 잘 절반 미디어 변경을 수행한다. D 피미디어를 제거하는 동안 바닥에 정착 세포를 isturbing. rhIL-2 ml의 50 IU /를 포함 신선한 TCM의 1 ML을 추가합니다.

제 5 일 :

  1. 250 ML의 원심 분리 관에 재현 탁 CAR T의 부드럽게 피펫 팅하여 세포와 잘 각각 아래로 3 회 및 전송. 10 분 동안 300 XG에서 세포를 스핀.
  2. 펠렛을 방해하지 않고 완전히 흡인 상층 액. 두 번째로 전술 한 바와 같이 세포를 계산하고, PBS로 세척, PBS로 한번 세척 할 것. 전형적인 CAR의 T 세포 수율은 웰 당 약 1 × 106 세포 (8 X 24 웰 플레이트 = 192 × 106 CAR의 T 세포)이다.
  3. 200 μg의 부피에 1 × 107의 주입을위한 5 × 107 / ㎖의 농도로 PBS에 재현 탁 된 세포 (예를 들면, 192 × 106 CAR의 T 세포에 대해, 재현 탁 3.84 ml의 PBS로 펠렛을 세척 하였다).

담암 마우스 7. CAR T 세포 관리

제 5 일 :

  1. 견인정맥 주사에​​ 대한 동물 시설에 얼음 RT 세포. 로드 (27)와 인슐린 주사기에 500 ~ 1,000 μL - 모든 거품이 추방되는 것을 보장 31 G 바늘.
  2. 꼬리의 기지에 마우스를 잡고 튜브 제한 수단에 배치합니다.
  3. 정맥이 위를 향하도록 팽팽 꼬리를 당기고는 꼬리 정맥에 평행 한 삽입하여 정맥에 바늘을 피부 아래 약 1-2mm 활공. 천천히 정맥에 200 μl를 추방. 바늘이 정확 정맥 내로 삽입되는 경우, 부피가 쉽게 유입 될 것이다; 그렇지 않으면 저항이되며 바늘 테일에서 제거하고 올바르게 다시 삽입해야한다.

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Representative Results

CAR T 세포 EGFRvIII CAR의 레트로 바이러스 벡터와 함께 형질 도입 (11)에 의해 생성된다. 이 벡터, MSGV1는 쥐의 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 긴 터미널 반복, 확장 개그 지역 및 봉투 스플 라이스 사이트가 포함 된 SFGtcLuc_ITE4 벡터 (35)에서 개발 (스플 라이스 기증자, SD, 그리고 수용체 스플 라이스, SA), 바이러스 성되었다 포장 신호 (ψ). 쥐 CD8TM와 탠덤에서 인간의 안티 EGFRvIII 단일 체인 변수 단편 (scFv를) 139를 포함 EGFRvIII 자동차, CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 세포 내 영역이, 하류 레트로 바이러스 벡터 NcoI 부위에 클로닝 하였다 (그림 3) .

형질 도입 후, CAR T 세포는 정량화 될 수 있으며, 유세포 phenotyped. EGFRvIII CAR T 세포 (SA / PE) 스트렙 타비 딘 - 피코 에리 트린 구성된 2 색 패널 가시화 될 수 EGFRvIII 유래 합체 및 항 CD3 FITC를 biotynlated 컨쥬 게이트. 문화와 전달 제자를 사용하여ocols는 우리가 일상적으로 쥐의 비장 세포 (그림 4A) 11 55~70% 중 CAR의 발현을 관찰, 여기에 설명. 또한, 자동차도 염소 항 - 인간 F (AB ')를 사용하여 표현 염색 할 수있다 주 2 비오틴과 SA / PE 차 항체는 이전에 (36)을 설명했다. CAR의 T 세포는 또한 2 색 CAR 패널 다른 형광 표지 된 항체의 첨가에 의해 phenotyped 수있다. 예를 들어, CD4 및 CD8에 대한 염색은 CD4 + T 세포 (도 4b)이다하면서 20 %의 형질 도입 된 CARS 70 %, CD8 + T 세포임을 나타낸다. 이 발현 프로파일 CAR의 T 세포는 용이 뇌 트래픽 및 두개 내 종양을 치료하는 것으로 나타났다.

표 1. 동물의 중량에 기초하여 테모 졸로 마이드의 테모 졸로 마이드 투여 량을 60 ㎎ / kg의 총 투여 량에 기초하여 산출 하였다.

체중 체적
25g 0.50 ml의
0.48 ml의
23g 0.46 ml의
22g 0.44 ml의
21g 0.42 ml의
20g 0.40 ml의
19g 0.38 ml의
18g 0.36 ml의
17g 0.34 ml의
16g 0.32 ml의
15g 0.30 ml의
14g 0.28 ml의
13g 0.26 ml의
12g 0.24 ml의
11g 0.22 ml의
# 분획 침대 SOC
16.5 5.5 3 (62) GBM
(14) 7 (63) GBM
(20) 4 (5) (60) GBM
(12) (6) (48) LGA
(16) 4 4 (48) LGA
(21) 3 7 52.5 LGA
(12) 3 4 (30) 만난
(16) 8 (32) 만난

표 2 :. 임상 적으로 생물학적으로 동등한 방사선 량 방사선 량은 침대에 따라 계산 된 = D [1 + D / (α / β)], 여기서 D = 총 투여 량, D = 분별 용량, 및 α / β = 2). 뮤린 호스트 WBI로서 투여 일 총 투여 량의 측면에서 도시전자 전달 분수 투여하고 그 선량 분수에 의해 모델링 된 인간의 복용량. 모델을 위해 BED가주의 기준 수있는 악성 종양은 또한 도시된다.

그림 1
그림 1 :. 종양 베어링 마우스의 치료 및 치료 화학 요법의 동시 생체 CAR 생성 표준 및 뇌 전체 조사에 대한 타임 라인 4 일 종양 주입 (A) 한 후 시작합니다. 이 기간 동안, CAR T 세포 생성 및 생체 외 배양 (B)을 컨디셔닝하고 호스트의 전체 과정 후에 전달된다.

그림 2
그림 2 : 레이아웃 및 방사선 전달을위한 설정.X 선은 원하는 용량 (A)에 따라 선택 변수 지속 시간, 320 kV의 10 mA의 선량에 따라 제공됩니다. X 레이 방사선의 초점 필드는 좁은 2.5 cm 영역입니다. (C)는 X 선 빔의 일단으로부터도; 진정 동물을 머리가 높은 X 선 강도의 영역에 놓여 지도록 그리드 (B)에 따라 배열된다. 약 4 동물이 그리드 레이아웃 (B, D)에 따라 X-Ray 관리의 한 과정 조사부에서 할 수있다. 리드 튜브는 WBI (D)에 대한 노출 만 머리를 떠나, 몸을 보호하는 데 사용됩니다.

그림 3
도 3 : 변형 SFGtcLuc_ITE4의 레트로 바이러스 벡터, MSGV1은 CAR의 T 세포의 형질 도입 및 생성을 위해 사용되었다.쥐 CD8TM, CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 세포 내 지역과 연계하여 인간의 안티 EGFRvIII 단일 체인 변수 단편 (scFv를) 139를 포함 EGFRvIII 자동차 인서트, LTR (쥐의 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 긴 터미널 반복에 의해 측면에 선다 ). CAR 인서트의 상류 개그 확장 영역 및 봉투 클로우 사이트이다 (스플 라이스 도너, SD, 및 수용체 스플 라이스, SA), 및 바이러스 성 포장 신호 (ψ).

그림 4
도 4 :. EGFRvIII 차가 T 세포의 표면에 발현되는 형질 다음 48 시간이 T 세포 LEEKKGNYVVTDHC-K (비오틴) -NH 2 / 스트렙 타비 딘 - PE 이루어지는 합체를 사용 EGFRvIII 자동차의 표면 발현에 대해 염색 하였다. 동일한 기증자로부터 Untransduced T 세포는 음성 대조군으로 염색 하였다. 데이터는 STA에 대한 긍정적 인 CAR의 T 세포 (Y 축)의 수를 나타낸다60.9 %는 식 (A) 인 것으로 밝혀졌다 T 세포 마커로서 CD3 + 세포 상에 게이팅 PE 공역 EGFRvIII 합체 (X 축)에 의해 ining. 를 PerCP-CD4-CD8-Cy5.5 및 APC 스테인드 CAR의 T 세포는 21.7 %와 70.9 %, 각각 (B)의 발현 양상을 보여준다.

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Discussion

여기에 설명 된 처리 타임 라인은 치료의 임상 표준 모델 및 차량 대체 요법에 대한 효과를 활용하도록 설계되었습니다. CAR T 세포의 투여 량, TMZ 요법 및 방사선 요법 투여는 생체 내에서 T 세포 활성, lymphodepletion, 및 종양 사멸에 강화하도록 변형 될 수있다. TMZ 섭생 호스트 myeloablation 적응 적 전송 및 셀 (30)의 증가 된 팽창을 수득 증가 될 수있다. 따라서 SOC의 암세포 살상 특성을 우회, - (6 Gy를 4) 단일 분수 전신 방사선 조사 (TBI) 또한, TMZ의 lymphodepletive 효과는 저용량에 의해 효과적으로 요약 할 수있다. 여기에 도포 된 방사선 요법의 60 Gy의 생물학적 등가 용량을 모방; 그러나, 분획 및 소수 투여 량의 수는 다른 임상 투여 (표 2)을 모방하기 위해 조정될 수있다. 중요한 것은,이 모델의 SOC는 외부 빔 방사선 종양 및 MA에 국소 적으로 전달하기보다는 WBI의 생물학적 등가 용량을 이용한다rgins는 종종로는 병원에서 이용되고, 따라서 종양에 전달 된 방사선의보다 적은 투여 량 및 건강한 마우스 뇌 독성의 위험을 초래할 수있다. 이러한 한계에도 불구하고, WBI는 임상 설정에서 임상 적 방사선 치료를 모델링 승인 된 기술이다.

CAR T 세포의 투여 량은 증가 또는 종양 사멸 및 생존율 선량 (11)상의 영향을 관찰하기 위해 감소 될 수있다. 또한, 처리 및 전달 경로의 타이밍은 효능의 차이를보기 위해 변형 될 수있다. 예를 들어, CAR T 세포를 종양 부위에서 활성을 보장하기 두개골 내에 전달 될 수있다. CAR 양성 T 세포의 수율은 형질 도입의 효율에 따라 달라질 수있다. 성공적인 전달을 보장하는 하나의 방법은 절차 내내 녹색 형광 단백질 (GFP) ▪ 제어를 수행하는 것이다. 이를 위해, 하나 HEK293T 10cm의 PDL 판 애추하는 T 세포의 단일 웰의 GFP 형질 전환 및 형질 도입에 할당 될 수있다일 3-5 GFP에 대한 명. 형질 도입 효율의 핵심 요소는 바이러스 상등액을 첨가 할 때의 T 세포 활성화 및 증식의 범위이다. 우리는 배양 배지에 ConA에 첨가함으로써 달성된다 T 세포 활성화, 우리의 방법 사이의 중요한 차이를 기록하고 있다고는 CD3 및 CD28 아고 니스트 단일 클론 항체에 의해 달성 임상에서 사용. 후자는 통상적으로 환자의 형질 도입 레트로 바이러스 CAR의 T 세포를 생성하는데 사용되며, 또한, 쥐 T 세포의 형질 도입에 성공 하였지만, 우리는 이전 ConA에 자극이보다 우수하고 일관된 transductions 37 것으로 판정되었다. 또한 전체적인 CAR T 세포 수율 5.18 스텝이 수행되는 경우에 따라 달라질 수 있다는 것을 발견했다. 당신이 가난한 CAR T 세포 수율가 발생하는 경우, 우리는 즉시 단계 5.17 대신에 5 ~ 6 시​​간 배양 대기 후 단계 5.18을 수행하는 것이 좋습니다. 이 형질 도입의 효율에 영향을 미칠 수 있지만, 우리는 상당한 DIF 관찰되지 않은우리의 연구에서 자동차 표면 발현에 ferences.

형질 도입 후, CAR의 T 세포는 정량화 될 수 있으며, 유동 세포 계측법에 의해 phenotyped; 우리는 (SA / PE) 스트렙 타비 딘 - 피코 에리 트린 구성된 2 색 패널 우리 EGFRvIII CAR T 세포를 염색 EGFRvIII 유래 합체 및 항 CD3을 biotynlated 공역. 또한, 자동차도 염소 항 - 인간 F (AB ')를 사용하여 표현 염색 할 수있다 주 2 비오틴과 SA / PE 차 항체는 이전에 (36)을 설명했다. 우리는 일상적으로 쥐의 비장 세포 (11)의 55-70% 중 CAR의 발현을 관찰합니다. 우리는 이전에 쉽게 뇌에 트래픽과 종양을 치료할 수이 자동차 발현 양상과 T 세포의 전달을 보여 주었다. TMZ- 또는 TBI 유도 림프구는 CAR 양성 세포의 빈도 및 전반적인 항 종양 반응을 증가 적응 적 전송 세포의 클로 날 팽창을 향상시킨다. CAR의 T 세포는 말초 혈액을 염색하여 생체 내에서 추적 될 수있다ppropriate 사량; 이것은 시간 및 CAR의 T 세포 기능 및 지속성에 호스트 컨디셔닝 효과 위에 CAR T 세포 생존을 이해하는데 유용한 기술이다. 더 사량은 항원 수용체에 대해 사용할 수없는 경우 또는, 형광 기자는 차 벡터 구조에 포함 할 수있는, 또는 자동차 T 세포를 표시 할 수 생체 카복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 생체 내 추적 관리하기 전에.

종양 모델, 면역 요법 플랫폼 및 SOC 처방에 따라 입양 치료 또는 백신과 함께 투여 임상 SOC는 독성이 발생할 수 있습니다. TMZ 비특이적 세포 사멸에 이르게 DNA 알킬화제이고, 투여 량은 뮤린 호스트 체중 감소 및 이환율을 초래할 수 심화. 고용량 및 WBI의 연장 분획 뇌수종이 발생할 수 있습니다. 또한, 강력한 백신 및 / 또는 적응 적 전송 T 세포 반응에서 염증 효과로 인한 병적으로 이어질 수독성 사이토 카인 폭풍. 그것은 병적 인 동물에 전신 마취의 효과를 주목하는 것이 중요하다. TMZ 및 WBI는 상당한 부작용을 초래할 경우 동물 만 마취하고 작은 방사선 량의 전달을 위해 10 분 동안 고정 될 필요로하고 케타민 / 자일 라진 투여 량 2- (사망률의 위험을 감소 20-25 % 감소 될 수있다 8 Gy를).

호스트 조절 입양 전송을 포함하는 모든 면역 요법 플랫폼에 대한 중요합니다. 면역 요법의 임상 시험은 종종 SOC의 컨텍스트 내에서 평가되기 때문에, 면역 요법의 임상 평가는 임상 시나리오를 요점을 되풀이이 설정 범위 내에서 실시 할 필요가 있습니다. 여기서는 lymphodepletive 및 CAR의 T 세포를 이용한 대체 요법 SOC 암세포 살상 효과를 활용의 한 예를 제시한다. 이 요법은 조합 된 SOC의 효과를 평가하기 위해 다른 면역 플랫폼에 적용 할 수있는 강력한 도구이다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

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