דור של תאי T CAR למאמצת תרפיה בהקשר של גליובלסטומה טיפול סטנדרטי

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

גליובלסטומה (GBM) היא הגידול במוח הנפוץ ביותר הראשוני הממאיר והוא תמיד קטלני. כריתה כירורגית בשילוב עם כימותרפיה סטנדרטית של טיפול והקרנות שאינם ספציפי לא מצליחה לחסל לחלוטין תאים ממאירים, וכתוצאה מכך הפרוגנוזה עגומה של פחות מ -15 חודשים בחולים עם מחלה זו 1. בניגוד לכך, טיפול חיסוני מציע גישה מדויקת לאופן ספציפי מיקוד תאים סרטניים, ובכך יש לו הפוטנציאל לשמש פלטפורמת טיפול יעילה ביותר עם ​​סיכון מופחת של רעילות בטחונות 2-4. תאי T מהונדסים vivo לשעבר להביע קולטנים אנטיגן chimeric (מכוניות) מציעים אסטרטגיה רב-תכליתית לטיפול חיסוני גידול. מכוניות שנוצרו על ידי פיוזינג האזור משתנה תאי של נוגדן עם מולקולת תא T תאית אחד או יותר איתות (s), במקום histocompatibility הגדול באורך מלא מורכב (MHC) -restricted קולט תא T 5. מצב זה של פרסים והכרה אנטיגן כמו-נוגדןבמאפשר לתאי T אנטיגן הספציפי לתגובתי לזהות ולהגיב לאנטיגנים סרטניים בהעדר MHC ויכולים להיות מותאמים לרפרטואר אנטיגן כמעט אינסופי.

תאי T CAR המהונדסים נגד מגוון רחב של אנטיגנים סרטניים הראו יעילות קלינית ופרה הבטחה מצטיינת במרפאת 6-9. באופן ספציפי, בהקשר של GBM, גרסת CAR פלטפורמת תא T מיקוד צמיחת אפידרמיס קולטן גורם III (EGFRvIII), מוטציה גידול ספציפי הביעה על פני תא 10, הוצג להארכת הישרדות בעכברי נושאי גליומה 11. למרות צדדיות שלהם, לעומת זאת, התועלת הקלינית של טיפול המאמץ CAR לא התממשה במלואו, נובע בחלקו הדיכוי החיסוני גידולים הקשורים והעלמת חיסונית 12-16, כמו גם אתגרים בהקמה ואחזקת תאי T אנטיגן הספציפי in vivo. מינוף הטיפול סטנדרטי (SOC) עם טיפול חיסוני עלולה להתגבר כמה מאלה lחיקויים, וכתוצאה מכך היעילות משופרת בשתי ההגדרה פרה-קלינית וקלינית.

SOC להודעה כריתה-GBM מורכב מtemozolomide במינון גבוה (TMZ), סוכן אלקילציה DNA 17, והקרנת המוח כולו (WBI) 1. טיפולים אלה בחזקתו יתמזגו עם חיסוני גידול באמצעות גברת ביטוי של גידול ביטוי MHC 18-20 ושפיכת אנטיגנים על ידי תאים סרטניים מתים 17,19,21,22. ואכן, התוספת של TMZ 20,23 או WBI 18,24 מוביל ליעילות אנטי-סרטנית משופרת של טיפולים מבוססי חיסון בהגדרה פרה-קלינית. יתר על כן, כמו רבים chemotherapeutics ציטוטוקסיות שאינו ספציפי, TMZ ידוע כגורם 25,26 lymphopenia מערכתי, שניתן למנף כאמצעי למארח-אוויר לפלטפורמות טיפול מאמצים 27-29. lymphodepletion תיווך TMZ הוכח כדי לשפר את התדירות ואת התפקוד של תאי T אנטיגן ספציפי, שמוביל ליעילות מוגברת של adopפלטפורמת טיפול מופרזת נגד גידולים תוך-גולגולתי 30. בהקשר של טיפול CAR, lymphodepletion משמש כאמצעי למארח-אוויר על ידי שני צמצום מספר מדכא אנדוגני תאי T 31, וגרימת תרבות הומיאוסטטית 32 באמצעות הפחתת תחרות לציטוקינים 33, וכך לשפר את הפעילות אנטי-סרטני 11,34. בהתחשב ביחסים סינרגטיים בין פלטפורמות SOC ואימונותרפיה GBM, הערכת טיפולים מאמצים רומן ופלטפורמות חיסון בהקשר של SOC היא קריטית להסקת מסקנות משמעותיות לגבי יעילות.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לדור והעירוי לוריד של תאי T CAR העכבריים EGFRvIII הספציפי לצד TMZ וWBI בעכברי נושאי גידולים תוך-גולגולתי EGFRvIII-חיובי (ראה תרשים 1 לציר זמן טיפול). בקצרה, תאי T CAR נעשים לשעבר vivo על ידי התמרה retroviral. כליה עוברית אנושית (HEK) 293T תאים transfected באמצעות מורכב DNA / שומנים בדם (המכיל את וקטור CAR ופלסמידים PCL-Eco) לייצר וירוס, אשר לאחר מכן נעשה שימוש כדי transduce splenocytes העכברי הופעל שנקצרים ותרבותי במקביל. במהלך דור CAR, מארחים עכבריים נושאות גידולים תוך-גולגולתי EGFRvIII חיובית מנוהלים הקרנה מופרד המוח כולו רנטגן וטיפול TMZ מערכתי במינונים דומים לSOC הקליני. לאחר מכן תאי T CAR מועברים דרך הווריד למארחי lymphodepleted.

ההליך הבא מתואר בשבעה שלבים נפרדים: (1) מנהל של temozolomide לעכברים, (2) הקרנת המוח כולו של עכברים נושאי גידול, נושאי גידול (3) Transfection, (4) כריתת טחול ותא T הכנה, (5 ) התמרה, (6) תרבות תא T CAR וקציר, ו( 7) ממשל תא T CAR לעכברי נושאי גידול. שלבים אלה מורכבים מכמה שלבים שמשתרעים על פני 6-7 ימים ומבוצעים במקביל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה מבוסס על עיצוב ניסיוני שבו מטופלים 10 עכברים עם 10 תאי T 7 CAR כל אחד. משמעות דבר היא כי יהיו צורך 10 8 תאי T CAR; התשואה צריכה להפריז בשיעור של 5 x 10 x 10 7 -1 8 לחשבון להפסד בכדאיות. הפרוטוקול הבא ישתנה לייצר כ 200 x 10 6 תאים. אז התאים בהזרקה לוריד לC57BL / 6 נקבות עכברים עם גידולי 9 יום הוקמו syngeneic EGFRvIII החיובי תוך גולגולתי, שפותחו משורות תאים מלנומה אסטרוציטומה KR158B או B16 הקיימים. בד בבד עם דור תא CAR T, עכברי נושאי גידול מנוהלים מינונים רלוונטיים קליני של TMZ lymphodepletive (60 מ"ג / קילוגרם) וWBI (16.5 Gy).

עכברים נשמרו וגדלו בתנאי הפתוגן ללא במרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק (DUMC). כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי דוכס מוסד האוניברסיטהאל טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC).

1. מנהל של temozolomide לעכברי נושאי גידול

ימים 0 עד 4:

  1. לחשב את המספר הכולל של עכברים להיות מוזרק ולהכפיל את זה ב -0.5 כדי לקבוע את עוצמת הקול של פתרון TMZ הדרוש (לדוגמא, 30 עכברים x 0.5 מיליליטר = 15 מיליליטר TMZ) ולהוסיף 1.5 מיליליטר לכרך זה כדי להסביר את גלישה (16.5 מיליליטר TMZ ).
  2. להכפיל נפח כולל זה על ידי 3 מ"ג / מיליליטר כדי לקבוע את המשקל של TMZ lyophilized הדרוש (לדוגמא, 16.5 x 3 = 49.5 מ"ג TMZ). לשקול את זה בחרוטים 50 מיליליטר.
    זהירות: TMZ הוא רעיל על ידי שאיפה, בליעה, ומגע עם עיניים, עור, וקרומים ריריים. התייעץ עם הבטיחות של המוסד בעיסוק ו / או סביבתי ובריאותית מחלקת בריאות להמלצות להפחתת סיכון של חשיפה.
  3. להכפיל את הנפח הכולל של 0.15 כדי לקבוע את עוצמת הקול של sulfoxide דימתיל (DMSO) דרוש (לדוגמא, 16.5 x0.15 = 2.475 מיליליטר DMSO). סנן לעקר כרך זה של DMSO (בתוספת 2 מיליליטר נוסף לחשבון עבור גלישה) דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי. הוספת 2.475 מ"ל של DMSO סטרילי לאבקת TMZ.
  4. מניחים את פתרון TMZ / DMSO בכוס של מים על צלחת חמה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. ברגע שTMZ נמס לגמרי, הפתרון צריך להיות בצבע צהוב בהיר בצבע; אם הפתרון הופך ורוד, אז TMZ נפגע, ופתרון חדש צריך להיות מוכן עם הרבה טרי של TMZ.
  5. חשב את הנפח המתאים של תמיסת מלח סטרילית צורך על ידי הכפלת 0.85 על ידי הנפח הכולל (0.85 x 16.5 מיליליטר = 14.025 מיליליטר מלוח). הוסף 15 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית לחרוטי 50 מיליליטר. בעוד TMZ מתמוסס בDMSO, מלוח חום עד 65 מעלות צלזיוס.
  6. וורטקס הפתרון / DMSO TMZ על מנת להבטיח כי אבקת TMZ נמס לגמרי ולאט לאט מוסיפה מלח מחומם לפתרון / DMSO TMZ.
  7. מייד לאחר הכנה, לטעון syring טוברקולין 15 x 1 מיליליטר באופן מלאes עם פתרון TMZ לממשל לעכברי גידול נושאות הוקמו 4 ימים.
  8. חזור על תהליך זה בימים 1 עד 4 עבור הסכום כולל של חמישה ממשלים TMZ.

2. מוח כל הקרנה של עכברים נושאי גידול

ימים 2 עד 4:

  1. כוח על irradiator רנטגן ולאפשר לו להתחמם-עד מתח מלא. ודא שהמסנן המתאים נמצא במקום וקלט המתח הנכון והגדרות הנוכחיות (איור 2 א).
    הערה: dosimetry של irradiator יש לקבוע מראש כדי לקבוע את הגדרות מתח ופריסת רשת (איור 2 א, ב ') המתאים.
  2. חשב את משך זמן שנדרש כדי לגרום 5.5 קרינת רנטגן Gy. לדוגמא, אם צילומי רנטגן מועברים בשיעור של 2 Gy / min, אז 2.75 דקות יש צורך לספק כולל של 5.5 Gy. קלט משך הזמן המתאים.
    הערה: טבלה 2 מספקת עכבר WBI מינוניםnd שווה הקלינית שלהם בבני אדם. בהקשר של גליומות בדרגה גבוהה, 60 Gy מופרד WBI (2 שברים Gy, 5 ימים / שבוע למשך 6 שבועות) הוא התקן של טיפול הקליני, ואת המקבילה העכברית משמשת כאן היא 16.5 Gy (5.5 Gy x 3).
  3. הכן פתרון חדש של קטמין / xylazine להרדמה מערכתית על ידי הוספת 2 מיליליטר קטמין ו1 מיליליטר xylazine ל -17 מיליליטר מלוח כך שהפתרון הסופי הוא 10 מ"ג / מיליליטר קטמין ו1 מ"ג / מיליליטר xylazine.
  4. לשקול עכברים ולנהל 10 μl של קטמין / xylazine intraperitoneally לגרם של משקל גוף כך שבעלי החיים מקבלים מנה של קטמין ב 100 מ"ג / קילוגרם ו -10 מ"ג / קילוגרם xylazine. עכברים צריכים להיות מסוממים באופן מלא וגלוי נשימה בתוך 2 דקות של ממשל / xylazine קטמין.
  5. כדי לשמור על לחות עיניים בבעלי חיים מסוממים, לשפשף בעדינות כמות קטנה של משחה דמעות מלאכותיות בכל עין.
  6. מניחים עכברים מסוממים ברשת כך שהראשים ממוקמים באזור שמקבל את X-ray הגבוה ביותר בדריכות (איור 2 ב, ג). גופי חומת מהצוואר ומטה עם הגודל מתאים צינורות עופרת לחסום משלוח X-ray מערכתי (איור 2 ד).
  7. מניחים עכברים ממוקמים מתחת לקרן רנטגן כך שהליזר המציין את הנקודה של קרן רנטגן המוקד הוא בתיאום (0,0) על פריסת הרשת. בגין משלוח X-ray.
  8. כאשר משלוח X-ray הוא מלא, להסיר חיות מirradiator והמקום על כרית חימום חמה. אל בית חיות מסוממים עם בעלי חיים מודעים עד בעלי חיים שב להכרתו מספיק כדי לשמור recumbence sternal. ברגע שבעלים חיים יכולים לשמור על recumbence sternal, למקם את החיות בהכרה חזרה בכלובים המתאימים שלהם.
  9. חזור על תהליך זה בימים 3 ו -4 בסכום כולל של שלוש מנות מופרדים של קרינה.

3. Transfection

יום -1:

  1. הכן תקשורת D10 על ידי הוספת 50 מיליליטר סרום שור עוברי (FBS) עד 500 מיליליטר של M של Dulbeccoodified נשר בינוני (DMEM).
  2. הכן תקשורת תא T (TCM) על ידי הוספת 5.5 מיליליטר L-גלוטמין, 5.5 מיליליטר פירובט נתרן, 5.5 מיליליטר חומצות אמינו שאינו חיוניות, ושל 5.5 מיליליטר הפניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) 500 מיליליטר תקשורת RPMI-1640. לאחר מכן, להוסיף 550 μl של 2-mercaptoethanol ו -550 גנטמיצין μl. לבסוף, להוסיף 50 מיליליטר FBS.
  3. במבחנה תאי HEK293T תרבותיים קציר ולהביא לריכוז של 7.5 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת D10.
  4. צלחת תקשורת 10 מיליליטר D10 ולהוסיף 1 מיליליטר של תרחיף תאי HEK293T בכל 16 x 10 סנטימטרים poly-D- ליזין (PDL) צלחות מצופים.
  5. דגירה הלילה בשעה C ° 37 עם 5% CO 2.

יום 0:

  1. החלף תקשורת עם D10 הטרי 10 מיליליטר דקות לפחות 30 לפני transfecting תאים.
  2. לקבוע את סכום פלסמיד וקטור, וקטור PCL-אקו, ומגיב transfection liposomal נדרש לtransfection על ידי הכפלת המספר הכולל של צלחות + 1 (16 + 1 = 17) על ידי 14.1 מיקרוגרםפלסמיד וקטור (14.1 x 17 = 239.7 מיקרוגרם), 9.9 מיקרוגרם וקטור PCL-אקו (9.9 x 17 = 168.3 מיקרוגרם), ומגיב 60 μl transfection liposomal (60 x 17 = 1,020 μl). כל ריאגנטים צריכים להיות בטמפרטורת חדר לפני הכנת פתרונות.
  3. תווית שני צינורות ו- B. בצינור, להוסיף 239.7 מיקרוגרם פלסמיד וקטור ו168.3 וקטור מיקרוגרם PCL-אקו ל( 1.5 x 17) מיליליטר מופחת סרום שונה בינונית של הנשר (RS-ממ). בצינור B, להוסיף מגיב transfection liposomal 1,020 μl ל( 1.5 x 17) מיליליטר RS-ממ.
  4. דגירה A ו- B בנפרד במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. מערבבים A ו- B יחד בעדינות (מערבולת במשך 1-2 שניות או להפוך כמה פעמים) ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר כדי ליצור שומנים / מורכב DNA.
  6. הוסף טיפה מורכבת שומנים / DNA חכם לתאי HEK293T בצלחת 10 סנטימטר.
  7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6-8 שעות או למשך לילה (לא יעלה על 24 שעות).
  8. לאחר 6-8 שעות דגירה, להחליף בינוני עם 12 מיליליטר של TCM הטרי לייצור נגיפי. זה מצופה תקשורתישמש ביום 2 בsupernatant ויראלי עבור התמרה תא T.

4. כריתת טחול והכנת תא T

יום 0:

  1. יוצקים 10 מיליליטר של TCM לחרוטי 50 מ"ל ומניחים על קרח לאוסף טחול.
  2. להקריב את המספר המתאים של בעלי חיים על ידי CO 2 מחנק ועריפת ראש המשני: בעלי חיים מקום בכלוב קבלת CO 2 בקצב זרימה של 10-30% נפח / דקת כלוב, בהתאם להנחיות איגוד האמריקאי לרפואת וטרינרית (לא יותר מ 5 בעלי חיים יכולים להיות הקריב בו-זמנית) עד מסתיימת נשימה ובמשך שתי דקות לאחר מכן. הסר בעלי חיים מתא CO 2 ולערוף.
    הערה: טחול אחד C57BL / 6 עכבר נקבת 6-12 בן שבוע יניב כ 4.5-5 x 10 7 splenocytes. כאן, 4 טחולים יהיו לקצור כ 200 x 10 6 תאים.
  3. הנח את העכבר כך שצידו ממני פונה כלפי מעלה, ולרסס עם אתנול 70%. עם המלקחיים, לתפוס קפל דק של עור מתחת לבית החזה השמאלי וחתך חתך קל עם המספריים. לקלף את העור, לתפוס בזהירות לקפל דק של הצפק עם מלקחיים, וחתך חלל קטן.
  4. הטחול הוא איבר קטן, מוארך בצבע אדום כהה שדומה שעועית שטוחה; בעדינות לתפוס את הטחול עם המלקחיים ובלו על ידי חיתוך משם רקמת חיבור שמסביב. מניחים את הטחול נכרת לחרוטים המכילים 10 מיליליטר של TCM על קרח.
  5. יוצקים טחולים מעל מסננת תא רשת 70 מיקרומטר וdisaggregate מוחץ עם הקצה הקהה של החלק הפנימי של מזרק 5 מיליליטר כדי ליצור השעיה תא בודד. מקסימום של שני טחולים צריך להיות מפוצל למסננת רשת.
  6. השתמש בנפח קטן של TCM לשטוף את המסננת הבאה disaggregation לאסוף כל splenocytes שנותר בזהירות. בריכה כל הטחולים המפוצלים להשעית תא בודד. תביא נפח סופי 50 מיליליטר עם TCM לשטיפה אחתד ספין ב XG 300 עבור 10 דקות.
  7. הכן פתרון של מאגר תמוגה 1x ידי הוספת 5 מיליליטר 10x חיץ תמוגה ל 45 מיליליטר מים סטריליים. לחסל את תאי דם אדומים, resuspend גלולה ב 5 מיליליטר של חיץ תמוגה 1x לטחול בחרוטי 50 מיליליטר, ערבבו היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. אם עולה על 5 טחולים, להשתמש צינור צנטריפוגות 250 מיליליטר. הנח חרוטי או צינור צנטריפוגות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  8. הסר את תגובת תמוגה מאמבט המים ולהוסיף TCM ביחס של 1: 1 עם חיץ תמוגה כדי לנטרל את התגובה. לשטוף על ידי ספינינג ב XG 300 עבור 10 דקות.
  9. לשאוב supernatant וגלול גלול באופן מלא בTCM (2 מיליליטר / טחול, 8 מיליליטר כולל 4 טחולים) על ידי pipetting מעלה ומטה.
  10. ספירת תאים על ידי הוספת 10 μl של השעיה תא 190 μl trypan כחול (01:20 דילול). הכפל את המספר שהתקבל באחד מארבעת הריבועים gridded על ידי 20 x 10 x 4 נפח כולל (8 מיליליטר) להשיג המספר הכולל של התאים (לדוגמא, 125 x 20 x תאים 10 4 6 splenocytes).
  11. לדלל תאים בריכוז של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר בTCM, בתוספת 2 מיקרוגרם / מיליליטר concanavalin (ConA) ו -50 IU / interleukin-2 אנושיים רקומביננטי מיליליטר (rhIL-2). כך, 200 x 10 6 splenocytes, להוסיף 92 מיליליטר תקשורת עד 8 ​​מיליליטר תאים, 200 מיקרוגרם ConA, ו5,000 IU rhIL-2.
  12. הוסף 2 מ"ל תאים היטב בכל צלחות רקמות תרבות 24 גם טופלו, כך ש4 x 10 6 תאים היטב בכל אחד (לדוגמא, תאי 100 מיליליטר ידרוש כ 4 צלחות).
  13. דגירה הלילה בשעה C ° 37 עם 5% CO 2.

5. התמרה

יום 1:

  1. לחשב את מספר התרבות הלא-רקמה שטופל 24 גם צלחות דרושות לתמרה על ידי הכפלת מספר הטחולים שנקטפו על ידי 2 (8 צלחות נדרשות ל4 טחולים).
  2. בשלב הבא, לחשב את הנפח הנדרש של בר פיברונקטין האנושי רקומביננטי פתרון (RHFF)צריך צלחות מעיל על ידי הכפלה (מספר הכולל של בארות + 3) x 0.5 מיליליטר (8 צלחות x 24 בארות = 192 + 3 = 195) x 0.5 מיליליטר = 97.5 מיליליטר.
  3. הכן 97.5 מיליליטר פוספט שנאגרו מלוח (PBS) המכיל RHFF בריכוז של 25 מיקרוגרם / מיליליטר על ידי הכפלת הנפח הכולל של 25 מיקרוגרם (97.5 x 25 = 2,437.5 מיקרוגרם). להוסיף סכום זה של RHFF ל97.5 מיליליטר PBS.
  4. תרבות הלא-רקמת מעיל טופלה 24 גם צלחות על ידי הוספת 0.5 מיליליטר פתרון PBS / RHFF בכל טוב.
  5. דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.

יום 2:

  1. לזרוק את פתרון PBS / RHFF מהתרבות הלא-רקמה שטופל 24 גם צלחות.
  2. הוסף 1 מיליליטר / גם אלבומין 2% בסרום שור (BSA) בPBS ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
  3. הסר BSA על ידי תקיפות הפיל את הצלחת. לשטוף ידי הוספת 2 מיליליטר PBS.
  4. איסוף supernatant הנגיפי על ידי העברת תקשורת מכל צלחת PDL HEK293T לתוך צינור 250 מיליליטר צנטריפוגות ולסובב 10 דקות ב 500 x גרם.
  5. להעביר בזהירות su הנגיפיpernatant לתוך צינור צנטריפוגות 250 מיליליטר טרי, להיות בטוח שלא להפריע התא גלולה שאולי נוצר.
  6. להוסיף TCM הטרי לsupernatant ויראלי כך שהנפח הסופי הוא 3 מיליליטר יותר מהסכום הדרוש לבארות מצופות RHFF. לדוגמא, עבור 192 בארות מצופות RHFF, להביא את הנפח של supernatant ויראלי 192 מיליליטר + 3 = 195 מיליליטר.
  7. הסר splenocytes התרבותי מן החממה והגלולה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 2 - 3 פעמים בכל טוב. העברה לחרוטי 250 מיליליטר. אם בעזרת פיפטה רבה, תוך שימוש במאגר סטרילי לפני ההעברה יעזור לזרז את הצעד הזה. ספירה כפי שתואר לעיל וספין ב XG 300 עבור 10 דקות.
  8. להוסיף rhIL-2 לsupernatant ויראלי בריכוז של 50 IU / ml. לדוגמא, להוסיף 50 x 195 = 9,750 IU rhIL-2-195 מיליליטר של supernatant ויראלי.
  9. Resuspend splenocytes בsupernatant ויראלי ב1 x 10 6 תאים / מיליליטר
  10. הוסף 1 מיליליטר / היטב ההשעיה splenocyte לצלחות 24 גם מצופות RHFF.
  11. ספין למשך 90 דקות על פי ההגדרות הבאות: 770 XG, תאוצה = 4, בלם / האטה = 0, 32 ° C.
  12. הכן פתרון TCM עם 50 IU / ml rhIL-2. לדוגמא, להכין פתרון TCM 200 על ידי הוספת 10,000 IU rhIL-2. הוסף 1 מיליליטר של rhIL-2 / TCM היטב כל אחד לאחר צנטריפוגה.
  13. תרבות הלילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2.

6. CAR תא T תרבות וקציר

ימים 3 ו -4:

  1. אם תאי T להשיג> מפגש 80%, תאים עשויים להיות מפוצלים (זה קורה בדרך כלל ביום 3 או 4 ימים). כדי לפצל תאים, בעדינות pipet למעלה ולמטה בכל טוב 2-3 פעמים, ולהעביר 1 מיליליטר מכל טוב לבארות חדשות של צלחת 24 גם טרי רקמות תרבות שטופלה. לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של TCM הטרי עם 50 IU IL-2 מיליליטר / היטב כל אחד כך שנפח סופי הוא 2 מיליליטר בכל הבארות.
  2. אם תאים אינם מגיעים למפגש> 80%, לבצע שינוי תקשורת מחצית על ידי pipetting לאט את 1 מיליליטר של תקשורת מהחלק העליון של כל אחד. הימנע דisturbing תאים התיישבו על הקרקעית תוך הסרת תקשורת. הוסף 1 מיליליטר של TCM הטרי המכיל 50 IU / ml rhIL-2.

יום 5:

  1. Resuspend CAR T תאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 3 פעמים בכל טוב ולהעביר צינור צנטריפוגות 250 מיליליטר. ספין תאים ב XG 300 עבור 10 דקות.
  2. supernatant לחלוטין לשאוב מבלי להפריע גלולה. שטפי פעם עם PBS, לספור תאים כפי שתואר לעיל, ולשטוף עם PBS בפעם שנייה. תשואת תא T CAR טיפוסית היא כ 1 x 10 6 תאים לכל היטב (8 צלחות תאי x 24 בארות = 192 x 10 6 T CAR).
  3. תאים גלולים בPBS בריכוז של 5 x 10 7 / מיליליטר להזרקה של 1 x 10 7 בנפח של 200 מיקרוגרם (לדוגמא, עבור 192 x 10 6 תאי T CAR, resuspend שטפו גלולה ב3.84 מיליליטר PBS).

7. CAR מנהל תא T לעכברי נושאי גידול

יום 5:

  1. Transpoתאי rt על קרח למתקן בעלי חיים להזרקה תוך ורידית. עומס 500-1,000 μl לתוך מזרק אינסולין עם 27-31 מחט G, להבטיח כי כל הבועות מגורשות.
  2. תפוס את העכבר בבסיס הזנב ולמקם בעוצר צינור.
  3. משוך את הזנב מתוח עם הווריד פונה כלפי מעלה, ולהחליק את המחט כ 1-2 מ"מ מתחת לעור לתוך הווריד על ידי הכנסתו במקביל לוריד הזנב. לאט לגרש 200 μl לווריד. אם המחט מוכנסת כהלכה לתוך הווריד, הנפח יהיה בקלות לזרום ב; אחרת תהיה התנגדות ואת המחט צריכה להיות מוסר מהזנב ומחדש הוכנס בצורה נכונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי T CAR מופקים על ידי התמרה עם וקטור retroviral EGFRvIII CAR 11. וקטור זה, MSGV1, פותח מוקטור SFGtcLuc_ITE4 35, המכיל את הווירוס בתאי גזע העכבריים (MSCV) חוזר מסוף ארוך, אזור איסור פרסום ואתר שחבור מעטפה המורחב (תורם אחוי, SD, ואחוי acceptor, sa), וויראלי אות אריזה (ψ). CAR EGFRvIII מכיל בר האדם אנטי-EGFRvIII חד-השרשרת משתנה (scFv) 139, בד בבד עם CD8TM העכברי, אזורים תאיים CD28, 4-1BB, וCD3ζ, היה משובט לתוך וקטור retroviral מורד אתר NcoI (איור 3) .

בעקבות התמרה, ניתן לכמת תאי T CAR וphenotyped ידי cytometry זרימה. ניתן דמיינו תאי EGFRvIII CAR T עם פנל 2 צבעים מורכבים מstreptavidin-Phycoerythrin (SA / PE) -conjugated biotynlated multimer-נגזר EGFRvIII ואנטי-CD3 FITC. שימוש בprot התרבות והתמרהocols מתואר כאן, אנחנו באופן שיגרתי להתבונן ביטוי CAR בין 55-70% מsplenocytes העכברי (איור 4 א) 11. לחלופין, יכולות גם להיות מוכתמות מכוניות לביטוי באמצעות עז אנטי אנושי F (ab ') נוגדנים משני 2 ביוטין הראשוני וSA / PE אשר כבר תיארו בעבר 36. תאי T CAR ניתן phenotyped עוד יותר על ידי התוספת של נוגדנים שכותרתו fluorescently אחרים ללוח CAR שני צבעים. לדוגמא, צביעה לCD8 וCD4 מראה כי 70% ממכוניות transduced תאי CD8 + T, ואילו 20% מהם תאי CD4 + T (איור 4). תאי T CAR עם פרופיל ביטוי זה הוכחו בקלות תנועה למוח וטיפול בגידולים תוך-גולגולתי.

טבלת 1:. מינון temozolomide מבוסס על משקל חיה מינוני temozolomide חושבו בהתבסס על מינון כולל של 60 מ"ג / קילוגרם.

משקל גוף נפח
25 גרם 0.50 מיליליטר
0.48 מיליליטר
23 g 0.46 מיליליטר
22 g 0.44 מיליליטר
21 g 0.42 מיליליטר
20 גרם 0.40 מיליליטר
19 גרם 0.38 מיליליטר
18 g 0.36 מיליליטר
17 g 0.34 מיליליטר
16 g 0.32 מיליליטר
15 גרם 0.30 מיליליטר
14 גרם 0.28 מיליליטר
13 g 0.26 מיליליטר
g 12 0.24 מיליליטר
11 g 0.22 מיליליטר
D ד # שברים BED SOC
16.5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52.5 LGA
12 3 4 30 נפגש
16 2 8 32 נפגש

טבלה 2:. מינוני קרינה ביולוגית שווי ערך רלוונטי מבחינה קלינית מינוני קרינה חושבו על פי BED = D [1+ ד / (α / β)], שבו D = מינון כולל, מינון ד = מופרד, וα / β = 2). המינון הכולל מנוהל כWBI למארח העכברי מוצג במונחים של המינוני דואר השבר נמסרו והמנה האדם שהוא מודל על ידי שברים מינון אלה. למטרות מודל, הגידול הממאיר שהמיטה היא טיפול סטנדרטית מצוין גם כן.

איור 1
איור 1:. ציר זמן לטיפול בעכברי גידול נושאות לשעבר vivo דור CAR מקביל תקן של כימותרפיה לטיפול והקרנת המוח כולו מתחיל 4 ימים לאחר השתלת גידול (). במהלך פרק זמן זה, תאי T CAR נוצרים ותרבותי לשעבר vivo (B) ונמסרו לאחר קורס מלא של מארח אוויר.

איור 2
איור 2: פריסה והגדרות למסירת קרינה.צילומי רנטגן מועברים על פי dosimetry של 320 וולט ו -10 מילי-אמפר, עם משך זמן משתנה נבחר בהתאם למינון הרצוי (). שדה המוקד של קרינת X-ray הוא אזור 2.5 סנטימטר צר. בעלי חיים מסוממים מסודרים לפי הרשת (B) באופן שראשיהם לשקר בתחום עצמת X-ray הגבוה ביותר; (ג) מציג את הנוף מקצה אחד של קרן רנטגן. כ 4 בעלי חיים יכולים להיות תחת irradiator במהלך קורס אחד של ממשל X-ray לפי פריסת רשת זו (B, D). צינורות עופרת משמש כדי להגן על הגוף, ומשאירים רק את ראשם החשוף לWBI (D).

איור 3
איור 3: הווקטור שונה SFGtcLuc_ITE4 retroviral, MSGV1, שימש לתמרה ודור של תאי T CAR.הכנס CAR EGFRvIII מכילים בר האדם אנטי-EGFRvIII שרשרת אחת משתנה (scFv) 139, בד בבד עם CD8TM העכברי, אזורים תאיים CD28, 4-1BB, וCD3ζ, מוקף בוירוס בתאי גזע עכברי (MSCV) חוזר מסוף ארוך (LTR ). במעלה הזרם של להכניס את המכונית הוא אזור איסור הפרסום המורחב ואתר מעטפת אחוי (תורם אחוי, SD, ואחוי acceptor, sa), ואת האות הנגיפית האריזה (ψ).

איור 4
איור 4: מכוניות EGFRvIII באות לידי ביטוי על פני השטח של תאי T 48 שעות הבאות התמרה, תאי T היו מוכתמות לביטוי פני השטח של מכוניות EGFRvIII באמצעות multimer המורכב מLEEKKGNYVVTDHC-K (ביוטין) -NH 2 / streptavidin-PE.. תאי T Untransduced מאותו התורם הוכתמו גם כביקורת שלילית. הנתונים מראה את מספר תאי T CAR (ציר y) חיוביים לstaining ידי multimer PE-מצומדות EGFRvIII (ציר x), מגודר על CD3 + תאים כסמן תא T, שבו הביטוי נמצא 60.9% (). תאי T CAR המוכתמים עבור CD4-PerCP-Cy5.5 וCD8-APC להראות פרופיל ביטוי של 21.7% ושל 70.9%, בהתאמה (B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ציר זמן הטיפול המתואר כאן נועד מודל הסטנדרטי של טיפול קליני ולמנף את השפעתו לטיפול מאמצת CAR. מינוני CAR T תא, משטרי TMZ, וממשל הקרנות יכולים להיות שונה כדי לשפר את הפעילות בvivo T תא, lymphodepletion, והרג גידול. ניתן להגדיל משטרי TMZ להניב myeloablation מארח והתרחבות מוגברת של תאים הועברו adoptively 30. יתר על כן, השפעות lymphodepletive של TMZ יכולות להיות סכמו על ידי מינון נמוך (4-6 Gy) הקרנת גוף כוללת חד-שבריר (TBI), ובכך לעקוף את מאפייני tumoricidal של SOC. משטר הקרינה מיושם כאן מחקה מינון ביולוגי שווה ערך של 60 Gy; עם זאת, מספר השברים ומינוני השבר יכול להיות מכוון לחקות מינונים אחרים קליניים (טבלה 2). חשוב לציין, המודל של SOC שלנו מנצל מינונים ביולוגיים מקבילים של WBI, ולא קרינת קרן חיצונית נמסרה focally לגידול וmargins, כהוא מנוצל לעתים קרובות במרפאת, ובכך עלול לגרום למינון נמוך יותר של קרינה מועברת לגידול ועלייה בסיכון לרעילות למוח עכבר הבריא. למרות מגבלות אלה, עם זאת, WBI הוא טכניקה מקובלת לדוגמנות רדיותרפיה קלינית בהגדרה פרה-קלינית.

ניתן להגדיל מינוני תא CAR T או ירד להתבונן השפעות מינון על הרג גידול והישרדות כללית 11. בנוסף, העיתוי של טיפול ותוואי המשלוח יכול להיות שונה כדי לראות הבדלים ביעילות. לדוגמא, תאי T CAR יכולים להיות מועברים intracranially כדי להבטיח פעילות באתר הגידול. התשואה של תאי T CAR-חיובי יכולה להשתנות בהתאם ליעילות של התמרה. אחת דרכים להבטיח התמרה מוצלחת היא על ידי ביצוע -control ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP) לאורך כל ההליך. כדי לעשות זאת, צלחת PDL 10 סנטימטרים HEK293T 1 יכולה להיות שהוקצתה עבור transfection GFP ותמרה של גם אחת של תאי T לחלוקיםn לGFP בימים 3-5. גורם קריטי ביעילות התמרה הוא על תוספת של supernatant ויראלי היקף של הפעלת תאי T והשגשוג. נציין פער חשוב בין השיטה של ​​הפעלת תאי T, אשר מושגת על ידי התוספת של ConA עד בינוני התרבות שלנו, ושהשתמש בהגדרה הקלינית, שהושגה על ידי נוגדנים חד שבטיים אגוניסט CD3 וCD28. למרות שהאחרון משמש באופן שיגרתי ליצירת תאי T מטופל retroviral transduced CAR וגם היה מוצלח בתמרה של תאי T עכבריים, קבענו בעבר כי גירוי ConA הוביל לtransductions טוב יותר ועקבי יותר 37. יש לנו גם ציינו כי תשואת תא כוללת CAR T יכולה להשתנות בהתאם לכאשר צעד 5.18 מתבצע. אם אתם חווים תשואת תא T CAR עניה, אנו ממליצים על ביצוע צעד 5.18 מייד לאחר שלב 5.17, במקום לחכות לדגירת 5-6 שעות. למרות שזה עשוי להשפיע על היעילות של התמרה, יש לנו לא נצפה DIF המשמעותיferences בביטוי משטח CAR במחקרים שלנו.

בעקבות התמרה, ניתן לכמת תאי T CAR וphenotyped ידי cytometry זרימה; אנחנו להכתים תאי EGFRvIII CAR T שלנו עם פנל 2 צבעים מורכבים מstreptavidin-Phycoerythrin (SA / PE) -conjugated biotynlated multimer-נגזר EGFRvIII ואנטי-CD3. לחלופין, יכולות גם להיות מוכתמות מכוניות לביטוי באמצעות עז אנטי אנושי F (ab ') נוגדנים משני 2 ביוטין הראשוני וSA / PE אשר כבר תיארו בעבר 36. אנו שגרתי להתבונן ביטוי CAR בין 55-70% מsplenocytes העכברי 11. הראינו בעבר כי משלוח של תאי T עם פרופיל ביטוי CAR זה יכול בקלות תנועה למוח וטיפול בגידולים. lymphopenia TMZ- או TBI המושרה משפר הרחבה משובט של תאים הועברו adoptively, הגדלת התדירות של תאי CAR-חיובי והתגובה אנטי-הסרטנית הכוללת שלהם. ניתן לעקוב תאי T CAR in vivo על ידי צביעת דם היקפי עםtetramer ppropriate; זה הוא טכניקה שימושית להבנת CAR הישרדות תא T לאורך זמן ואת ההשפעות של מארח-אוויר על תפקוד תאי T CAR והתמדה. לחלופין, אם אין tetramer זמין עבור קולט אנטיגן, כתב ניאון יכול להיכלל במבנה וקטור CAR, או יכולים להיות מתויגים תאי T CAR vivo לשעבר עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) לפני ממשל למעקב in vivo.

בהתאם לדגם הגידול, פלטפורמה חיסוני, ומשטר SOC, SOC הקליני מנוהל לצד טיפול או חיסוני מאמצת יכול להוביל לרעילות. TMZ הוא סוכן ה- DNA אלקילציה שמוביל להרג של תאים לא-ספציפי, והגביר את המינון יכול לגרום לירידה במשקל ותחלואה במארחים עכבריים. במינון גבוהה ושברים ממושכים של WBI יכולים לגרום להידרוצפלוס. יתר על כן, השפעות דלקתיות מחיסון חזק ו / או תגובות של תאי T הועברו adoptively יכולות להוביל לתחלואה בסופות ציטוקינים רעילות. כמו כן, חשוב לשים לב להשפעות של הרדמה מערכתית על בעלי חיים חולניים. אם TMZ וWBI להוביל לרעילות משמעותית, אז קטמין יכולים להיות ירידה / מינוני xylazine על ידי 20-25% כדי להפחית את הסיכון לתמותה, כמו בעלי חיים רק צריכים להיות מסוממים ומשותק במשך 10 דקות עבור משלוח של מנות קרינה קטנות (2 8 Gy).

מארח האוויר הוא קריטי עבור כל הפלטפורמות חיסוני הכוללות העברת מאמצת. כניסויים חיסוניים לעתים קרובות העריכו בהקשר של SOC, הערכה פרה-קלינית של immunotherapies צריך להיעשות תוך הגדרה זו כדי לשחזר את התרחיש הקליני. אנו מציגים כאן דוגמא אחת למינוף lymphodepletive ואפקטי tumoricidal של SOC עם טיפול מאמץ באמצעות תאי T CAR. משטר זה הוא כלי רב עוצמה שיכול להיות מיושם על פלטפורמות חיסוניים אחרות כדי להעריך את ההשפעות של SOC המשולב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363, (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364, (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21, (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14, (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119, (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365, (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118, (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55, (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20, (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71, (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63, (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66, (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16, (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171, (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A, (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15, (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62, (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25, (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65, (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18, (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173, (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23, (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116, (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3, (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17, (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26, (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8, (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22, (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110, (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202, (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33, (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16, (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23, (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34, (4), 343-352 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics