Génération de stimulateur cardiaque murin agrégats de cellules fondées sur la ES-Cell-programmation en combinaison avec MYH6-promoteur-sélection

Developmental Biology

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Summary

Ce protocole décrit comment produire fonctionnel sinus nodal tissu de cellules souches pluripotentes (PSC) murins. T-Box3 (TBX3), plus la surexpression cardiaque myosine-chaîne lourde (MYH6) sélection par antibiotique promoteur conduit à des agrégats de cellules de stimulateur de haute pureté. Ces "induit-sino-auriculaire-organismes" ("iSABs») contiennent plus de 80% de cellules de stimulateur cardiaque, montrent des taux de battement très augmenté et sont capables d'arpenter myocarde ex vivo.

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Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J. Vis. Exp. (96), e52465, doi:10.3791/52465 (2015).

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Abstract

Traitement de la "maladie du sinus" est basé sur les stimulateurs cardiaques artificielles. Ceux-ci portent des risques tels que l'insuffisance et les infections batterie. En outre, ils ne ont pas la réponse hormonale et la procédure globale est coûteux. "Pacemakers biologiques" générés par les CSP peuvent devenir une alternative, mais le contenu typique des cellules pacemaker en corps embryoïdes (EBS) est extrêmement faible. Le protocole décrit combine «programmation avant» du PSC murins via le nœud sinusal inducteur TBX3 avec la sélection à base d'antibiotiques MYH6-promoteur. Cela donne agrégats de cardiomyocytes cohérentes> 80% de cellules pacemaker physiologiquement fonctionnels. Ces «induits-sino-auriculaire-organismes" ("iSABs") sont contractant spontanément à des fréquences encore non atteints (400-500 bpm) correspondant à des cellules ganglionnaires isolées de coeurs de souris et sont capables d'arpenter myocarde murin ex vivo. En utilisant le protocole décrit des sinus de haute puretécellules individuelles nodaux peuvent être générés qui par exemple peut être utilisé pour les tests in vitro de médicaments. En outre, les iSABs générés selon ce protocole peuvent devenir une étape cruciale vers l'ingénierie du tissu cardiaque.

Introduction

Le terme «maladie du sinus» résume plusieurs maladies conduisant à la détérioration du système de stimulateur cardiaque. Il comprend pathologique, bradycardie symptomatique des sinus, bloc sino-auriculaire, arrêt sinusal ainsi que le syndrome de tachycardie-bradycardie. Ainsi, une «maladie du sinus" est souvent accompagnée par des maladies cardiaques généraux comme une maladie cardiaque ischémique, cardiomyopathies ou une myocardite. À l'heure actuelle, les approches thérapeutiques basées sur l'implantation de stimulateurs électriques. Toutefois, cela va de pair avec un certain nombre de risques tels que les infections et une panne de batterie. Dans l'ensemble, l'incidence des complications est encore très élevé chez les patients ayant implanté un stimulateur artificiel. En outre, par opposition au stimulateur endogène, ces dispositifs ne répondent pas à la stimulation de l'hormone.

Une alternative avenir peut compter sur la disponibilité de «pacemakers biologiques" pour lequel PSC pourraient servirune source cellulaire appropriée et qui serait aussi très utile pour les tests in vitro de médicament. Pourtant, un problème majeur réside dans l'apparition très rare de cellules ganglionnaires de sinus dans les corps embryoïdes (EBS) - ce généralement ne dépasse pas ~ 0,5% 1.

Auparavant, il a été montré que la "programmation avant" vers des sous-types spécifiques de cardiomyocytes est réalisable via la surexpression des facteurs premiers distincts cardiovasculaires de transcription tels que le facteur 1 (MesP1) spécifiques à-mésoderme postérieur et NK2 transcription liée, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Pour la taille et la fonction du noeud sino-auriculaire (SAN) normale, la T-box facteur de transcription TBX3 est crucial, qui a été montré pour lancer le programme génique du stimulateur et à contrôler la différenciation de la SAN 4. Bien que cette renforcée l'apparition de cellules de stimulateur cardiaque fonctionnelle, la teneur encore ne dépasse pas environ 40% dans l'ensemble de la population de cellules cardiomyocytic.

Par conséquent, une étape de sélection par antibiotique à base supplémentaire MYH6-5 promoteur a été introduit par nous. Cela conduit finalement à des agrégats de cardiomyocytes encore non observées ("organismes induits sino-auriculaire;" iSABs ») qui présentent des fréquences battant fortement augmenté (> 400 bpm) in vitro, pour se rapprochant de celles d'un cœur murin et comparable à cultivées in vitro la première fois sinus cellules ganglionnaires isolées d'un cœur murin 6. Sous l'administration Isoprénaline même fréquences battant de 550 bpm sont atteints. Notamment, iSABs se composent de plus de 80% de cellules nodales fonctionnels évidents de la vaste physiologique analyses 7. Récemment, plusieurs approches pour générer des sinus cellules nodales utilisant reprogrammation directe 19, marqueurs de surface 14 ou traitement pharmacologique avec de petites molécules 16,17 ont été décrits. Pourtant, aucune de ces méthodes conduit à une telle pureté élevé de cellules pacemaker et en battant des fréquences proches de la souris, ill'art comme observé dans iSABs.

De plus, dans un modèle ex vivo de cultivées tranches ventriculaires de souris adultes qui ont perdu leur activité de battements spontanés, les iSABs sont capables de se intégrer dans le tissu de la tranche, restant ainsi spontanément actif et robuste stimulation les tranches cardiaques à des contractions 7. Un protocole détaillé pour la génération de ces iSABs est décrite dans le présent document.

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Protocol

1. Recommandations Avant de partir

  1. Ne pas utiliser les CSP contaminées par des mycoplasmes parce qu'ils ne seront pas bien différencier en cellules du nœud sinusal. Test de la contamination par des mycoplasmes avant de commencer le protocole. Pour cela, utilisez un kit PCR pour la détection rapide et très sensible de mycoplasmes et de suivre le protocole manufacturer`s.
  2. Pour chaque boîte de Pétri (étape 2.3.4), manteau une 10 cm de boîte de culture cellulaire avec deux stérile 7 ml 0,1% de gélatine de peau de poisson d'eau froide pendant 1 heure à 37 ° C. Retirer la gélatine et laisser le plat sec dans des conditions stériles dans un banc stérile.
  3. Avant de commencer le protocole de différenciation vous avez besoin d'une souris transfectées stables ES clone de lignée cellulaire à double contenant les caractéristiques suivantes: i) constitutif surexpression de TBX3 utilisant un vecteur d'expression de mammifère. Ii) le gène de résistance à G418 sous le contrôle du promoteur MYH6-5.
  4. Les cellules indifférenciées PSC devraient être co-cultiverd avec des cellules nourricières irradiées dans des conditions normales comme décrit une.

2. Procédure Différenciation

  1. Deux jours avant Différenciation - Retirer les CSP des cellules nourricières.
    1. Aspirer le milieu, laver les cellules avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate PBS, ajouter 7 ml de solution de collagénase IV et incuber les cellules pendant 10 min à 37 ° C. Placer un filtre 40 um stérile dans un tube de 50 ml.
    2. Rincer soigneusement les colonies de la CFP (éviter d'enlever les cellules nourricières) par pipetage la solution de collagénase monter et descendre 5 fois.
    3. Transférer la suspension cellulaire à un filtre de 40 um, de rincer le filtre trois fois avec 8 ml de PBS. Tourner autour du filtre et placez-le à l'envers dans une boîte de Pétri. Retirer les colonies de cellules par pipetage de la CFP 10 ml de PBS à la partie inférieure du filtre.
    4. Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml et centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
    5. Retirez le PBS, les cellules en suspension dans 1 ml Accutase et incubate à 37 ° C pendant 5 min.
    6. Ajouter 10 ml de PBS, mélanger la solution de cellules par pipetage de haut en bas 5 fois et centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
    7. Retirer le PBS, les cellules en suspension dans 10 ml de milieu de culture et déterminer le nombre de cellules.
    8. Semences 15000 cellules / cm 2 sur un 75 cm ballon de 2 filtre et les cultiver pendant 2 jours à 37 ° C, 5% de CO2. Après 2 jours, la fiole doit être de 50 à 70% de confluence.
  2. Jour 0 - Début de la différenciation
    1. Retirez le moyen et laver les cellules avec 10 ml de PBS.
    2. Aspirer le PBS, ajouter 2 ml Accutase et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min. Placer un filtre 40 um stérile dans un tube de 50 ml.
    3. Ajouter 10 ml de PBS, transférer la suspension de cellules au filtre 40 um, de rinçage du filtre par addition de 10 ml de PBS et centrifuger le flux continu pendant 5 minutes à 300 x g.
    4. Suspendre les cellules dans 10 ml de milieu de différenciation et de déterminer le nombre de cellules.
    5. Diluer til suspension cellulaire avec un milieu de différenciation pour une concentration finale de 20 000 cellules / ml.
    6. Placer 20 ml d'eau et 5 ml baisse (HD) solution dans un plat quadratique Petri pour éviter le dessèchement de la HD suspendus.
      NOTE: Pour chaque plaque contenant 24 iSABs ainsi (voir la section 2.8.6.4/2.8.7) commencer avec 16 boîtes de Pétri.
    7. Pipeter jusqu'à 50 ml de suspension de cellules dans un plateau.
    8. Tourner autour du couvercle de la boîte de Pétri. Placez 180 HD contenant chacun 20 pi (400 cellules / HD) suspension de cellules sur le couvercle à l'aide d'une pipette 12 canaux.
    9. Retourner délicatement autour du couvercle et le placer sur la boîte de Pétri.
      REMARQUE: La vitesse de rotation autour du couvercle est très important. Si le couvercle est tourné autour trop lent ou trop rapide, la tension superficielle de la suspension cellulaire ne est pas suffisamment élevée pour maintenir le rideau tombe sur le couvercle. Avant d'essayer de produire des HD pour le premier entraînement de temps tournant autour du couvercle avec des gouttes de 20 ul de milieu.
    10. Cultiver les cellules pendant 2 jours à 37 ° C, 5% de CO 2 de les laisser forment EBS.
      REMARQUE: Lieu plat de Pétri une remplie d'eau sur le dessus d'une pile de 5 boîtes de Pétri. Sinon, la HD dans la boîte de Pétri supérieure va sécher.
  3. Jour 2
    1. Retourner délicatement autour du couvercle de la boîte de Pétri quadratique et transférer les EB provenant de deux boîtes de Pétri (360 EBS) à un tube de 50 ml.
    2. Attendez 10 min pour laisser les EB se déposent au fond du tube (ne pas centrifuger EBS).
    3. Aspirer autant que possible à moyen, de suspendre les EBS 10 milieu de différenciation ml et transférer la suspension dans un plat de 10 cm Petri.
  4. Journée de la culture 2-6 Suspension
    1. Cultiver les EB en suspension pendant 4 jours à 37 ° C, 5% de CO 2, changement de milieu après deux jours.
      REMARQUE: Même si la boîte de Pétri ne est pas revêtue (par opposition à une boîte de culture cellulaire) EBS attacher souvent à la surface. Contrôler les boîtes de Pétri pour EBS attachés chaque jour et si nécessaire, détachez les EBde la surface par pipetage doux. Facultatif: Agiter les boîtes de Pétri en continu pendant la période de culture en suspension. Soyez prudent avec la vitesse de l'agitateur. EBS ne devraient ni se accumuler dans le milieu, ni flotter à la frontière des boîtes de Pétri.
  5. Jour 6
    1. Transférez les EB d'une boîte de Petri à une gélatine recouvertes de 10 cm de boîte de culture cellulaire 2.
  6. Jour 7-12
    1. Les cellules devraient commencer à battre après 8-12 jours. Vérifiez pour battre foyers des cellules quotidienne sous un microscope. Les cellules commencent à se former une couche.
    2. Changer milieu tous les jours.
      NOTE: Après avoir changé moyenne, les cellules ont besoin 3-4 heures pour récupérer et commencer à battre.
  7. Jour 12-15 Sélection des cellules ganglionnaires de sinus.
    1. Trois jours après que les cellules ont commencé à battre (environ 12-15 jours), aspirer les moyennes et pipette 10 ml de milieu de différenciation frais contenant 400 ug / ml de G418 aux cellules.
  8. NOTE: Il est possible que la couche de cellules est déjà détachée de la surface.
    1. Retirer soigneusement le milieu sans aspiration de la couche cellulaire.
    2. Ajouter 10 ml de PBS et retirer délicatement le PBS sans aspiration de la couche cellulaire.
    3. Ajouter 10 ml de solution de collagénase IV, transférer les cellules dans un tube de 50 ml et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.
    4. Mélanger vigoureusement la suspension par pipetage de haut en bas 10 fois et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min. Une suspension de petites grappes devrait se produire. Se il ya encore d'énormes parties de la couche à gauche, puis répétez l'étape 2.8.4 deux fois de plus.
    5. Ajouter 20 ml de PBS et centrifuger pendant 10 min à 300 x g.
    6. Aspirer le PBS attentivement.
      NOTE: Si iSABs doivent être générés passez à l'étape 2.8.7. Si ISAB sinus dérivée des cellules individuelles nodaux doivent être généré, allez directement à l'étape 2.9.
    7. Suspendre les cellulesdans 12 ml de milieu de différenciation contenant 400 ug / ml de G418 et épépiner sur 6 puits revêtues de gélatine 24 puits (2 ml / puits).
  9. Génération de cellule unique nodal.
    1. Suspendre les cellules de l'étape 2.8.6 dans 5 ml Accutase et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
    2. Mélanger vigoureusement la suspension par pipetage de haut en bas 10 fois et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.
    3. Ajouter 20 ml de PBS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
    4. Suspendre les cellules dans 12 ml de milieu de différenciation contenant 400 ug / ml de G418 et épépiner sur six puits d'une gélatine revêtues 24 puits (2 ml / puits).
  10. Jour 2 après dissociation, aspirer le milieu et laver les cellules trois fois avec du PBS. Ajouter 1 ml de milieu de différenciation / puits.
  11. Jour 4-8 après dissociation, changement de milieu tous les 2 ème jour. Au jour 10 après iSABs d'utilisation de dissociation ou ISAB sinus nodal dérivée des cellules individuelles sont disponibles pour une analyse plus approfondie.

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Representative Results

Le protocole décrit permet de générer des iSABs avec une fréquence de battement d'environ 450 bpm du PSC (indiquées dans le film) qui est près du cœur de la souris fréquence de battement. Après dissociation de iSABs (étape 2.8.8), les cellules individuelles observées montrent la forme typique de cellules du noeud sinusal (cellules fusiformes et araignées), comme illustré sur la figure 1. Ces cellules protéines hautement express qui sont connues pour être essentielles pour la fonction du noeud sinusal comme cation cyclique canal activé par hyperpolarisation nucleotide-gated 4 (HCN4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2) et MYH6 (Figure 2A - C). Après le traitement des cellules ISAB dérivée avec les produits pharmaceutiques, les cellules montrent le comportement attendu: comme dans le nœud sinusal, le bloqueur des canaux drôle ZD7288 (figure 3A) ainsi que l'agoniste des récepteurs muscariniques carbachol (figure 3B), à la fois provoquer un battement considérablement réduit fréquence de deriv ISABcellules éd. L'agoniste β-isoprénaline d'adrénorécepteur conduit à une fréquence de battement élevée (figure 3C).

Figure 1
Figure 1: forme cellulaire de broche et d'araignées cellules de forme cellulaire typique de ISAB broche dérivée (A) et l'araignée (B) cellules nodal. Barre d'échelle 20 um.

Figure 2
Figure 2: Expression de marqueurs de noeud sinusal. (A) Expression de HCN4 (jaune) et Cx45 (magenta), (B) L'expression de Cx45 (magenta) et Cx30.2 (jaune) et (C) MYH6 (magenta) dans les cellules du noeud sinusal. La contre-coloration des noyaux (turquoise). Barre d'échelle 20 um.


Figure 3: Le traitement pharmacologique des iSABs Représentant battant fréquence de iSABs avant (contrôle) et après traitement avec ZD7288 (A), Carbachol (B) et Isoprénaline (C). Les données représentent huit iSABs indépendants et sont présentés en moyenne ± SD. *** P <0,001

Figure 4
Figure 4: Représentation schématique du protocole de différenciation. Bande dessinée simplifié qui reflète l'organigramme expérimentale pour la production du CCSI.

Film:. Battre des iSABs Battement d'un corps typique induite sino-auriculaire (ISAB) après dissociation plaidoyerSE Cliquez ici pour voir cette vidéo.

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Discussion

La capacité à produire des cellules souches du stimulateur cardiaque cellulaires dérivées peuvent permettre la reconstitution du rythme cardiaque approprié dans le sens de "stimulateurs biologiques". De même, les tests de médicaments in vitro bénéficiera de leur disponibilité. PSC peut donner lieu à ne importe quel type de l'organisme d'un mammifère y compris cardiomyocytes avec des propriétés de cellules pacemaker 8,9,10,11,12,13 cellulaire. Cependant, généralement les populations de cellules au sein de «corps embryoïdes" sont très hétérogènes, ce qui conduit inévitablement à l'exigence de stratégies de sélection et d'isolement fiables - cela se applique en particulier le type de cellule très rare de cellules nodales cardiaques. De nombreuses approches basées sur la surface exogènes et endogènes repères 14, sur l'administration pharmacologique de petites molécules 15,16,17 et sur ​​les stratégies de reprogrammation directs 18,19 ont été suivies. En outre, les approches non de cellules souches à base visent à émuler pacemakers biologiquesvia la manipulation de molécules effectrices terminaux sous-jacents sarcolemmique électrophysiologie au lieu de novo générer des cellules nodales entièrement fonctionnels 20,21.

Pourtant, aucune de ces venu avec les fréquences de contraction nécessaires élevés spontanées et la pureté cellulaire. Par contraste, notre protocole conduit à des cellules qui ne présentent pas seulement des oscillations électriques mais aussi des caractéristiques électrophysiologiques subtiles de signalisation et de calcium ainsi que des caractéristiques morphologiques distinctifs de cellules pacemaker 7 endogènes. Cette technologie peut devenir une condition importante pour des alternatives aux dispositifs de stimulation électroniques.

Bien que ce protocole a été optimisé cours de son développement, il ya encore quelques étapes qui peuvent causer des problèmes: Le point de départ de la sélection des ISAB est critique du protocole. Battre des cellules est un indicateur de αMHC-expression dans la différenciation des cellules. MYH6 Expression va de pair avec son expression du gène de résistance à G418. À partir de la sélection trop tôt se éteint un grand nombre de cellules qui pourraient se différencier en cardiomyocytes et sera donc diminuer le rendement global des cellules ganglionnaires de sinus. Une autre étape importante est la dissociation de la couche de cellules (étape 2.8). La raison à cela est que les cellules forment une matrice extracellulaire robuste et une force importante est nécessaire de dissocier la couche cellulaire. Si nécessaire, l'étape 2.8.4 doit être répétée jusqu'à ce que les petits amas de cellules se sont développées à partir de la couche de cellules. Éviter dissociation directe de la couche de cellules, par exemple par la trypsine, car il se est avéré être de très faible efficacité.

Pour les applications cliniques futurs, les obstacles suivants doivent encore être abordées: transfert de l'approche de la génération de iSABs humaines qui peut devenir une étape cruciale vers la thérapie cellulaire future et de dépistage des drogues vitro. En outre, la technique est toujours basé sur modifi génétique stabledes cations de PSC et ne seront donc besoin d'être modifié avant d'être appliquée aux patients.

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Disclosures

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's liquid medium with stable glutamine Biochrom AG FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine Biochrom AG FG 0435
CLS type IV, CLS IV Biochrom AG C4-22
Non-essential amino acids Biochrom AG K 0293
FBS Superior Biochrom AG S 0615
Sodium pyruvate (100 mM) Biochrom AG L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile Biochrom AG A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile Brand 703409
Accutase eBioscience,Inc. 00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette Eppendorf 4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm Falcon 352340
Penicillin/Streptomycin  GE Healthcare P11-010
Petri Dishes Greiner BioOne 663102
DPBS without Ca and Mg PAN-Biotech P04-36500
Fetal bovine serum PAN-Biotech P30-3302
Leukemia inhibitory factor Phoenix Europe GmbH LIF-250
Quadratic petri dishes Roth PX67.1
Gelatin from cold water fish skin SigmaAldrich G7765
2-Mercaptoethanol SigmaAldrich M3148 
1-Thioglycerol SigmaAldrich M6145
Tissue culture dishes TPP 93100
Tissue culture flask TPP 90076
Tissue culture test plates (24 well) TPP 92424

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References

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