En guide till Generera och använda hiPSC Härledda NPCs för studien av Neurologiska sjukdomar

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Genuttryck studier av nervceller differentierade in vitro från humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) av oss 1 och övriga 2,3 indikerar att hiPSC nervceller liknar foster snarare än vuxna hjärnvävnad. För närvarande kan hiPSC-baserade modeller vara lämpligare för studier av anlag för, snarare än sena funktioner i, neurologisk sjukdom. Vi har tidigare rapporterat att en betydande fraktion av genen tecknandet av schizofreni hiPSC härledda neuron är konserverad i schizofreni hiPSC härledda neurala stamceller (NPC), vilket indikerar att NPC kan vara en användbar celltyp för att studera de molekylära vägar som bidrar till schizofreni 1 . Vi och andra har rapporterat avvikande migration, ökad oxidativ stress och reaktiva syreradikaler, känslighet för under gränsvärdena miljöpåfrestningar och nedsatt mitokondriefunktion vid schizofreni hiPSC NPCs 1,4-6, samt minskad neuronal canslutning och synapserna i schizofreni hiPSC nervceller 5,7-10. Om de molekylära faktorer som bidrar till avvikande migration och / eller oxidativ stress i schizofreni hiPSC NPCs bygger också reducerade nervkopplingar i schizofreni hiPSC-härledda neuron, skulle NPCs vara ett robust och mycket replika neurala befolkningen med att studera de mekanismer som är ansvariga för sjukdomen. Vidare, eftersom ett snabbt kan alstra stora mängder celler och behöver inte vänta veckor eller månader för neuronal mognad, NPC-baserade analyser är lämpliga för studier av större patient kohorter och är mer mottagliga för hög genommatningsscreening. Vi tror att hiPSC NPCs kan fungera som en proxy för utvecklingsvägar potentiellt bidrar till sjukdoms patogenes, som redan visats i sjukdomar så olika som schizofreni 1 och Huntingtons sjukdom 11.

För att skilja NPCs från hiPSCs, initial neurala iproduktionen sker genom dubbla SMAD inhibition (0,1 mM LDN193189 och 10 mM SB431542) 12. Genom antagonisera BMP och TGF signalering med dessa små molekyler, är endoderm och mesoderm specifikation blockerad, accelererande neuronal differentiering och leder till bildandet av synliga neurala rosetter inom en vecka plätering. Neural mönstring inträffar tidigt i denna process, förmodligen under perioden av neural rosettbildning och omedelbart därefter. I avsaknad av andra signaler, dessa primitiva neurala celler antar en främre framhjärnan liknande öde 13. Omedelbart efter neural rosettbildning, och pågående hela NPC expansionen, framhjärnan NPCs odlas med FGF2 8,14. De har dubbla härstamning potential och kan differentieras till neurala populationer av 70-80% III-tubulin-positiva neuroner och 20-30% gliafibrillärt surt protein (GFAP) -positiva astrocyter (Figur 1). Majoriteten av framhjärnan hiPSC nervceller är VGLUT1 positiva, Och så är förmodligen glutamaterga, men ca 30% av nervceller är GAD67-positiva (GABAergic) 8.

NPCs rutinmässigt passe mer än tio gånger in vitro, samtidigt som konsekvent differentiering profiler, och utan att ackumulera karyotyp avvikelser. Grupper har rapporterat aging NPCs mer än 40 gånger 15, dock finner vi att bortom tio passager, visar NPCs ökad benägenhet för astrocyternas differentiering. NPCs väl tolerera flera frys-tinar och kan gått att växa som neurospheres genom att helt enkelt odling i icke-vidhäftande plattor. NPCs effektivt transduceras av virala vektorer, möjliggör snabb utvärdering av de molekylära och cellulära konsekvenser av genetisk störning, och lätt att bygga för att ge tillräckligt med material för biokemiska studier. Dessutom eftersom virala vektorer medger robust överuttryck och / eller knockdown av sjukdomsrelevanta gener, antingen kontroll eller patienten härlett neural-celler, kan man använda denna plattform för att testa effekten av genetiska bakgrunden på dessa manipulationer. Även om det inte lämpar sig för synaptic eller aktivitetsbaserade analyser som kräver mogna nervceller, kan NPCs vara ett praktiskt alternativ för många enkla molekylära eller biokemiska analyser av patientgenererade neurala celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hiPSC Differentiering till neurala stamceller

  1. Växa och expandera hiPSCs i mänskliga embryonala stamceller (HES) media (tabell 1) co-odlade på en mus embryonala fibroblast (MEF) feeder lager tills stora (men subkonfluenta) kolonier är redo för neural differentiering via en embryoid kropp (EB) mellan (Figur 2). Rutin hiPSC odlingsbetingelser är väl beskrivna på annat håll 16,17; kort, odla hiPSCs i HES media på ett MEF matarlager tills sammanflytande, därefter enzymatiskt passage med kollagenas (1 mg / ml i DMEM) och expandera ca 1: 3 var 7 dagar.
  2. För att framställa poly-L-ornitin / laminin belagda plattor, coat-plattor med 10 g / ml poly-L-ornitin i sterilt vatten för plastytor (50 g / ml för glasytor) och inkubera vid RT i 3-24 h. Tvätta minst en gång med sterilt vatten och därefter päls med 5g / ml laminin i steril PBS vid RT 3-24 tim.
    OBS: Om insvept i plast, kan plattorna varalagras i upp till sex månader vid -20 ºC.
  3. Dag 1, enzymatiskt lyft subkonfluenta hiPSCs (vanligtvis odlas på MEF, eller hiPSCs odlas i definierade medier såsom TeSR 18 på Matrigel) från plattan så stora kolonier med hjälp 1 mg / ml kollagenas IV i DMEM / F12.
    OBS: Efter 1-2 timmars inkubation vid 37 ºC, kommer kolonier häng i skålen.
  4. Tvätta försiktigt hiPSC kolonier (genom sedimente, inte centrifugering) 1-2x med DMEM / F12, återsuspendera i 2 ml / brunn av N2 / B27 media (tabell 1) och överföring till icke vidhäftande 6-brunnar (kombinera 3-brunnar i 1 -Jo) 19.
    OBS: Övernattning, kommer kolonierna bildar flytande sfäriska kluster kallas "embryoidkroppar" (EBS). Räkna med betydande celldöd.
  5. Dag 2, tilt plattor och låta EB sedimentera. Ta försiktigt bort media och tvätta en gång med DMEM / F12 för att ta bort skräp. Foder med N2 / B27 media kompletterade med dubbla Smad hämmare (0,1 M LDN193189 och 10M SB431542) 12
  6. På Days 3-7, kommer neuralization uppstå i samband med dubbla SMAD inhibition; Kontrollera att EBS är runda men inte cystisk. Feed EB varannan dag med N2 / B27 medier kompletterade med 0,1 M LDN193189 och 10M SB431542.
  7. På Days 7-14, efter plätering av EBS till Poly-L-ornitin / laminin belagda plattor, kontrollera med en bright mikroskop som neurala rosetter börja visas inom några dagar (karaktäriseras som runda kluster av neuroepiteliala celler med apico-basala polaritet; Figur 1). Fortsätt att mata vidhäftande EB varannan dag med N2 / B27 media kompletterat med 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 och 1 g / ml laminin.

2. Skörd av Neural rosetter

OBS: Vi rekommenderar att neurala rosetter enzymatiskt skördas med Neural Rosette selektionsreagenset 20 eller liknande val reagens. Även neurala rosetter kan manuellt plockas in i 6-brunnars poly-L-ornitin / lamininbelagda plattan, this metodik tar omfattande utbildning till mästare, och, beroende av användarens skicklighet, kan kräva en andra omgång av plocka på dagen 20 för att ytterligare anrika NPCs och utarma icke-neurala celltyper.

  1. För enzymatisk urval av neurala rosetter vid dag 14, aspirera media från vidhäftade EB och tillsätt 1 ml neurala rosett urvals reagens per brunn för en 6-brunnar. Inkubera vid 37 ° C under 1 h.
  2. Med en P1000 pipetman, försiktigt bort enzym från varje brunn. Tillsätt 1 ml DMEM / F12 per brunn för att tvätta.
  3. Med en P1000, samla de 1 ml av DMEM / F12 och snabbt utvisa den DMEM / F12 tillbaka i brunnen, härvid lossnar rosett från plattan. Samla rosetter i en falk rör.
  4. Pipet ytterligare 1 ml DMEM / F12 och snabbt utvisa i samma väl att lösgöra återstående rosetter. (Inte mal sönder. Försök att inte bryta upp rosett aggregat). Samla neurala rosetter i samma falk rör.
  5. Upprepa steg 2,4 efter behov. Om rosetter inte lossnar lätt, lägg more enzym och upprepa processen (steg 2,1-2,4)
  6. Snurra cellerna vid 300 xg under 3 min. Aspirera tvätt, och återsuspendera rosetter i 2 ml NPC medium (tabell 1). Överför celler (1: 1) i en poly-L-ornitin / lamininbelagda 6-brunnars platta.
  7. Från Dagar 15-21, kommer de neurala rosetter expandera; foder rosetter varannan dag med NPC medier.
  8. Utvärdera kvaliteten på de neurala rosetter och se till att platta fibroblastliknande celler inte expanderar inom kulturen.
    OBS: Om icke-rosetter kvarstår, kan NPC kulturen ibland räddas genom manuell plockning, välja endast de bästa av de plockade rosetter i Accutase. Dissociera 15 minuter vid 37 ºC. Pellet, tvätta och plattan i NPC mediet till 24-brunnars poly-L-ornitin / laminin belagda plattan.

3. Utbyggnad av neurala stamceller

OBS: hiPSC NPC kan odlas på antingen Matrigel- eller poly-L-ornitin / laminin belagda plattor. Vi använder vanligtvis MatrigeL-plattor, eftersom de kan framställas snabbare och till lägre kostnad.

  1. För att framställa Matrigel-belagda plattor, snabbt tina och återsuspendera en 1 mg fryst alikvot av Matrigel i 24 ml kall DMEM / F12 och omedelbart distribuerar 2 ml till varje brunn i två sex-brunnars plattor. Inkubera i minst 1 timme vid 37 ºC.
    OBS: Matrigel behöver bara sugas, tvättat, omedelbart före användning.
  2. Feed NPCs varannan dag och hålls kvar vid mycket hög densitet eller de kommer spontant differentierar till neuroner.
    OBS: Även mer etablerade NPC typiskt split 1: 4 varje vecka, kan mycket låga passage NPC delas 1: 2 så sällan som en gång varannan vecka.
  3. För att dela, första aspirera media och tillsätt 1 ml varm Accutase (1X) per brunn av 6-brunnar. Inkubera vid 37 ° C i 10-15 min.
  4. Överföra Försiktigt lösgjorda celler i ett 15 ml rör innehållande DMEM / F12 med så liten mekanisk påfrestning som möjligt. Inte titrera celler medan enzym. Pelletera celler genom spinning vid 1000 xg under 5 minuter.
  5. Aspirera tvätt, och slamma NPCs i ~ 1 ml NPC medier per ursprunglig väl av 6 brunnar.
    OBS: Räkna att ett konfluent brunn i en 6-brunnsskål har 5-10.000.000 celler; detta kan bekräftas genom räkning en 10l alikvot av celler med användning av en hematocytometer före åter plätering.
  6. Efter resuspension, återplatt NPCs som NPC, nervceller eller neurosfärer. För att bibehålla NPC, plattan ungefär 1-2 miljoner celler per brunn i en 6-brunnsplatta. Effektiviteten av neurosfärbildning kan variera mellan experiment och cellinjer, men i allmänhet sker bäst om mellan 200.000 och 1.000.000 celler ympas per brunn i en icke vidhäftande 6-brunnars platta; om klumpning av neurosfärema inträffar, minska antalet celler seedade. För att skilja på nervceller, platta cirka 200.000 celler per brunn på en 6-brunnar, ersätter NPC media med Neuron medier.
  7. Immunohistokemiskt validera varje etablerad NPC linje. När tillräckligt cellmaterial har expanded, etikett NPCs med antikroppar för nestin och Sox2. Validerad NPC linjer bör också differentieras till neuroner i 4-6 veckor, och märkta med antikroppar för III-tubulin och MAP2ab.
    1. Fix celler i 4% paraformaldehyd i PBS vid 4 ° C under 10 min. Permeabilize NPC vid RT under 15 min i 1,0% Triton i PBS, och sedan blockera i 5% åsna serum med 0,1% Triton vid RT i 30 min.
    2. Inkubera med primär antikropp i 5% åsna serum med 0,1% Triton, natt vid 4C.
      OBS: Vi rekommenderar följande antikroppar: get anti-Sox2, 1: 200; mus-anti-human-nestin, ett: 200; kanin anti-βIII-tubulin, 1: 500; mus-anti-βIII-tubulin, 1: 500; mus anti-MAP2ab, 1: 200. (Figur 2).
    3. Efter en tvätt med PBS, inkubera sekundära antikroppar celler med lämplig konjugerad sekundär antikropp till get, mus eller kanin vid 1: 300, i under 5% åsna serum med 0,1% Triton under 1-2 timmar vid RT. Att visualisera kärnor, fläckceller med 0,5 mikrogram / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) och sedan montera med Vectashield.

4. NPC Transduktion

  1. Använd spinfection (centrifugering av cellodlingsplattor i närvaro av virus vid 1.000 xg under 1 timme) för att öka andelen transfekterade celler 21. Aspirera media och ersätt med relevant överuttryck (eller kontroll) lentivirus (eller retrovirus), titreras till önskad mångfald av infektion (MOI) (typiskt 1-10), utspädd i NPC media. Använd 1,5 ml volym per brunn av en 6-brunnsplatta (eller en lämpligt skalad volym för andra typer av vävnadsodlingsplattor). Centrifugera vid 1000 x g och 37 ° C i en timme i en plattcentrifug.
    OBS: Helst transduce NPCs med lentiviral eller retrovirusvektorer inom 1-2 dagar delning. Oavsett om du använder kommersiella eller laboratorie förberedda virus, kan det vara bra att på lämpligt titrera partier av virus i förväg genom seriespädning. (Figur 3).
  2. För att minska cellular död, byt media inom 8 timmar för spinfection.
    OBS: Viral integration och transgenexpression bör upptäckas inom 24 timmar från reportergenen fluorescens. (Om viruset saknar en fluorescerande reporter, är detta svårare att bedöma, framgångsrik transfektion kan bäst valideras av immunoblot, immunohistokemi eller qPCR för överuttryck produkter.) Hela uttryck kan ta 3-7 dagar; upprepade spinfections med ytterligare virus kan krävas för att öka andelen transfekterade celler. Återkommande spinfections kan uppstå dagligen men behöver inte vara så vanliga. Helst om du använder en fluorescerande reporter,> 80% av cellerna bör märkas.

5. neurosfär Migration Assay

OBS: Neurosfärer bildas spontant, efter den enzymatiska dissociation av NPC (genom ett sätt som är identiskt med det som användes i NPC expansion - steg 3,3-3,6), om celler odlas i suspension i NPC medier.

  1. I korthet växa dissocierad NPC i NPC medier för 48 h i ickeadherenta plattor i syfte att generera neurosfärer. (Figur 4).
  2. För neurosfär migrering, förbereda färskt Matrigel plattor av kall NPC medier snarare än DMEM, i en 96-brunnars platta, 1-2 h före neurosfär plockning. Inte aspirera Matrigel från brunnarna.
  3. Som ursprungligen publicerat för embryonala stamceller som härrör neurospheres 22, manuellt plocka NPC-härledda neurospheres under ett mikroskop, efter tvätt en gång i NPC media för att avlägsna cellrester. Överför en neurosfär i varje brunn på en Matrigel-belagda 96-brunnsplatta.
  4. Tillsätt ytterligare 0,5 mg Matrigel, utspätt i kall NPC medier, till neurosfärerna i varje 96-brunnars platta.
  5. Centrum manuellt varje enskild neurosfär i mitten av brunnen med användning av en pipettspets.
    OBS: Det är viktigt att plocka neurospheres av liknande storlek, för att minska variationen i resultaten.
  6. Låt migrering inträffa under 48 timmar och sedan fixa celler wed 4% paraformaldehyd och fläcken med önskade immunhistokemiska markörer.
  7. Om radiell migration skall bestämmas, fotografera neurospheres i sin helhet med hjälp av en 4x mikroskopobjektiv. Uteslut eventuella neurospheres kontakt kanten av brunnen eller en andra neurosfär från analysen.
    OBS: Om migration sker längre än 48 timmar, kommer den resulterande radiella migration sannolikt vara för stor för att bilden med en 4x mål.
  8. Mät genomsnittliga migrering från varje neurosphere använder NIH ImageJ programvara (Figur 5). Detta kan göras genom att använda någon av de analysmetoder som beskrivs nedan:
    1. Radial migration:
      1. Spåra manuellt kanten av de längst migrerar celler med frihand markeringsverktyget och använd sedan Mät funktion (Ctrl + M) för att beräkna arean av den resulterande form. Innan mätning området se till att Area kontrolleras i SET Mätningar fönstret under fliken Analysera. Användvärdet av området mätning och ekvationen för arean av en cirkel (A = πr 2) för att bestämma radien (yttre).
      2. Trace kanten av den ursprungliga neurosphere, mäta området och beräkna radien (inre) på samma sätt. Beräkna den totala radiella migration som skillnaden mellan det yttre och inre radier.
    2. Greatest cellulär migration:
      1. Mät avståndet flyttas av de fem mest avlägsna celler från kanten av inner neurosphere använder linjärt markeringsverktyg följt av Measure-funktionen (Ctrl + M).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neurala rosetter kan identifieras morfologiskt, med hjälp av en ljusfältsmikroskop, med deras karakteristiska utseende som runda kluster av neuroepiteliala celler med apico-basal polaritet (Figur 1). Även NPCs är vanligtvis odlas vid mycket hög celltäthet, omedelbart efter passage, är något pyramidformad soma och bipolär neurite struktur synlig (Figur 1D). Validerade NPC uttrycka nestin och Sox2 i flertalet celler, men III-tubulin färgningen är också synliga i alla NPC populationer, vilket indikerar att en viss andel av NPC ständigt initiera neuronal differentiering inom odlingen (figur 1F). Markörer för neurala stamceller, såsom Sox2 och Pax6, och framhjärnan neuronala progenitorceller, såsom TBR2, uttrycks också i NPC, medan mitthjärnan markörer såsom Lmx1a och FOXA2 inte (Figur 1G-I). En betydande del av stora och plana fibroblastliknande celler inom en NPC befolkning visar att dålig kvalitet NPCs har genererats, vilket är osannolikt att ge ett stort antal nervceller efter neuronal differentiering (Figur 2).

Efter framgångsrika transduktion med en hög titer lentiviral eller retroviral vektor, bör mer än 80% av cellerna märkas med fluorescerande reporter som ingår i vektorn (Figur 3). Neurosphere generation bör ge en population av neurosfärer med relativt homogen storlek (Figur 4), vilket, med regelbunden utfodring, kan förbli friska i kultur i ungefär en vecka. Neurosphere migration sker kraftigt i friska neurospheres (Figur 5), och hiPSC NPCs genomgår snabb differentiering under en neurosphere migrationsanalys 1.

Figur 1

tält "> Figur 1. Patientspecifika hiPSCs, NPC och nervceller. bright bilder av hiPSC neural differentiering, från hiPSCs (A), till embryoidkroppar (B), neurala rosettes (C), NPC (D) och neuroner (E) ... 100x, skal bar 100 um FI hiPSC NPC är positiva för ett antal framhjärnan neurala stamceller och neurala progenitorceller cellmarkör, inklusive NPC markören nestin (grön) och den neuronala markören III-tubulin (rött) (F); den neural stamcell transkriptionsfaktörer Sox2 (grön) och Pax6 (röd) (G), och framhjärnan progenitorceller markör TBR2 (röd) (H); men inte mitthjärnan markörer Lmx1a (grön) och FOXA2 (röd) (I). DAPI-färgade kärnor (blå). 100x, skal bar 100 nm. J. NPCs kan differentiera till 70-80% III-tubulin-positiva neuroner (grön) och 20-30% gliafibrillärt surt protein (GFAP) -positiva astrocyter (röd). 200x, skal bar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2

Figur 2. Validera NPC Lines. Hög kvalitet (överst till vänster) hiPSC NPC uttryck nestin (röd) och Sox2 (grön). i de flesta celler (kärnor färgade med DAPI (blå)), medan låg kvalitet (nedtill till vänster) NPC har fläckar av Sox2-negativa och nestin-negativa celler (höger). 4 veckor gamla nervceller differentierade av hög kvalitets NPCs uttrycker MAP2ab (grön) och III-tubulin (röd) (överst till höger), men de skiljer sig från låg kvalitet NPCs inte (nere till höger). 100x, skal bar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3

Figur 3. Viral Transduktion av NPCs. Bright (överst) och GFP fluorescerande (nederst) bilder av hiPSC NPCs före (vänster) och efter viral spinfection. 100x, skal bar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4

Figur 4. neurosphere Formation. Bright bilder av vidhäftande NPCs (vänster) och nybildade neurospheres (höger). 100x, skal bar 100 nm. Klicka här för att se en larGER version av denna siffra.

Figur 5

Figur 5. neurosphere Migration. AB. Bright bilder av neurosfärer före (A) och efter (B) 48 timmar om migration i Matrigel. 100x, skal bar 100 nm. CG. Skärmdump bilder som visar analysmetodiken för radiell neural migration använder NIH ImageJ programvara. Klicka på "frihand markeringar" på ImageJ verktygsfältet (C). Trace kanten av längst migrerade cellerna runt neurospheres (D). Se till att Area kontrolleras i Set Mått fönstret (E) den. Använd Mät funktion (Ctrl + M) (F). Trace kanten av de ursprungliga neurosfärema (G) och använd Mät funktion (Ctrl + M). Mätningar kan sedan exporteras till Excel för analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Media Komponenter
HES medier DMEM / F12 (Life Technologies # 11330)
20% KO-Serum Byte (Life Technologies # 10828)
1x Glutamax (Life Technologies # 35050)
1x NEAA (Life Technologies # 11140)
1x 2-merkaptoetanol (55mm 1000x) (Life Technologies # 21.985-023)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies 13.256-029)
N2 / B27 medium DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17.502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12.587-010)
NPC medier DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17.502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12.587-010)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies)
1 mg / ml Naturlig muslaminin (Life Technologies # 23017-015)
Neuron medier DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17.502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12.587-010)
1 mg / ml Naturlig muslaminin (Life Technologies)
20 ng / ml BDNF (Peprotech # 450-02)
20 ng / ml GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 | ig / ml dibutyryl cyklisk-AMP (Sigma # D0627)
200 nM L-askorbinsyra (Sigma # A0278)

Tabell 1. Medie recept.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit metoder genom vilka att skilja hiPSCs till NPC, en neural celltyp där en betydande andel av genen undertecknande av hiPSC-härledda neuroner bevaras och som kan fungera som en proxy för utvecklingsvägar potentiellt bidrar till sjukdoms patogenes 8, 11. Dessutom, som vi har detaljerade, NPCs är en robust replika och enkelt omvandlade neurala befolkningen, vilket vi tror kan vara lämpliga för molekylära och biokemiska studier av sjukdoms anlag.

Även om vi har detaljerade metoder för att differentiera och kultur framhjärnan mönstrade NPC, kan de enkelt anpassas för att generera NPCs mönstrade till andra cell öden. Till exempel, om flytande EB först behandlas med 0,5 mg / ml DKK1, 10 mM SB431542, 0,5 mg / ml Noggin och 1 mM cyklopamin, hippocampus NPC kommer att genereras, vilka kan expanderas i NPC medier och differentieras i neuronala medium kompletterat med 20 ng / ml WNT3A 7 12,23. Med tanke på att de flesta subtyp specifika neuronala differentieringsprotokoll vidare via en NESTIN- och Sox2-positve mellan, vi förutspår att liknande metoder kan vara anpassningsbar för GABAergic- 2,24 och glutamatergic- 3,25,26 specifika NPC populationer.

Det finns flera viktiga steg inom protokollet värt att notera. Först, om överuttryck eller knacka ner endogen genuttryck, är det bäst att använda en kontrollvektor som uttrycker ett fluorescerande protein från samma virus ryggraden, som vi har observerat stora skillnader i florescence när reportrar uttrycks av vektorer av varierande storlekar (på grund till minskad förpackningseffektivitetmed vektorstorlek) eller med skillnaden tagare (på grund av skillnader i promotoreffektivitet). För det andra, rekommenderar vi att fylla viral transduktion före neurosphere bildning, som vi har observerat dålig penetrans av virala vektorer i den täta neurosphere strukturen. För det tredje, eftersom passagen antalet NPC ökar över passagen tio, ofta ser vi betydligt försämrad migration i neurosphere analysen. I själva verket, med tanke på benägenheten hos NPC för att ge en större andel av astrocyter med passagen, är det viktigt att matcha passagen av NPC linjer i varje experiment.

Slutligen är det viktigt att beakta de biologiska och tekniska begränsningar hos de tekniker som beskrivs. Även NPC tycks vara morfologiskt lika med ögat, de är en heterogen population bestående av celler med förmåga att generera både glutamaterga och GABAerga neuroner. Medan vi observerar anmärkningsvärt konsekvent framhjärnan mönstring av NPC linjer mellan individer använder denna metod 1, detta är bara när man jämför fullt validerade högkvalitativa NPC linjer - det finns betydande skillnader mellan bra och dålig kvalitet NPC linjer. Dessutom virala transduktion utbyten genetiskt heterogena celler, var och en med en integrering av den virala vektorn vid en unik genomisk plats; Därför kommer enskilda celler varierar både i läge och antalet genomiska integrationsställen. Mer konsekventa förändringar i genuttryck kommer alltid uppstår när genmanipulation är riktad till en exakt och definierad plats, oavsett om det sker genom zinkfinger, Talen eller CRISPR baserade strategier.

Patient hiPSC härrör NPCs kan användas för att studera både de globala genuttryck störningar förekommer i neurologisk sjukdom och även de molekylära och / eller cellulära effekter av att manipulera gener eller mikroRNA i samband med antingen friska eller sjuka patientgenererade neurala celler. På detta sätt, konsekvenserna av att manipulera en eller flera nyckelrisk allel (er) kan karakteriseras i samband med olika genetisk bakgrund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18, (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21, (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11, (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics