Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada, biz yaşam içine ultrason mikrokabarcık kontrast maddeler, izole geç gebelik sahne kemirgen embriyolar enjekte etmek için bir protokol mevcut. Bu yöntem perfüzyon parametrelerinin ve kontrastlı yüksek frekanslı ultrason görüntüleme kullanılarak embriyo içinde vasküler moleküler belirteçlerin çalışma sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kontrastlı ultrason görüntüleme görselleştirmek ve damar ortamı karakterize etmek kabarcık kontrast maddelerin kullanımını kolaylaştırır. Bu ajanlar mikrosirkülasyon, damarlanma ve kardiyovasküler fonksiyonu noninvaziv değerlendirmesini sağlar. Buna ek olarak, baloncuk yüzeyinin modifikasyonu mümkün vasküler olay moleküler ultrason görüntüleme yapmak anjiyojenez, ateroskleroz ve inflamasyon 1,2 klinik öncesi uygulamalarda gösterildiği gibi, endotelyal biyolojik bağlanma hedeflenen mikro-sonuçlanabilir. Kontrastlı ultrason nedenle de sağlıklı ve hastalıklı damar durumları 3-5 etkileyen karmaşık ve çeşitli ortamlar belirlemek için kullanılabilir.

Yıl geçmiş sayıda, kabarcık görüntüleme programı ilgi yönlü fare embriyo modeli genişletmiştir. Memeli bir gelişme modeli olarak, embriyonik damar içine kabarcıkların giriş fizyolojik artırırGelişmekte olan dolaşım sistemi (örneğin, kan akımı, kardiyak output) ve transgenik durumlarda ve kalp hastalığı 6,7 hedeflenen mutant fare modellerinde, çalışma kardiyovasküler fonksiyonu nasıl değiştirdiğini genetik faktörler anlayışlar verebilir. Aslında, nicel ve nitel 2D embriyonik beyin damar analizleri zaten 8 elde edilmiştir. Bundan başka, fare embriyosu canlı dokuda vasküler belirteçlerle hedeflenen mikro-kabarcıklar bağlanmasının incelenmesi için mükemmel bir model olarak sunulur. Bartelle ve diğ. 9, örneğin, Biotag-BirA transgenik embriyo bağlanma ve damar anatomisinin incelemek hedeflenen değerlendirir embriyo kalp ventriküllere, avidin mikro-kabarcıkları getirmiştir. kliniğe Bu teknik çeviri önemli bir kriter - heterozigot ve homozigot fare modelleri üretimi de moleküler ultrason kantitatif tabiatının belirlemek amacıyla yapılan tümör modeli araştırmaları için bir vekil olarak kullanılabilir edilebilir.

8-10 aracılığıyla maruz tek embriyo içi kardiyak enjeksiyonlar aracılığıyla embriyonik dolaşıma tanıtıldı. utero enjeksiyonları Ancak, bir takım zorluklarla karşı karşıya. Bu enjeksiyon rehberlik, anne ve batın embriyo hareketi karşı ihtiyacını, anne hemodinamik canlılığının bakım ve 11 kanama nedeniyle anestezi ve komplikasyon uzun vadeli etkileri ele batın embriyolar içerir. Bu nedenle, soruşturmanın amacı izole yaşayan geç evre embriyoların 12 içine mikrokabarcıkları enjekte için bir teknik geliştirmek oldu. Bu seçenek, enjeksiyon kontrol ve konumlandırma, tıkanma olmadan görüntüleme uçağın tekrarlanabilirlik ve basitleştirilmiş görüntü analizi ve ölçümü açısından daha fazla özgürlük sunuyor.

Bu çalışmada, biz fo yaşayan kemirgen embriyolara kabarcıkların enjeksiyon için yeni bir prosedür anahatr kabarcık kinetik davranışları okuyan ve amaçları endojen endotel yüzey belirteçleri bağlayıcı Kabarcığa hedeflenen Derslerinizi. Lineer olmayan bir kontrast özel ultrason görüntüleme tepe geliştirilmesinde uygulanmıştır (PE), yıkama-oranı ve süresi izole E17.5 embriyolar (TTP) tepe dahil olmak üzere temel perfüzyon bir dizi parametre ölçülmesi için kullanılır. Bu, aynı zamanda, aktif bir anjiyojenez 13 bölgelerinde damar endotel hücrelerinde yüksek ifade için endoglin klinik olarak anlamlı bir hedef işlev transjenik fare modeli, bir embriyonik endoglin kaybına moleküler ultrason kantitatif tabiatının değerlendirmek için embriyo modelinin geçerliliğini göstermek . endoglin hedefli (MB E) fare izotip IgG2 kontrol (MB C) ve hedefsiz (MB U) mikro-kabarcıkların yapışma heterozigot endoglin (İngilizce +/-) ve homozigoz endoglin (İngilizce + / +) sentezleyen embriyolar değerlendirilir. Hedeflenen bindinin analizing moleküler ultrason endoglin genotipleri arasında ayırt ve ölçülebilir moleküler ultrason seviyelerine reseptör yoğunlukları ilgili yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu çalışmada gerçekleştirilen deneysel prosedürler Hayvan Bakım Sunnybrook Araştırma Enstitüsü Komitesi (Toronto, Ontario, Kanada) tarafından onaylanmıştır. Hayvanların insancıl için prosedürler her zaman dikkat edilmelidir. Bu araştırmacı bir ultrason görüntüleme sisteminin temel operasyonda eğitimli olduğu varsayılır. Bu protokol, iki kişi ile iyi çalışır.

1. Hayvan Modelleri

  1. Mate CD-1 erkek ve dişi Mus musculus perfüzyon çalışmaları için vahşi tip embriyolar elde etmek.
  2. Bourdeau ve ark. 14 tarafından tarif edildiği gibi moleküler görüntüleme çalışmaları için, 129 / Ola kökenli embriyonik kök hücreleri kullanılarak, homolog birleştirme yoluyla, Eng +/- fareleri üretmek.
    1. Geri çaprazlama B6- Eng +/- fareler, nazik, CD-1 arka Dr. Michelle Letarte elde. Kullanım Eng +/- CD-1 çaprazlanmış embriyoları, aynı zamanda bunların İng + / + yavru kontrols. Sahnelenen embriyolar üretmek için fareler Mate.

2. Deneysel hazırlanması

  1. Farelerin çiftleşme başlatın ve günlük fişlerini kontrol edin. Embriyonik gün 0.5 vajinal fiş görülmektedir günün öğleden olarak tanımlanır.
  2. 500 fetal sığır serumu, 50 ml, 5, 1 M HEPES ml Penisilin-Streptomisin ve 5 ml (10.000 birim penisilin, 10,000 ug streptomisin) eklenerek embriyo ortamı hazırlamak mi Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı, yüksek glikoz (DMEM) (4,500 mg / L). Folyo şişe sarın ve 4 ° C'de soğutulmuş tutmak.
  3. 20 dakika için 140 xg'de 50 ml konik tüpler santrifüj net ultrason jeli. 30 ml'lik şırınga içine jel çizin. Fosfat tamponlu tuz (PBS) ve bir kenara ek (işaretli) 30 mi şırınga doldurun. Embriyoların biri çöp genellikle ultrason jeli 2-3 şırınga ve PBS 4 şırınga arasında gerektirecektir.
  4. Yaklaşık 30 cam iğneler çekin ve hamuru bir şerit bağlamak hafifçe100 x 20 mm hücre kültür kaplarına. Bu iğneler ayrıldı ve kullanım sırasında güvenli olmasını sağlar. Isıtıcı 77, Alt mıknatıs 55, Ana mıknatıs 70: cam çektirmenin kullanarak, filamanın 1 x 90 mm cam kılcal aşağıdaki ayarları kullanın.
  5. Baz için sertleştirici 8 hacim oranı: 1 kullanılarak, (kendi çanak alacak bir çöp içinde her embriyo sağlamak için yeterli) 10-12 diseksiyon tabak hazırlayın. 50 ml'lik bir konik tüp içine baz 40 ml dökün. 5-6 ml kür ajanı ekleyin ve tahta sopa ile karıştırın.
    1. Yaklaşık yarısına her bir doldurma, 60 x 15 mm kültür çanakları içine dökün. Stand O / N ayarlamak için izin ver.
  6. (: 0.79 mm iç çap) polivinil klorür (PVC) boru 400 mm uzunluğunda parçalara kadın dişlerde takın. boru rahatça ultrason aşamasına şırınga pompası ulaşmak gerekir.

3. Deney Seti-up

  1. 3B motor ve doğrusal dizi 21 MH cerrahi mikroskop altında görüntü platformu düzenlemekz dönüştürücü.
    1. Orient platformu ray monte böylece mikroskop altında doğrudan konumlandırılmış Evre, sol açık.
    2. Platformun uzanan kolunun topu eklem 3D motoru takın. Ileriye dönük, motorun monte hızlı sürümde dönüştürücü kelepçe hızlı bırakma sonrası Vida ve mandalı tespit, kelepçe dönüştürücü kafa yerleştirin.
    3. Arabanın ön panelindeki etkin limanda dönüştürücü konektörü sabitleyin. Makineyi açın.
  2. Moleküler görüntüleme çalışmaları için 'kardiyoloji' ayarı seçerek, 21 MHz ultrason dönüştürücüyü başlatın ve perfüzyon çalışmaları için 'genel'. Tam orta pozisyona her zaman kazanç-tazminat sürgü Shift. Sıklığı: 'Kontrast Modu' için, aşağıdaki parametreler ayarlanmalıdır 18 MHz, güç iletimi: 30 dB, Foci:% 4, (0.39 Mpa), Kazanç Kontrast Doğrusal Olmayan, Burst zamanı: 6 & 10 mm, Mod Kontrast 100% 0,1sn, Işın genişliği: Geniş.
  3. Kısım 40 mi embriyo ortam dört adet 50 ml konik tüp içine, her. Buz üzerine yerleştirin.
  4. Sıcak bir plaka üzerinde, bir 2 L'lik bir kap içinde su 1 L ısıtın. 45 ° C'de muhafaza edin. Ön ısıtmak için bir deney şişesine ultrason jel ve PBS, bir şırınga ekleyin. Her zaman bir termometre ile takip ederek bu sıcaklığı korur.
  5. Oniki 1 ml şırınga ve kabarcıkların enjeksiyonu için on 21 oniki G iğne kenara on ayarlayın.

4. Cerrahi Prosedür

NOT: Cerrah cerrahi prosedür başlar iken bir asistan kabarcıklar (evre 5) hazırlamak var. Burada açıklanan protokol Whiteley ve ark adapte edilmiştir. 15

  1. Servikal dislokasyon aşağıdaki hamile bir dişi fareden E16.5 veya E17.5 embriyolar toplayın.
    NOT: embriyoların anestezi etkileri henüz detaylı 16 incelenmemiştir. Dekapitasyon içeren ek yöntemler, uygun op olabilirHamile farelerin kurban ları.
    1. Rahim ve embriyoların ortaya çıkarmak için karın açmak kesin. Dikkatle ve hızlı bir şekilde (yumurtalık ve rahim damarlarının koparılması) uterus boynuzları ucunda kesme ve vajina ve mesane de kesilmesinin rahim kaldırmak.
    2. Kıymık forseps kullanarak, embriyo zarar vermeden mümkün olduğunca çabuk buz soğuk embriyo medya 40 ml tüp rahim aktarın. Fare karkas atın.
  2. Mikroskop ve sahneye taşınmaya. 100 x 20 mm hücre kültürü çanak içine rahim yatırın. 50 mi taze embriyo ortamı ile doldurulmuş yeni bir çanak içine rahim aktarın.
  3. Yavaşça gözyaşı ve bir ucunda başlayan rahim dış membranlar uzak çekin, sterilize (% 70 etanol sprey) ince forseps kullanarak. Plasental desidua, parietal sarısı kesesi ve ayırmak ve altta yatan visseral yolk kesesi kaldırmak için Reichert membran Açığa.
  4. Visseral y tutarak, tek tek embriyolar parçalara ayırolk keseler sağlam ve yavaşça mümkün olduğu plasenta 17 taşıma. Embriyolar hemen dışarı pop gibi yumurta sarısının rüptürü önlemek için dikkat edin.
    1. Taze embriyo medya ile buz üzerinde muhafaza başka yemeğe embriyolar taşımak için delikli kaşık kullanın. Ihtiyaç kadar soğutulmuş embriyolar tutun. Embriyo çanak her 1-1.5 saat ortamı değiştirin. Bu koşullar ile embriyolar diseksiyon sonra 4 saat boyunca yaşayabilir.

5. kabarcık Hazırlık

NOT: Her iki hedefli ve hedefsiz mikrokabarcıkları kullanarak ultrason ile moleküler görüntüleme gerçekleştirin. I) antikor hedeflenen mikro-kabarcıklar, ii) Kontrol izotip antikor hedeflenen microbubbles ve iii) hedefsiz microbubbles: Tek deney gibi birçok 3 olarak mikro kabarcık ayrı şişeleri gerektirebilir. Kontrast madde, bir kuru-dondurma bir toz halinde gelen ve enjeksiyondan önce serum fizyolojik ile yeniden gerekir. Her hedefsiz microb içinde ~ 2 x 10 9 mikro kabarcıklar vardırubble şişe ve • hedef hazır şişelerde 8.8 x 10 8 mikrokabarcıklar. mikro-kabarcıklar yeniden sonra 3 saat boyunca stabildir.

  1. Hedef Hazır Şişelerinin Sulandırma
    NOT: Hedef hazır preparatların örnekleri: endoglin hedeflenen mikro kabarcıklar (fare endoglin için biyotinile sıçan MJ 7/18 antikoru ile MB E; ev hibridoma tesis); vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2 (VEGFR2) hedeflenen mikro-kabarcıklar (MB V, biyotin, anti-fare CD309 ile birlikte); Sıçan izotip IgG 2 kontrol antikoru hedeflenen mikro kabarcıklar (MB C, biyotin sıçan isotip IgG 2 kontrol fare IgG2a hedefleme).
    1. Tuz 1 ml antikor çözeltisi (20 ug) (nihai hacim) seyreltin. Buz üzerinde tutun.
    2. Tüm hava kabarcıkları kaldırarak, 1 ml serum fizyolojik ile şırınga doldurun. 21 G iğne takma, kabarcık şişenin içine yavaş yavaş çözüm enjekte.
    3. Yavaşça hava 1 ml kaldırarak, piston çekilme ve iğneyi çıkartın. Nazikçeçalkalayın. Buz üzerinde 5 dakika bekletin.
      NOT: Ultrason mikro kabarcıklar yüksek basınçlı ortamlarda altında tahrip olabilir.
    4. Zamanın geçmesinden sonra, antikor seyreltme ile yeni bir şırınga doldurun ve uygun bir şişeye ekleyin. Yavaşça çalkalayın. Karışım (şimdi 2 mi), 10 dakika boyunca bekletilir. Buz üzerinde tutun. Tam yüzey konjugasyon varsayarsak, mikro kabarcık için bağlı ligand ortalama sayısı yaklaşık 18 7,600 ligandlar / um 2.
  2. Hedefsiz Şişelerinin Sulandırma
    1. Tüm hava kabarcıkları kaldırarak, 1 ml serum fizyolojik ile şırınga doldurun. 21 G iğne takma, kabarcık şişenin içine yavaş yavaş çözüm enjekte.
    2. Yavaşça hava 1 ml kaldırarak, piston çekilme ve iğneyi çıkartın. Yavaşça çalkalayın. 5 dakika bekletin. Yukarıda tarif edildiği gibi, ilave bir 1 mL tuzlu su ekleyin. Yavaşça ajitasyon ve buz üzerinde 10 dakika bekletin.
  3. Coulter Sayma
    1. Yavaşça ~ istenen kabarcık flakon ajitasyon ve beraberlik21 G iğne kullanılarak bir 1 ml şırınga içinde çözelti 50 ul. Boş 2 ml mikrosantrifüj tüp içine mikrokabarcıkları enjekte edilir.
    2. Seyreltici 10 ml mikro-kabarcık stok çözeltisi, 10 ul örnek Pipet.
    3. Hafifçe karıştırdıktan sonra, ekim sayım (Malzeme listesi bakınız) kullanarak kabarcık nüfus yoğunluğu ve boyutu dağılımları değerlendirmek. 30 mikron diyafram kullanarak (flakon örnek başına) üç 50 ul ölçümleri en az Kont.
  4. Enjeksiyon için hazırlanıyor mikro-
    NOT: '' Embriyolar içine Mikrokabarcıkların Enjeksiyon 'zaman asistanı bu adımı gerçekleştirir (adım 6) başlatılır. Her embriyo her enjeksiyon için seçilen mikro-tipi rastgele mikro-her türlü eşit işlem boyunca dağıtılan ancak rastgele bir sırayla verilmiştir şekilde asistan tarafından seçilecek olan, bir kez enjekte edilir. Kabarcık türü enjekte ediliyor cerrah kör olduğundan emin olun.
    1. Th belirleyin400 ul bir hacim içinde, 1 x 10 8 MB ​​/ ml'lik bir son konsantrasyon üretmek (5.3.3 ölçülen stok konsantrasyonları kullanılarak hacmi hesaplamak) için gerekli olan hazır kabarcık çözeltisi E hacmi. Boş mikrosantrifüj tüpü içine tuz karşılık gelen hacmi alikosu.
    2. Yavaşça seçilen kabarcık flakon ajitasyon ve 21 G iğne kullanılarak 1 ml şırınganın içine çözeltinin (yukarıda hesaplanan daha 50 ul büyük ~) aşırı hacmi çizin. Boş bir mikrosantrifüj tüpe mikrokabarcıkları enjekte edilir.
    3. Kabarcık stok solüsyonu gerekli hacmi Pipet ve tuzlu kana ekleyin. Pipet ucu ile hafifçe karıştırılmıştır karıştırın.
    4. 21 G iğne kullanarak temiz bir şırınga içine seyreltilmiş kabarcık çözüm çizin. İğneyi Çıkarma, şırınga hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak ve dişin ve tüp takın. Yavaş yavaş hava kabarcıklarını oluşturmak için emin boru yapma sonuna kadar çözüm itin.
    5. Enjektörler i takın20 ul bir toplam hacim için 20 ul / dakikalık bir oranda mikro-kabarcıkları dağıtmak için bir şırınga infüzyon pompası, GE. Hortumun ucuna bir çekti cam iğne takın. Enjeksiyon aşamasına yakın pompa taşıyın.

Embriyolar içine Mikrokabarcıkların 6. Enjeksiyon

  1. Rasgele seçmek ve soğutulmuş medya çanak (delikli kaşık ile) bir embriyo çıkarın. Stereoskop altında ultrason sahnede bulunan diseksiyon çanak yerleştirin ve en az vaskülarize görünen tarafı (antimesometrial tarafı) yırtılma / kesme, ince forseps ile yumurta sarısı kesesi ve amniyotik membranlar çıkarın. Bu en kolay baş bölgesine bitişik bir alana delinmesi ile elde edilir.
    1. Içinde embriyo kaldırmak için yeterli, ama artık kesin. Hamuru küçük parçalar kullanılarak diseksiyon yemekleri stabilize.
  2. Yavaşça embriyo yerinden kese manevra. Plasenta ile, yan embriyo yerleştirin veönünde göbek gemiler. Yumurta sarısı kesesi aşağı pin, böcek işaretçilerine Kullanma (4 pim önerilir) ve gerekli plasenta kenarları yerine sabitlemek için. Büyük damarları kaçının.
  3. Embriyo canlandırıyor kadar önceden ısıtılmış 45 ° C PBS ile embriyo yıkayın. Göbek ven ve ilişkili vasküler ağı belirleyin. Enjeksiyon rahatça yapılabilir, böylece çanak yerleştirin.
    NOT: ısındı sonra, embriyo kan gözle umbilikal arterde pompalama, akmaya başlayacak. Akış ilk başladığında, damarlar hem gemiler hızla aynı görünen kanla, parlak kırmızı olacaktır. Göbek ven kaynaklanan dalları genellikle plasenta yüzey üzerinde göbek arter gelenler kaplaması.
  4. Embriyo canlandırdı sonra, ince embriyo etrafında (ince forseps kullanarak) herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için emin olmak, önceden ısıtılmış ABD jeli ile (ancak plasenta) kapsamaktadır. Önceden ısıtılmış PBS ile çanak doldurun.
    NOT: soluti düzeyinde bir göz atıngerektiği gibi ve PBS ve jel şırıngalar ısıtma beher yedekleme şırınga ekleyin.
  5. Diseksiyon çanak kenarında hamuru büyük bir topa cam iğne takın ve PBS içine iğne ucunu. Kadar ana dal, makul plasental diskin koryonik yüzeyinde damar seçimi, makas kullanılarak boyutuna ucu kırpın. Ucu hafif bir açıyla kesilmiş ise Enjeksiyon kolay olduğunu. Yaylı makas kenarını kullanarak cam herhangi tırtıklı kenarları çıkarın.
  6. Tüm hava iğne ucundan dışarı atılır ve mikro-kabarcıklar PBS içine serbestçe akmasına görülebilir kadar şırınga pompası kullanılarak, yavaş yavaş cam iğne içine 20 ul / dk'da mikro-kabarcık solüsyonu enjekte edilir. Pompayı durdurun ve 20 ul bir enjeksiyon hacmi için sıfırlayın. Hava enjeksiyonu sırasında embriyonun damar sistemine girmesine izin vermeyin.
  7. Plasenta yavaşça damarların birine cam iğne ucu yerleştirin ve hareketsiz olduğundan emin olun. Stere savurOscope baş ve pozisyon embriyo üzerinde dönüştürücü. Görüntüleme başlatın.

7. Ultrason Moleküler Görüntüleme

NOT: Daha önce ayarlanmış kontrast doğrusal olmayan görüntüleme koşulları kullanarak, embriyo 6 ve 10 mm odaklar arasında eşit bulunmaktadır böylece dönüştürücüyü yerleştirin. Bir kez yerleştirilmiş, kabarcıkların bolus enjeksiyonu başlar. Enjeksiyon tamamlandığında, zaman ölçeri başlat.

  1. Perfüzyon Görüntüleme
    1. Doğrusal olmayan kontrast modu için kare sayısı 'çalışma yönetimi' düğmesine basarak ve çalışma Tarayıcınızın üst kısmındaki 'Prefs' sekmesini tıklayarak seçili olduğundan emin olun. 'Tercihler' penceresinde uygun kutuyu işaretleyin.
    2. Doğrusal olmayan görüntüleme başlatarak görüntüleme ayarlarını yapın. Kontrol panelinde 'kontrast modunu' düğmesine basın. 'Kazanç & # ayarlayarak 2B kazanç daraltın8217; 30 dB dial 'güç' dial kullanarak% 4 güç azaltmak, 'frekans' çevirmek ve geniş rulo top / fare kullanarak ışın genişliği (sol alt köşe) set kullanarak 1 Hz frekans azaltmak.
      NOT: Tüm kontroller ultrason sisteminin kontrol panelinde yer almaktadır.
    3. 1 Hz kare hızında bir 20 dakika sine döngü kaydederek kabarcık bolus tüm yıkama-in ve dağılımı yakalayın. Basın tarama / donma veri toplama başlatmak için.
    4. Görüntülerin tam sırası yakalanan edildikten sonra, sistem tampon görüntülerin sırasını kaydetmek için kontrol panelinde bulunan 'sine mağazası' düğmesine basın. Sistem edinilen doğrusal olmayan kontrast modeli veri tarih damgalı sine döngü oluşturur.
  2. Hedeflenen kabarcık Görüntüleme
    1. 'Prefs' altında, 0.1 sn patlama saati ayarlayın. Denetimleri des kullanarak uygun görüntüleme parametrelerini ayarlayınyukarıda açıklanan şekilde (7.1.2.).
    2. Kontrol panelinde 'kontrast modunu' düğmesine basarak doğrusal olmayan kontrast görüntüleme başlatın. Embriyo düzgün transdüser altında ve embriyo ile kabarcık kontrast madde akışı doğrusal olmayan kontrast modunu görüntüde görünür olduğunu almaktadır olun.
    3. Embriyonik moleküler görüntüleme sırasında bağlayıcı hedefe Kabarcığa değerlendirmek için, mikro-kabarcıkların 3 dakika enjeksiyonundan sonraki 40 saniye boyunca rahatsız edilmeden dolaşmasına izin verir. Bu kez dolaşımdaki mikro-kabarcık tutma sağlamaktır. Basın 'tarama / dondurma' Bu süre içinde görüntüleme durdurmak için.
    4. 3 dakika ve 40 saniyede, özgeçmiş görüntüleme embriyo yeterince PBS ile kaplıdır, hala görünür olduğunu doğrulamak için, ve mikro kabarcıklar dolaşmaya devam ettiğini. Basın 'tarama / dondurma' görüntüleme başlatmak için.
    5. Bir 'ön-destruc kaydederek 3 dk 50 sn sonrası enjeksiyon de bozulma / ikmal dizisi Edinme29 Hz yon 'akustik tepki dizisi. Basın 'tarama / dondurma' veri toplama başlatmak için. 4 dakika sonrası enjeksiyon 18,19 itibariyle, 0.1 sn yüksek frekanslı akustik patlaması başlatmak. Bir patlama uygulamak için 'patlama' düğmesine basın.
    6. (Tampon hattı dolana kadar) dizisinin geri kalanı için çerçeveler kayıt ve 'sine mağaza' tuşuna basarak sine döngü kurtarmak için devam edin.
    7. Mikrokabarcıkları dolaşan bir ek cine döngü toplayın. Bu, sonraki post-yıkım 'görüntüleme dizisi ışınını doldurulan yalnızca dolaşan kabarcık sinyallerini içeren varsayılır. Basın 'tarama / dondurma' görüntüleri toplamak için görüntüleme ve 'sine mağaza' başlatmak için.
    8. Her embriyo görüntüleme sonra cine döngüler etiketleyin. Basın 'Çalışma yönetimi', rulo topu kullanarak dosyayı vurgulayın ve uygun düğmesine basın 'görüntü etiketi' ve adını '' seçin.

    Enjeksiyon sonrası Embriyolar 8. Taşıma

    1. Mesaj görüntüleme, istediğiniz gibi (başları kesilerek, servikal dislokasyon, karbon dioksit boğulma, ya da hızlı dondurma veya tespit takiben anestezi ile), dönüştürücüyü hareket embriyo sabitlemesini kaldırın ve euthanize.
    2. Sonraki her embriyo enjeksiyon için yeni bir diseksiyon çanak, iğne, şırınga ve tüp segmenti diseksiyonu ve canlanma sırasında kabarcık enjeksiyon çözümü alma yeri sonraki toplu hazırlanması, kullanılması gerekir.
    3. Ek analizler için doku örnekleri (örneğin, kuyruk, beyin) Kaydet (örneğin, izole kuyruk DNA, lacZ boyama, ya da batı blot 21 kullanılarak biyomarker ifade yarı-kantitatif tedbirler PCR analizi ile belirlenir genotiplemesi).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eski in utero fare embriyoları ultrason kontrast ajanlarının enjekte enjeksiyonu ve ilgili ultrason görüntüleme boyunca rahim ve canlılığının korunması ile ilgili oturma, geç gebelik aşamasında embriyoların başarılı bir şekilde izole bağlıdır. Embriyo batın ve Şekil 1 'de gösterildiği gibi, konumlandıktan sonra, embriyonik damar içine kontrast maddenin dikkatli bir enjeksiyon mümkündür. Bir E17.5 fare embriyo tipik bir B-kipi ultrason görüntüsü Şekil 2A'da gösterilmiştir. kabarcıkların yıkama-ve ilgili donanım alt vena kava, kalp, beyin, ve tüm hayvan ve böylece bu tekniğin uygulanabilirliğini gösteren, doğrusal olmayan kontrast görüntüleme yöntemleri kullanılarak yakalanabilir. Bireysel zaman noktaları Şekil 2B'de gösterilen ve zaman içinde farklı olarak değişiklik göstermektedirler.

Tüm yıkama-in kayıt ve yıkama-out o tarafındanmikrokabarcık bolus f, çeşitli perfüzyon parametreleri ölçmek mümkündür. Bir çevrimdışı analizde, kontrast bölge iz aracı embriyonik sol ve sağ beyin hemisfer ilgi 1,5 mm 2 bölgeleri (ROI) oluşturmak için kullanıldı. Bu ROI içindeki ortalama sinyal yoğunluğu daha sonra, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir ve yedi nokta medyan filtresi kullanılarak yumuşatılmış edildi. (Şekil 2C'de gösterilmektedir) elde edilen kontrast yoğunluğu eğrisinden, beyin tepe artışı tespit edilmiştir. % 10 ve en fazla pik geliştirilmesinde uygulanmıştır (PE) 50 ila% eğimi olarak tanımlanır yıkama hız, aynı zamanda hesaplandı. Son olarak, zirve zamanı (TTP) tepe zaman sinyal artışı başlangıcından itibaren hesaplanmıştır. Farklı kabarcık türleri arasında ortalama perfüzyon parametreleri farklılıklar ayrı t-testi 12 kullanılarak test edildi. Tablo 1 'de özetlenen bu neticeler, mikro-kabarcıkların enjeksiyonu valu sağladığını gösterirgelişimsel fare önemli perfüzyon parametrelerini tespit etmek için mümkün bir yöntem.

Embriyonik damar içine kabarcıkların Giriş da tanımlayabilir ve moleküler ultrason görüntüleme kantitatif kapasitelerini karakterize model sistemleri gibi fare embriyoları kullanılmasını sağlar. Aşağıdaki örnekte, genetik manipülasyon embriyonik farelerde endoglin heterozigot ve homozigoz ekspresyonu oluşturulan işlevi modeli, bir kaybı, genotipler arasında ayırt etmek için moleküler ultrason görüntüleme yeteneğini test etmek üzere kullanılmıştır. Kabarcık enjeksiyon ve yıkım / ikmal görüntüleme uygulanmasından sonra, 'post-yıkım' dizileri 'ön-imha' ortalama sinyal yoğunluğu oranı (kontrast oranı ortalama güç denilen CMPR moleküler sinyal bir ölçü üretmek için kullanılan ). (Çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni yapılan ayarlamalar ile) bir lineer karma model w tespit etmek için yapılmıştır hether Müh + / + veya Eng +/- embriyoların (kuyruk örneklerinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla tespit sonrası enjeksiyon) bağlanmasını endoglin hedeflenen, kontrol ve hedefsiz mikro-arasında anlamlı bir fark yoktu. Tahmini CMPR araçları (ortalama% 95 Güven Aralığı (CI) ±) Şekil 3'te her kabarcık ve embriyo türü için sunulmuştur ve Tablo 2'de özetlenmiştir.

Bu bulgular, yalıtılmış embriyo ultrason kontrast ajanlarının enjekte elde edilebilir somut kanıtıdır. Ayrıca, bu protokol perfüzyon parametrelerinin kontrolünü kolaylaştırır ve moleküler ultrason görüntüleme kapasitelerinin aydınlatmak için bir çaba vasküler hastalık embriyo modellerinde bağlanma hedefli Kabarcığa karşılaştırmak için kullanılabilir.

.jpg "/>
Şekil 1. Deneysel izole embriyolara mikro-kabarcıkların enjeksiyonu için set-up. 20 ul mikro-kabarcık Çözelti bir cam kanül kullanılarak bir plasental damar içine enjekte edilirken, bir 21 MHz lineer dizi dönüştürücü bir batın oturma E16.5 embriyo üzerinde konumlandırılmıştır. Ölçek çubuğu = 10 mm. Denbeigh itibaren, JM ve ark. Izni ile 12. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. batın Yaşam E17.5 Embriyolar Ultrason Görüntüleme. (A), bir embriyo B-modu ultrason görüntüsü. Önceki hedef mikro-kabarcıklar (t = 0 saniye) enjeksiyonuna. (B) 'önce ve mikro-kabarcıkların enjekte edildikten sonra embriyo doğrusal olmayan bir kontrast görüntüsü. Doğrusal olmayan kontrastlı görüntü priveya enjeksiyon (t = 0 sn) kabarcık için. Sadece güçlü yansıtan arayüzler (örneğin, kemik) yumuşak dokulardan az sinyal ile, görebilir. Aşağıda, bir bolus enjeksiyonu sonrasında t = 50 saniye, t = 120 saniye ve t = 420 sn olan bir embriyonun içindeki mikro-kabarcıkların doğrusal olmayan bir kontrast görüntüsü. Kontrast kalp ve beyin de dahil olmak üzere hayvan boyunca algılanır. Zaman yoğunluğu eğrileri elde edilen (C) Perfüzyon parametreleri. Embriyonik beyin, tek bir ROI içinde, zamanın bir fonksiyonu olarak mikro-kabarcıkların yoğunluğu çizimi. Perfüzyon parametreleri pik geliştirme (PE), yıkama-in oranı (yamaç), ve (TTP) zirve süresi dahil, grafikte tanımlanır. Ok uçları: R = kaburga, Ht = kalp, Br = beyin. keyfi birimler, au; ROI, ilgi bölgesi; sn, saniye. Ölçek çubuğu = 3 mm. Bu rakam Denbeigh, modifiye edilmiş JM ark. 12. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.

Şekil 3,
Müh + içinde (MB E) hedeflenen endoglin, kontrol (MB C) ve hedefsiz mikro kabarcık (MB U) için Şekil 3. ortalama kontrast Özeti ortalama güç oranları (CMPR) / + ve Eng +/- embriyolar. Endoglin gelen CMPRs hedeflenen Mikrokabarcıklar (ne olursa olsun genotip, birbirinden önemli ölçüde farklı değil), (*** p <0.001) MB C ve MB U için toplanan gruba göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. MB E bağlama göre Müh + / + embriyoların (koyu belirteçler) anlamlı olarak yüksek olduğu saptandıEng +/- embriyolar (ışık belirteçleri). Sonuçlar ortalama ±% 95 güven aralığı olarak sundu. n, her bir kategorideki özel embriyo sayısını gösterir. Denbeigh itibaren, JM ve ark. Izni ile 22. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kabarcık Tipi T-testi
p değeri
Perfüzyon Parametre MB U MB C MB V MB C vs MB U MB V vs MB U MB <MB V vs alt> C
Tepe Geliştirme, PE (au) 0,427 ± 0,063 0,490 ± 0,079 0,499 ± 0,064 0.19 0.06 0.81
Yıkama-hız (au / sn) 0,008 ± .002 0,009 ± .002 0,011 ± .002 0.18 0.01 0.09
Peak, TTP (sn) Zaman 53.75 ± 7.96 51,75 ± 4.46 45.00 ± 5.33 0.55 0.03 0.03
# Embriyolar enjekte 4 4 3

Tablo E17.5 embriyonik perfüzyon parametrelerinin 1. Özeti. Tüm embriyo ROI için zaman yoğunluğu araziler türetilen ± standart sapma (bir ortalama.u. = Keyfi birimler). tablo hedefsiz için ölçümleri (MB U) içerir, IgG 2 kontrol (MB C) hedefli ve VEGFR2 (MB V) microbubbles hedeflenen. Ayrı t-testi grupları karşılaştırmak için yapılmıştır. Bu tablo, Denbeigh, JM ve ark. 12 modifiye edilmiştir.

Kabarcık türü Genotip CMPR Ortalama % 95 Güven Aralığı
MB E Müh + / + 9.71 9.05, 10.38
Müh +/- 5.51 4.87, 6.15
MB C Müh + / + 1.42 0.41, 2.43
Müh +/- 1.46 0.45, 2.47
MB U Müh + / + 1.7 0.65, 2.75
Müh +/- 1.76 0.67, 2.84
Doğrusal Karma Model: arası konu Etkileri
df F p değeri
Genotip 1 12.75 <0.001
Kabarcık türü 2 147,65 <0.001
Genotip * kabarcık türü 2 18.29 <0.001

Lineer karma model analizi Tablo 2. Özetikabarcık çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni düzeltmesi ile, embriyoların bağlayıcı. Genotip, kabarcık türü ve kombine etkileşim (genotip * kabarcık türü) CMPR belirlenmesinde önemli faktörler olarak bulundu. serbestlik df = derece. Denbeigh itibaren, JM ve ark. Izni ile 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ultrason kontrast ajanlar geç evre gebelik fare embriyoları ve doğrusal olmayan kontrast görüntüleri enjekte edildi perfüzyon parametreleri ölçmek için edinilen ve bağlayıcı Kabarcığa hedef alındı. Embriyonik damar sistemi içerisinde mikro-kabarcıkların başarılı görüntüleme bir dizi faktöre, ilk olarak embriyo canlılığı bağımlıydı. Tüm ekipman ve cihaz enjeksiyonun başlangıcında rahim embriyoların izolasyonu için gerekli olan zamanı en aza indirmek için önceden hazırlanmıştır. Embriyonik fareler üzerinde anestezi tek veya tekrarlanan maruz etkileri detaylı olarak incelenmemiştir beri, anne anestezi kullanılmadan önce kaçınılması 16 kurban edildi. Embriyo izolasyonu sırasında, yumurta sarısı kesesi zarar görmesini önlemek için ve embriyolar sık ​​sık yenilenir embriyo medyada, her zaman soğutulmuş tuttu emin olmak için önemliydi. Enjeksiyondan önce ve bağlantılarını sırasında embriyo exteriorizing zaman büyük Vitellin gemiler likelihoo sınırlamak için kaçınılmıştıröldürücü olabilir kanama, d. Biz embriyoyu canlandırılması sırasında, ilk bir ileri geri hareket embriyo ultrason jeli tatbik ve forseps ile herhangi bir büyük kabarcıklar çıkarmadan önce, PBS ile plasenta ve daha sonra embriyo kapsayacak şekilde en iyi olduğunu öğrendim. Petri kabı kalan PBS ile dolduruldu. jel ve PBS kullanımı, görüntü kalitesini etkileyebilir embriyo ve dönüştürücü arasındaki hava cepleri, olasılığını sınırlı. Embriyo canlandırdı gibi, kan damarları göbek 23 kırmızı parlak göründü ise gözle görülür umbilikal arterde pompalama, akmaya başladı. Başvuru için, göbek ven kaynaklanan dalları genellikle plasenta yüzey üzerinde göbek arter gelenler kaplaması. Akış azaltılmış plasental kanama ve venule enjeksiyonları yönünde mikrokabarcıkları enjekte, plasental labirent arteriollerin içine enjekte etmek mümkün olmasına rağmen, aynı zamanda th dolaşan önce embriyo doğrudan geçmesine izin microbubbleskaba plasenta.

Dolayı kırılganlık, kabarcık hazırlık ve işleme de dikkat gereklidir. Ultrason mikrokabarcıklar yüksek basınçlı ortamlarda altında tahrip olabilir. Her bir sulandırma ve kabarcık konsantrasyonu deneysel tutarlılığı sağlamak için ölçülmüştür sırasında Bu nedenle, tam olarak aynı prosedür tekrarlanmıştır. Mikro-kabarcık tek bir şişe yaklaşık 5-7 embriyolar için genellikle yeterli oldu. Mikro-kabarcıklar, 3 saat kadar şişenin içinde sabit olduğu için, çok küçük şişeler genellikle tek bir deney için gerekli idi. Doku yırtılmasını önlemek için, enjeksiyon iğnesinin cam ucu için en keskin olması ve mümkün olduğunca küçük bir açıyla gemiyi yaklaşırken hafif bir açıyla kesmek oldu. Bir kez kesilmiş, iğne ucu kabarcıklar topaklanma olmadan sonuna kadar kolayca akması için yeterince büyük olması gerekiyordu, ama geminin içinde kolayca sığacak kadar küçük. İdeal boyutu genellikle oldu 100 mikron <. Uygun yargılamak bazı uygulamaboyutu gerekliydi. Ucu çok büyük kesildi, ya da bloke oldu halinde, yeni bir cam iğne uygulandı. Bazı durumlarda, bu biraz tıkanma üstünde iğne Döşeme mümkün oldu. Bu hayvanın ölümüne neden olabileceğinden, hava enjeksiyonu sırasında embriyonun damar sistemine girmesine izin verilmeyeceğini kritik ve hava kabarcıkları embriyonun damar köşkü ve ultrason görüntüsünde tespit olabilir (görüntüleme sırasında istenmeyen oldu yapay) bir ölçüm sinyalini arttırır. Bu protokolde yapılan doğrusal olmayan kontrast görüntüleme, özellikle küçük hayvan görüntüleme (MS250) için tasarlanmış doğrusal diziler ile eşleştirilmiş sanat yüksek frekans (21 MHz) mikro-ultrason sistemi (Vevo2100) bir devlet kullandı. Mikro veya yüksek frekanslı -ultrasound şu anda, kemirgen embriyolar ve yenidoğan 16 yaşam yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlamak için, mümkün birkaç yöntemlerinden biridir. Bu sistem 75 mikron ve 165 μ eksenel ve yanal çözünürlük elde edebilirsinizsırasıyla 15 mm gibi büyük derinliklerde m. Genellikle klinik araçlar kullanılarak elde kabarcıkların akustik sinyal (darbe inversiyon ve genlik modülasyon teknikleri 24 dahil) doğrusal olmayan kontrast görüntüleme yöntemleri kullanılarak dokudan ayırt edilebilir çok daha yüksek çözünürlüklerde nedenle görüntünün tüm embriyo mümkün oldu. Burada anlatılan ultrason ayarları ile en iyi başarı olmasına rağmen, bu parametrelere bazı ayar da tatmin edici sonuçlar üretecek mümkündür. Her durumda, bir düşük güç kısa patlama mikro-kabarcık popülasyonunun sadece küçük bir kısmını ortadan kaldıran ise, bir akışın başlatılmasından önce mikro-kabarcıkların olan istenmeyen yıkımını engellemek için mikro-kabarcık görüntüleme için gereklidir. Uygulama ile, bir tek embriyo için tüm prosedür, moleküler görüntüleme ultrason tamamlanmasına konumlandırma gelen, yaklaşık 15 dakika sürdü. Biz başarıyla bir çöp 12 embriyolar gibi birçok olarak enjekte varTek bir oturum.

Enjeksiyon deneyleri nedeniyle embriyo canlılığı sınırlı bir 4 saat penceresine sınırlı idi. Kabarcıkların dağıtım embriyo kendisi dolaşımı bağlı olduğundan, enjeksiyonlar vitellin ve göbek dolaşım (E9.5) kalp atışı (E8.5) ve saptanabilir akış önce yer alamadı 25 kurulmuştur. E14.5 kadar değil tam plasenta olgunlaşması ile plasental labirentte kontrast maddelerin enjeksiyonu geç gebelik yaşına orta embriyolar sınırlıydı. Gözlemlere dayanarak, vadeli yakın embriyolar hardier ve onların genç meslektaşlarının daha iyi onların damar hacmi artar direnemedi. Kombine, kalkınma ve anjiyojenik büyüme daha sonraki aşamalarına embriyonik damarların kontrastlı ultrason görüntüleme kısıtlı bu faktörler. Reseptörlerin manipülasyon Vasc katılan, bu durum, transjenik fare modelleri durumunu etkileyebilirular geliştirme ve bakım (örneğin, VEGFR2, VCAM-1) embriyonik öldürücülüğü veya geliştirme kusurları ve embriyonik dolaşım sistemlerinin 26,27 düzenlenmesi yol açabilir. Bununla birlikte, ilgili bir model sistemleri bir dizi molekül-1 31 arası yapışma molekülü α 2 β 1 28 α h β 3 29, trombosit endotelyal hücre yapışma molekülü-1, 30, ve vasküler hücre yapışma da dahil olmak üzere ilgi vasküler biyolojik için geçerlidir -1 32 ve -2 33 ve P-selektin 34. Dahası, beyin doku oluşumu muhtemelen bu dokuda anjiyojenik markerlerin ifadesi yapmak ve böylece moleküler görüntüleme kantitatif açıdan değerlendirmek çalışmalar için geleneksel tümör modelinde mükemmel bir alternatif sağlayan orta gebelik 11 sonra başlar.

enjeksiyonlar ex vivo doğa bazı limitatio sunmak yaparns. Bu embriyoların anne ve delinmiş plasental labirent çıkarıldı sonra, o tekrar enjeksiyonları yapmak için genellikle mümkün (ne arzu) olmadığını belirtmek önemlidir. Buna ek olarak, maternal dolaşıma embriyo izole besin ve O 2 kaynağı sınırlar ve embriyonik sağlık zamanla bozulmaya bekleniyor. Soğutma ve canlanma embriyoların canlılığı uzatır, aynı zamanda kalp fonksiyonunu etkileyebilir. Örneğin, izole edilmiş embriyolar (veriler dahil edilmemiştir, Denbeigh ve ark. 12 ye bakınız), daha önce in vivo 35 gözlenenlere kıyasla azalmış bir kalp hızı olduğu görülmüştür. Bu, kardiyovasküler fizyoloji değerlendiren araştırmalar doğru in vivo koşullarında yansıtmaz olması muhtemeldir. Yaşayan geç evre fare embriyo dolaşım hemodinamikleri karakterize birkaç çalışma ile, ancak, bu deneysel koşullar alt alt edebilir hangi ölçüde kesin olarak söylemek zorfizyolojik fonksiyonu er. Bir alternatif bu yaklaşım zorlukları 11 kendi kümesi sunmak rağmen, laparoskopik kesi 36 üzerinden veya hamile annenin doğrudan 37 karnında aracılığıyla ya utero enjeksiyonları yapmaktır. Bazı durumlarda, embriyo izolasyonu ve Eksteriorizasyon da yumurta sarısı kesesinden önemli kanama neden olabilir. Biz ultrason jeli ile kan akışını inhibe olabilir bulundu rağmen, kan önemli kayıp mikrokabarcıkların teslim ve konsantrasyonu etkileyebilir ve bu hayvanların analize dahil edildi. Izolasyon sınırı maternal ve hareket embriyonik kaynakları yapar iken Son olarak, kardiyak aktivite ile ilgili periyodik hareket kaçınılmazdır. Biz doğrudan hedef kabarcık sinyaline reseptör ifade etkisini, gerçek zamanlı hareket telafi kontrastlı ultrason görüntüleme 38 mayıs olan ancak uygulanmasını incelemek için resmin statik beyin seçildidiğer organlara bu çalışmaları genişletmek.

Şu anda yaşayan gelişmekte olan fare embriyosunun vasküler manzara değerlendirmek mümkün birkaç görüntüleme uygulamaları vardır. Manyetik rezonans görüntüleme, vasküler korozyon atmalarını, microcomputed tomografi ve optik projeksiyon tomografi 16 postmortem uygulanmıştır Bazı çalışmalar başarıyla Doppler süpürüldü kaynak optik koherens tomografi 39,40 kullanarak ex vivo kemirgen embriyolar kan akımının canlı görüntüleme gerçekleştirdik. Embriyonik büyüme bu dönemde erken vasküler gelişim ve işlevi ile ilgili önemli bilgiler ortaya çıkarabilir çünkü bu, talihsiz bir durumdur. Canlı embriyoların içinde kabarcık görüntüleme nedenle gelişimsel fizyolojisi anlamamıza katkıda bulunabilir. Bu teknik, mevcut yöntemlerin yerini ihtimal olmasına rağmen aynı zamanda, gerçek zamanlı olarak canlı fare fetusun tüm vücutta biyobelirtecin dağılımını görselleştirmek için kullanılan olabilir (dahil histolojiembriyonik dokuda moleküler sinyalin ölçümü ve floresan görüntü). embriyolar damarların hızla gelişen kütle Bununla birlikte, yakın tümör anjiyojenez 41,42 tanımlanan aynı anahtar reseptörlerinin birçok ifade ile, tümör büyümesinin benzer ve bu nedenle molekül kantitatif özellikler ile ilgili çalışmalarda mükemmel bir tümör vekil olarak görev yapabilir ultrason. Bu nedenle açıklanan yöntemler sadece değerlendirilmesi ve fonksiyonel görüntüleme yoluyla damar sağlığı ve hastalıkları embriyonik modellerini karakterize için yararlı olacağını tahmin, ama aynı zamanda moleküler görüntüleme gücünü ve sınırlarını keşfetmek için bir cadde sunuyor. Bu uygulama aynı zamanda mikro kabarcıklar fetal fare dokusuna 10 çıplak DNA teslim bir aracı olarak test edilmiştir utero gen transferi tedavisi de dahil olmak üzere, soruşturma diğer ilginç alanlara uzatabilir. Alternatif olarak, yaşam embriyo 3D vasküler haritalama, de mümkündürhangi genetiği değiştirilmiş farelerde morfolojik anormallikler olarak çok değerli bilgiler verebilir. Izole yaşayan embriyoların ultrason kontrast maddelerin tanıtımı dolayısıyla kliniğe kontrastlı ultrason uygulamaları vasküler hastalık anlayışımızı artırarak ve tercüme için başka bir araç olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48, (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47, (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37, (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260, (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242, (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26, (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110, (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5, (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48, (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40, (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17, (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10, (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121, (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47, (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51, (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258, (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26, (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18, (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36, (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20, (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17, (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13, (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4, (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103, (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3, (8), (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics