بوسلفان باعتباره وكيل كابت النقي لتوليد مستقرة الرفيع المستوى نخاع العظم الخيمرية في الفئران

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

ملاحظة: أخلاقيات الإعلان: تم استعراض هذا البروتوكول وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان من جامعة سايمون فريزر (UACC، تسمح أرقام 1037K-12 و 1060K-03) وهو في الامتثال مع المجلس الكندي للرعاية الحيوان، ودليل المعاهد الوطنية للصحة ل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وتوجيه المجلس EEC.

1. اعتبارات خاصة

ملاحظة: بوسلفان غير السامة للخلايا. التعامل والتصرف وفقا لرقة بيانات سلامة المواد والمبادئ التوجيهية المؤسسية.

  1. أداء جميع تقنيات جو معقم و مطهر في غطاء تدفق الصفحي.
  2. تعقيم الأدوات قبل استخدامها عن طريق لف في مواد التغليف المناسبة، مثل حزمة قشر، والتعقيم.
  3. في حين أن خطر للإصابة أقل مع تكييف بوسلفان مقارنة للأشعة، والتعامل مع الحيوانات فقط في غطاء تدفق الصفحي ل 2 أسابيع الأولى بعد الزرع.

2. تكييف منالفئران المتلقي

  1. تمييع بوسلفان إلى 3 ملغ / مل بمحلول ملحي معقم الفوسفات مخزنة (PBS).
    ملاحظة: من المهم لجعل التخفيف جديدة من بوسلفان فقط قبل استخدامها كل يوم من الحقن.
  2. إدارة 20 ملغم / كغم من بوسلفان المخفف على الفئران المتلقي عن طريق الحقن IP يوميا.
  3. تكرار الحقن IP اليومية من 20 ملغ / كغ بوسلفان حتى جرعة من مجموع 60-100 ملغ / كغ تم تسليمها (أي ل/ الجرعة الإجمالية كغ 80 ملغ، إدارة 20 ملغم / كغم من بوسلفان لمدة 4 أيام متتالية).

3. عزل المانحة خلايا نخاع العظم

ملاحظة: وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لعزل وإعداد الخلايا BM من ما يصل الى 5 الفئران المانحة. عادة العائد خلية في الماوس ما يقرب من 30 حتي 40000000 BMDCs، وهو ما يكفي لزرع 12-16 الفئران المتلقي. إذا كانت هناك حاجة مزيد من الفئران المانحة قد تحتاج إلى تعديل البروتوكول وفقا لذلك.

  1. التالية في اليوم الأخير من تكييف بوسلفان euthanize ماوس GFP المانحة (واحد إلى ستة أشهر من العمر) باستخدام CO 2 (أو عن طريق إجراء القتل الرحيم أخرى مقبولة في مؤسسة). لتجنب المضاعفات الكسب غير المشروع تستخدم الجهات المانحة مسانج التي هي نفس الجنس كما المتلقين.
  2. رذاذ الفأر مع الايثانول 70٪. الجلد في رفع مقص جراحي البطن واستخدام إجراء شق طريق الجلد من تجويف البطن فوق الساق نحو الكاحل. عقد القدم، وسحب بحزم الجلد من الكاحل نحو الفخذ تعريض أنسجة الساق.
  3. تقليم بعيدا العضلات والأنسجة الدهنية من عظم الفخذ لفضح مفصل الورك.
  4. في حين سحب بلطف على القدم لتمديد الساق، اضغط على مقص ضد مفصل الورك. مجرد قطع فوق رأس عظم الفخذ مع الحرص على عدم قطع عظم الفخذ نفسها.
  5. للمساعدة في الحفاظ العقم، وعقد المحطة التي كتبها القدم وتنظيف أي نوع من الأنسجة المتبقية من العظام عن طريق فرك سطح العظام مع الأنسجة تعقيمها.
  6. فصل عظم الفخذ والساق من خلال قطع مفصل الركبة ووضع عظم الفخذ في طبق ثقافة تحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة. احتضان على الجليد.
  7. إزالة والتخلص من الشظية عن طريق قطع عند نقطة حيث يربط الساق في الساق. وضع الساق في صحن الثقافة مع عظم الفخذ واحتضان على الجليد.
  8. كرر الخطوات من 3،2-3،7 عن الساق الأخرى، وإذا لزم الأمر، والفئران إضافية من المانحين. بعد إزالة العظام، وتعقيم الأدوات الجراحية مع حبة تعقيم الساخن أو استخدام مجموعة جديدة من أدوات معقمة للخطوات اللاحقة.
  9. لعظام الفخذ، وعقد عظم الفخذ مع ملقط وباستخدام مقص جراحي بعناية "حلاقة" القاصي ينتهي قبالة العظام. إزالة اقل من العظام عند الضرورة لفضح تجويف BM.
  10. حقنة ملء مع 3 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وإرفاق G 23 إبرة. حملت بعناية الإبرة في تجويف BM وتدفق BM في صحن الثقافة العقيمة. ومن المؤكد أن تتخلص من تجويف النخاع مع نقطة الإبرة لضمان إزالة جميع الخلايا المطلوبة. وبعد الاستخراج،تأكد من أن BM الأحمر لم يعد مرئيا ويظهر عظم الآن الأبيض.
  11. كرر الخطوات 3،9-3،10 للعظام الفخذ اللاحقة، وتجميع كل من BM في صحن الثقافة نفسه.
  12. للظنبوب، مع الاستمرار على الساق مع ملقط وبعناية "حلاقة" نهاية حيث كان يعلق على الساق إلى الركبة لفضح تجويف BM. اجراء خفض الثاني على طول العظام حيث ينتهي BM الأحمر مرئية.
  13. حقنة ملء مع 3 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وإرفاق G 25 إبرة. إدراج بلطف الإبرة في تجويف BM (من نهاية جرى ضمه الى الركبة) وتدفق BM في طبق ثقافة تحتوي على BM من عظام الفخذ. كشط جدران التجويف BM مع الإبرة لإزالة جميع الخلايا. وبعد استخراج، تأكد من أن BM الأحمر لم يعد مرئيا ويظهر عظم الآن الأبيض.
  14. كرر الخطوات 3،12-3،13 للظنبوب لاحق، وتجميع كل من BM في صحن الثقافة نفسها.
  15. بلطف يسحن وBM مع 1 مل ماصة لفصل جells.
  16. تمرير تعليق الخلية من خلال 40 ميكرومتر سلة مرشح في العقيمة 50 مل أنبوب الطرد المركزي. شطف الطبق مع PBS للحصول على أي الخلايا المتبقية ونقل ذلك من خلال مرشح في أنبوب الطرد المركزي.
  17. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج في 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل طاف.
  18. اعادة تعليق بيليه في 3 مل من كرات الدم الحمراء عازلة الناشر. احتضان على الجليد لمدة 8.5 دقيقة.
  19. إضافة ~ 30 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة لإرواء المخزن المؤقت الناشر.
  20. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج في 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل طاف.
  21. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. الحفاظ على الجليد.
  22. اتخاذ قسامة صغيرة من جناسة الخلية وتمييع مع PBS (1: 100 ل1 الماوس؛ 1: 200 لمدة 2 الفئران، الخ) لتحديد عدد الخلايا باستخدام haemocytometer.
  23. تمييع تعليق خلية إلى 8 × 10 6 خلية / مل واحتضان على الجليد حتى الحقن.

4. زرع النخاع

  1. فايليرة لبنانية حقنة 0.5 مل (مع وجود الأنسولين إبرة 28 G) مع 300 ميكرولتر من تعليق خلية المخفف لكل الماوس ليتم حقنه. تأكد من إزالة أي فقاعات الهواء الموجودة في الحقنة.
  2. ضع الماوس قفص يحتوي على الفئران المتلقي مكيفة على وسادة التدفئة والسماح للأوردة الذيل لتمدد.
  3. خذ الماوس المتلقي ومكان في الجهاز الزجرية. مسح الذيل مع الشاش الجراحي غارقة مع الايثانول 70٪.
  4. اعتقادا راسخا الذيل ومع شطبة تصل، إدراج بلطف الإبرة في واحدة من أوردة الذيل الأفقي وحقن تعليق خلية.
  5. عقد الشاش الجراحي على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف قبل إدخال الماوس في قفص نظيفة الجديد.

5. تقدير مدى BM الخيمرية

ملاحظة: مستويات الخيمرية متغيرة عادة في الدم المحيطي في 1 أسبوع بعد BMT، وكما وقدرت هذه المستويات الخيمرية عادة 2 أسابيع على الأقل بعد BMT. مستويات شيمerism ينبغي أن تصل> 80٪ GFP + الخلايا في الدم المحيطي في غضون 3-4 أسابيع بعد BMT.

  1. إعداد FACS العازلة (2 ملي EDTA + 2٪ مصل بقري جنيني في PBS).
    ويمكن تخزين عازلة FACS في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع: ملاحظة.
  2. ضع الماوس في أنبوب الزجرية ويحلق الفراء على الساق الخلفي لفضح الوريد الصافن الجانبي.
  3. معطف رقيقة الساق مع الفازلين ويخترق الوريد الصافن مع إبرة 25 G.
  4. جمع ما يقرب من 50 ميكرولتر من الدم مع الهيبارين المغلفة الأنابيب الشعرية. إضافة الدم إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة التي تحتوي على 1 مل من العازلة FACS. خلط أنبوب عن طريق انقلاب وتخزينها على الجليد.
  5. عقد الشاش الجراحي على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف قبل أن تعود الماوس إلى القفص.
  6. أجهزة الطرد المركزي لعينات الدم لمدة 5 دقائق في 900 ز س. إزالة وتجاهل طاف.
  7. اعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء عازلة الناشر. احتضان على الجليد لمدة 8.5 دقيقة.
  8. إضافة 1 مل من العازلة FACS لإرواء المخزن المؤقت الناشر.
  9. الطرد المركزي عينات لمدة 5 دقائق في 900 ز س. إزالة وتجاهل طاف.
  10. أداء خطوة تحلل الثانية في 500 ميكرولتر من العازلة كرات الدم الحمراء الناشر. احتضان على الجليد لمدة 8.5 دقيقة.
  11. إضافة 1 مل من العازلة FACS لإرواء المخزن المؤقت الناشر.
  12. الطرد المركزي عينات لمدة 5 دقائق في 900 ز س. إزالة وتجاهل طاف. تأكد من أن بيليه هو الآن الأبيض.
    ملاحظة: إذا كان بيليه لا يزال يظهر أحمر، قد تكون هناك حاجة إلى خطوة إضافية تحلل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  13. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من العازلة FACS. الطرد المركزي عينات لمدة 5 دقائق في 900 ز س. إزالة وتجاهل طاف.
  14. اعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولتر من العازلة FACS وقياس GFP + الخلايا باستخدام التدفق الخلوي (ملاحظة: عند هذه النقطة أي المناعية المطلوب من الخلايا لا يمكن أن يؤديها، وذلك باستخدام التقنيات القياسية، وذلك قبل أن تتدفق تحليل cytometric).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إدارة 60-100 ملغم / كغم من بوسلفان عموما جيد التحمل من قبل الفئران. ومع ذلك، الحيوانات وعادة ما يفقد الوزن خلال مرحلة تكييف (~ 5-10٪)، وبالتالي النظام الغذائي قد تحتاج إلى أن تستكمل مع يعامل مثل بذور عباد الشمس المشع لتشجيع تناول الطعام. يجب أن مستويات الخيمرية من> 80٪ GFP + الخلايا في الدم المحيطي وBM يكون تحقيقه باستمرار باستخدام 60-100 ملغ / كغ بوسلفان 7. مختبرنا وقد استخدمت بنجاح هذا البروتوكول لتوليد أكثر من 100 الفئران خيالية مع> 80٪ GFP + الخلايا في الدم المحيطي وBM، وتقريبا كل من BMTs لدينا هي ناجحة عند استخدام الجهات المانحة مسانج والمتلقين. الشكل 1 يبين مستويات الخيمرية كميا الأسبوعية في الدم المحيطي من الفئران مكيفة مع 100 ملغ / كغ بوسلفان تلقي مسانج BMT ناجح (ن = 3) والفئران مكيفة مع 80 ملغ / كغ بوسلفان تلقي خيفي BMT غير ناجحة (ن = 3). مستويات الخيمرية> 80٪ من typicallذ التي وضعتها 3-4 أسابيع بعد BMT. هو الشكل 2 FACS بيانات تمثيلية من الدم المحيطي يظهر الناجح وغير الناجح لBMT الشكل 3 يبين أن هذا الخيمرية يبقى أنشأت لسنة واحدة على الأقل في BM (ن = 3)، و أن تكييف مع السيارة ليست كافية لإحداث BM الخيمرية (ن = 3). في حين أن هناك حققت أي اختلافات كبيرة في مستويات BM الخيمرية باستخدام جرعة من 60-100 ملغ / كغ بوسلفان، وخلايا GFP + تتراكم داخل الجهاز العصبي المركزي بطريقة تعتمد على الجرعة. وعلاوة على ذلك، يتم زيادة هذا التراكم بشكل كبير في الاضطرابات العصبية مثل ALS 7 الشكل 4 يوضح GFP + تراكم الخلايا في المنطقة القطنية من الحبل الشوكي في البرية من نوع (ن> 20) وALS نموذج الفأر (ن> 20).

الشكل (1)
الشكل 1. الفئران مستلم مشروطةمع بوسلفان وزرعها مع GFP + خلايا نخاع العظام من متبرع مسانج تحقيق مستوى عال من الخيمرية مستمرة في الدم. الاسبوعية البيانات تدفق cytometric تظهر GFP + الخيمرية في الدم المحيطي من الفئران زرعها بنجاح مكيفة مع 100 ملغم / كغم من بوسلفان تليها مسانج زرع نخاع العظم (أسود) والفئران زرعها دون جدوى مشروطة مع 80 ملغ / كغ من بوسلفان تليها خيفي زرع نخاع العظام (الرمادي). النتائج هي وسيلة من ن = 3 الفئران / المجموعة، أشرطة الخطأ تمثل SEM.

الشكل 2
الشكل 2. التمثيلية البيانات تدفق cytometric تظهر GFP + الخلايا في الدم المحيطي بعد 3 أسابيع زرع نخاع العظام في الفئران مكيفة مع 100 ملغم / كغم من بوسلفان. (A) مخطط التشتت استراتيجية تظهر النابضة، (B) وallogen غير ناجحة EIC زرع نخاع العظم، و (C) على مسانج زرع نخاع العظام ناجحة. النتائج هي تمثيلية من ن> 3 الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. التمثيلية البيانات تدفق cytometric تظهر GFP + الخلايا في نخاع العظم بعد 1 سنة زرع نخاع العظام. (A) مخطط التشتت تظهر النابضة الاستراتيجية، (B) سيارة مكيفة الفئران، و (C) 100 ملغ / كغ بوسلفان مكيفة الفئران. النتائج هي تمثيلية من ن = 3 الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

"دائما"> الشكل (4)
الرقم نخاع العظام 4. الخلايا المشتقة تتراكم في الجهاز العصبي المركزي من بوسلفان مكيفة الفئران أعطيت لعملية زرع نخاع العظام. تحليل المناعى من المقاطع من المنطقة القطنية من الحبل الشوكي معزولة عن (A، C) النوع البري الفئران و(B، D) في وقت متأخر مرحلة المرض ALS ​​الفئران. وتظهر الخلايا GFP + باللون الأخضر. النتائج هي صور تمثيلية من ن> 20 الفئران لكل نموذج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تكييف بوسلفان يسمح لتوليد الخيمرية BM رفيع المستوى في الفئران مع الخلايا المكونة للدم ويمكن كشفها بسهولة. هذا تكييف يمكن القيام بها دون الحاجة إلى مرافق التشعيع. وعلاوة على ذلك، كبت نقي العظم مع جرعة من بوسلفان الواردة في هذا البروتوكول هو جيد التحمل، والتقليل من الآثار الجانبية السامة الناجمة عن الجرعات myeloablative التشعيع، وبالتالي قد تكون تقنية أكثر ملاءمة لتوليد BM الخيمرية في الشباب، القديم، أو المريضة الفئران التي هي أكثر عرضة للmyeloablative التشعيع. بعض البروتوكولات RIC استخدام جرعات منخفضة، غير myleoablative من إجمالي تشعيع الجسم للحد من آثار جانبية ضارة، ولكن هذه البروتوكولات لا تزال تتطلب مرافق التشعيع، واعتمادا على جرعة من الإشعاع، قد يؤدي إلى مستويات الخيمرية التي هي أقل من تلك التي يمكن تحقيقها مع بوسلفان تكييف 13. في الآونة الأخيرة، وقد استخدم treosulfan للتكييف BM 8،14. مثل بوسلفان، conditi treosulfanoning وBMT قادر على توليد الفئران مع وجود درجة عالية من الخيمرية في BM 14. ومع ذلك، treosulfan لا يمكن تحقيقه بسهولة في أمريكا الشمالية، وجرعة من treosulfan اللازمة لتحقيق مستويات مماثلة من الخيمرية لتكييف بوسلفان هو أعلى بكثير من بوسلفان (~ 5-10 أضعاف) 14. وعلاوة على ذلك، في هذه الجرعات الفعالة treosulfan يبدو أن يكون لها آثار جانبية أكثر سمية في الفئران مقارنة بوسلفان (K. بيك، J. مانينغ، وC. كريجر، والملاحظات غير منشورة). ويمكن أيضا أن تنشأ الطرفية الخيمرية الدم من خلال جيل من الفئران التعايش الالتصاقي، الذي ينطوي على ربط جراحيا تداول ماوس المتلقي إلى ماوس المانحة. وخلافا للزرع BM كاملة، تعايش التصاقي يسمح لالخيمرية الدموية المحيطية التي ستنشأ بطريقة أكثر الفسيولوجية دون إدخال الخلايا الاصلية BM المقيدة إلى الدورة الدموية، على الرغم من تعايش التصاقي هو إجراء تحديا تقنيا أن ينتج عنه فقط في الخلايا المانحة 50٪ ~ في المناطق المحيطةالدم pheral من الفئران المستفيدة 15.

بروتوكول المذكورة هنا يعتمد على استخدام الفئران المستفيدة والجهات المانحة التي هي نفس الجنس، وكذلك باستخدام سلالات المتلقي والماوس المانحة مسانج، وذلك لتقليل احتمال رفض الزرع. على الرغم من أن تتوفر العديد من السلالات المانحة والمتلقية مناسبة تجاريا، وإنشاء الخيمرية في الفئران خيفي غير متطابقة (أي تختلف اختلافا كبيرا في النمط الفرداني MHC) يمكن أن يكون مشكلة. في مثل هذه الحالات التي يكون فيها الفئران خيفي هي الفئران المناسبة الوحيدة المتاحة، ينبغي أولا أن تتم دراسة أولية للخروج على مجموعة صغيرة من الفئران لتحديد ما إذا تكييف بوسلفان قادر على مما يؤدي إلى درجة عالية من الخيمرية مستقرة. لقد كان لدينا بعض النجاح زرع BMDCs المانحة المعزولة من الفئران C57BL / 6-GFP في C57BL / 6؛ المتلقين SJL، ولكن ليس كل الفئران التي زرعها أنشأت الخيمرية مستمرة (~ 30٪). إضافة سيكلوفوسفاميد، وكيل مناعة قوي في كثير من الأحيان شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي بالتعاون مع بوسلفان سريريا 16، يمكن أن تستخدم لتحسين معدل نجاح عمليات زراعة الاعضاء المختلفة وراثيا. ومع ذلك، عندما تم زرع خلايا C57BL / 6-GFP في نموذج الفأر المعدلة وراثيا الثلاثي من مرض الزهايمر على C57BL / 6 مختلط، 129 الجيني الخلفية، بوسلفان وسيكلوفوسفاميد تكييف لم تكن كافية لتوليد الوهم BM مستقرة (الشكل 2B)، في حين engraftment مستقر كان ممكن بعد التشعيع قاتلة. وهكذا، في الحالات التي تتطلب عمليات زرع خيفي، قد يكون التشعيع على نظام تكييف الأنسب نظرا لmyeloablation الكامل وكبت المناعة الشديد الذي يحدث.

ينبغي اتخاذ عدة تدابير إضافية من أجل تحقيق أقصى قدر من الخيمرية واتساق هذا البروتوكول. ومن الأهمية بمكان أن التخفيفات جديدة من بوسلفان يتم إعداد للحقن، من الناحية المثالية فقط قبل إدارة بوسلفان، كما تظهر فاعلية بوسلفان أن تنخفض مع المدى الطويلالتخزين. بالإضافة إلى ذلك، عند الطحن وBM لفصل الخلايا، فمن المهم القيام بذلك بلطف حتى لا تتلف الخلايا BM. في حين أن هذا قد يؤدي في بعض كتل من الأنسجة التي لم يتم فصلها تماما، وبالتالي العائد أقل قليلا، والصحة العامة ونوعية الخلايا نأت سيكون أفضل. وبالمثل، فإن أي الخطوات التي تتطلب إعادة تعليق من بيليه وينبغي أيضا أن يتم بلطف.

يمكن أن تتحقق باستمرار مستويات عالية من الخيمرية مع 60 و 80 و 100 ملغ / كغ من جرعات بوسلفان 7 (أرقام 1 - 3). وعلاوة على ذلك، هناك زيادة تعتمد على الجرعة في تراكم GFP + الخلايا في الجهاز العصبي المركزي من النوع البري 8،9 والفئران ALS 7. نحن وغيرنا وقد لاحظ أيضا زيادة في عدد تراكم GFP + الخلايا داخل الجهاز العصبي المركزي من نماذج الماوس من التنكس العصبي مقارنة البرية من نوع الفئران 7،8،10. النتائج أشعة قاتلة في عدد أكبر من GFP + BMالبلدان النامية مقارنة 60-100 ملغ / كغ جرعة من بوسلفان 7 على الرغم من أن إحدى الدراسات الحديثة تشير إلى أن جرعة myeloablative من بوسلفان (125 ملغ / كلغ) النتائج في عدد أكبر من GFP + الخلايا في الدماغ مقارنة مع مجموع الجسم التشعيع 9. تشير الدلائل إلى أن دخول BMDC في الجهاز العصبي المركزي من الفئران المشع القاتلة قد يكون راجعا، جزئيا على الأقل، الى تعطيل حاجز الدم في الدماغ (BBB). في حين لا يظهر بوسلفان لتعطيل BBB استنادا إلى عدم وجود بروتينات مصل الدم (الألبومين) داخل الجهاز العصبي المركزي 11، بوسلفان قادر على عبور بسهولة BBB 17،18، وبالتالي فقد قيل أن تكييف بوسلفان قد تفتح مجالا المتخصصة داخل الجهاز العصبي المركزي الذي شغل في وقت لاحق من قبل BMDCs 8. ومن المثير للاهتمام، والنتائج التي توصلت إليها ويلكنسون وآخرون تشير إلى أن GFP + الخلايا تتراكم في الجهاز العصبي المركزي من بوسلفان مكيفة الفئران بسبب آلية التوظيف chemokine حين تراكم الخلايا GFP + في الفئران المشع القاتلة ويبدو أن ذلك يعود إلى inflammatorآليات ذ الناتجة عن أشعة نفسها 9. لا يبدو Treosulfan إلى حالة الجهاز العصبي المركزي وبالتالي تم العثور على عدد قليل من GFP + الخلايا داخل الجهاز العصبي المركزي من treosulfan مكيفة الفئران 8. ويبقى أن تحديد جرعات مختلفة من تأثير بوسلفان قد يكون على الأنسجة الأخرى من الجهاز العصبي المركزي، على الرغم من بوسلفان هو معروف لاستهداف الكبد والرئتين والكليتين 6. ينبغي أن تؤخذ أن بوسلفان قد شرط الأنسجة الأخرى في الاعتبار عند اختيار جرعة من بوسلفان لتجارب جديدة.

في حين أن هذا البروتوكول تكييف بوسلفان بسيط نسبيا لأداء، وجيل من الفئران مع خيالية BM هو أداة قوية التي يمكن استخدامها للتحقيق في الخلايا المكونة للدم. مجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا المتاحة تجاريا، جنبا إلى جنب مع القدرة على الفئران وراثيا مهندس وBMDCs، يزيد بشكل كبير من إمكانات هذا البروتوكول. على سبيل المثال، توجد نماذج الماوس المختلفة حيث يقتصر التعبير GFP لأنواع معينة الخلية والأنساب، مثل الفئران CX3CR1-GFP التي تعبر عن GFP في الغالب في خلايا النسب وحيدي نقوي 19. هذه الفئران يمكن أن تستخدم الجهات المانحة السماح للتحقيق في السكان الخلية المكونة للدم محددة في الجسم الحي. وهناك عدد من fluorophores مختلفة موجودة أيضا بالإضافة إلى GFP، والتي يمكن استخدامها من أجل زرع ورصد BMDCs من اثنين (أو أكثر) المانحين متميزة، وهي تقنية التي يمكن استخدامها لفحوصات المنافسة 20. وعلاوة على ذلك، فإن عددا من نماذج الماوس المعدلة وراثيا مختلفة من المرض موجودا التي يمكن استخدامها كمتلقين للتحقيق في دور BMDCs في مجموعة متنوعة من الاضطرابات. بعد زرع الخلايا المانحة يمكن تحليلها باستخدام المناعية، أو معزولة بسبب FACS والتحقيق باستخدام مجموعة من التقنيات الحيوية. وعلاوة على ذلك، تقنيات التصوير المتقدمة مثل ثنائي الفوتون المجهري يمكن تنفيذها ليعيش في الكشف عن الجسم الحي من fluorophores مثل GFP 21. وفي نهاية المطاف،ومن المتوقع أن BMDCs يمكن المعدلة وراثيا والمستخدمة لتقديم الجزيئات العلاجية لاستهداف الأنسجة مثل الجهاز العصبي المركزي في المتلقين مكيفة بوسلفان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330, (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239, (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21, (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2, (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9, (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8, (4), e60661 (2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21, (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8, (3), e58544 (2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14, (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77, (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32, (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10, (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8, (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4, (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30, (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20, (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55, (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics