마우스에서의 높은 수준의 안정적인 골수 키메라를 생성하기위한 에이전트로서 골수 억제 술판

Medicine

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Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

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Abstract

Protocol

참고 : 윤리 성명 :이 프로토콜을 검토하고 사이먼 프레이저 대학의 동물 관리위원회의 승인을받은 (UACC, 허가 번호 1037K-12와 1060K-03) 및 동물 관리, NIH 가이드에 캐나다 협의회 준수 실험실 동물의 관리 및 사용 및 EEC 이사회 지침.

1. 특별 고려 사항

참고 : 술판은 세포 독성이다. 핸들과 물질 안전 보건 자료 및 제도적 지침에 따라 폐기하십시오.

  1. 층류 후드에서 무균 기술을 모두 수행한다.
  2. 이러한 박리 패키지, 오토 클레이브와 같은 적절한 포장 재료에 포장하여 사용 전에기구를 멸균.
  3. 감염 위험이 조사에 비해 술판 컨디셔닝 낮지 만 이식 후 처음 2 주 층류 후드에서 동물을 처리한다.

2. 컨디셔닝받는 사람 마우스

  1. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 ml의 3 ㎎ /에 술판을 희석.
    참고 : 주입 매일 사용하기 직전에 부설 판의 신선한 희석을하는 것이 중요합니다.
  2. 매일 IP 주입을 통해받는 사람 마우스에 희석 부설 판의 20 ㎎ / ㎏을 관리합니다.
  3. 60 ~ 100 mg의 총 투여 량까지 20 ㎎ / ㎏ 부설 판의 일상 IP 주사를 반복 / kg (즉, 80 ㎎ / ㎏ 총 복용량, 4 일 연속 부설 판의 20 ㎎ / ㎏을 투여) 전달되었습니다.

기증자 골수 세포의 3. 분리

참고 :이 프로토콜은 성공적으로 5 기증자 마우스로부터 BM 세포를 분리하고 제조에 사용되었습니다. 일반적으로 마우스 당 세포 수율은 12 ~ 16받는 사람 쥐를 이식하기에 충분 약 천 -4 천만 BMDCs입니다. 이상의 공여 쥐 필요하다면 프로토콜 따라서 조정될 필요가있다.

  1. 술판 조절 euth의 마지막 날 다음CO 2를 사용하여 (1-6개월 이전) GFP 기증자 마우스를 anize (또는 기관에서 받아 다른 안락사 절차에 의해). 이식 합병증받는 사람과 같은 성이다 동계 기증자를 사용하지 않도록합니다.
  2. 70 % 에탄올로 마우스 스프레이. 복부 및 사용하여 수술 가위에서 리프트 피부까지 복강 발목을 향해 다리에서 피부를 통해 절개를합니다. 발을 잡고 단단히 다리 조직을 노출 엉덩이쪽으로 발목으로부터 피부를 잡아 당깁니다.
  3. 고관절을 노출 대퇴골에서 근육과 지방 조직을 멀리 트림.
  4. 부드럽게 다리를 확장 도보로 당기면서, 고관절에 가위를 누릅니다. 그냥 대퇴골 자체를 절단하지 대퇴골 복용 치료의 머리 위에 잘라.
  5. , 불임을 유지 도보로 다리를 잡고 멸균 조직과 뼈의 표면을 문질러 뼈에 남아있는 모든 조직을 청소 도움이됩니다.
  6. 무릎 관절을 통해 절단에 의해 대퇴골과 경골을 분리하고멸균 PBS를 포함하는 배양 접시에서 대퇴골을 배치합니다. 얼음에 품어.
  7. 제거하고 비골은 경골에 연결되는 지점에서 절단하여 비골을 폐기합니다. 대퇴골과 배양 접시에서 경골를 놓고 얼음에 품어.
  8. 반복하여 다른 다리에 대한 3.2-3.7 단계, 그리고 필요한 경우, 추가 기증자 마우스. 뼈를 제거한 다음, 뜨거운 비드 살균기와 수술 도구를 소독 또는 후속 단계에 대한 멸균 새로운 도구를 사용합니다.
  9. 대퇴골의 경우, 집게와 대퇴골을 잡고 조심스럽게 '면도'수술 가위를 사용하여 말단 뼈를 종료합니다. BM 구멍을 노출하는 필요에 따라 뼈의 적은을 제거합니다.
  10. 멸균 PBS의 3 ㎖ 주사기를 입력하고 23 G 바늘을 연결합니다. 조심스럽게 BM 구멍에 바늘을 지루하게하고 멸균 배양 접시에 BM을 세척하십시오. 원하는 모든 세포의 제거를 보장하기 위해 바늘 포인트와 수질 공동을 긁어해야합니다. 추출 후,빨간 BM은 더 이상 볼 수없고 뼈가 지금 흰색 나타나는지 확인합니다.
  11. 반복 같은 배양 접시에 BM의 모든 풀링, 이후 대퇴골에 대한 3.9-3.10 단계를 반복합니다.
  12. 경골를 들어, 조심스럽게 집게로 경골과 '면도'경골이 BM 캐비티를 노출 무릎에 부착 된 끝을 잡고. 적색 가시 BM이 끝나는 뼈를 따라 두 번째 컷을 확인합니다.
  13. 멸균 PBS의 3 ㎖ 주사기를 입력하고 25 G 바늘을 연결합니다. 조심스럽게 (무릎에 부착 된 끝에서) BM 구멍에 바늘을 삽입하고 대퇴골에서 BM을 포함하는 배양 접시에 BM을 세척하십시오. 모든 세포를 제거하기 위해 바늘 BM 공동의 벽을 긁어. 추출 후, 빨간색 BM은 더 이상 볼 수없고 뼈가 지금 흰색 나타나는지 확인합니다.
  14. 반복 같은 배양 접시에 BM의 모든 풀링, 이후의 경골에 대한 3.12-3.13 단계를 반복합니다.
  15. 부드럽게 C를 해리 1 ML의 피펫 팁과 BM을 씹다ELL 학생.
  16. 멸균 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 40 μM 바스켓 필터를 통해 세포 현탁액 합격. 남아있는 세포를 얻을 원심 분리 튜브에 필터를 통해이를 전송하는 PBS로 접시를 씻어.
  17. 4 ° C에서 450 XG에 5 분 동안 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다.
  18. 적혈구 용해하는 버퍼의 3 ㎖의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 8.5 분 동안 얼음에서 인큐베이션.
  19. 용균 버퍼를 해소하기 위해 멸균 PBS의 ~ 30 ML을 추가합니다.
  20. 4 ° C에서 450 XG에 5 분 동안 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다.
  21. 멸균 PBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. 얼음에 보관하십시오.
  22. 세포 균질 작은 분취 량을 가지고 PBS로 희석 (1 : 100 1 마우스 1 : 200이 쥐 등)를 이용하여 혈구 세포 수를 정량화.
  23. 8 × 106 세포 / ml에 세포 현탁액을 희석시키고, 얼음에 주입 될 때까지 배양한다.

4. 골수 이식

  1. 인터넷LL 각 마우스에 대한 희석 세포 현탁액 300 μL와 (28 G 인슐린 바늘) 0.5 ML의 주사기를 주입한다. 주사기에 존재하는 공기 방울을 제거해야합니다.
  2. 가열 패드 컨디셔닝받는 마우스를 함유하는 마우스 케이지를두고 꼬리 정맥이 팽창 할 수있다.
  3. 구속 장치에서받는 마우스와 장소를 가져 가라. 70 % 에탄올로 적셔 수술 거즈와 꼬리를 닦습니다.
  4. 단단히 꼬리를 잡고 경사 위로 부드럽게 측면 꼬리 정맥 중 하나에 바늘을 삽입하고 세포 현탁액을 주입.
  5. 출혈이 새로운 깨끗한 케이지에 마우스를 도입하기 전에 멈출 때까지 주사 부위에 수술 거즈를 잡습니다.

5. BM 키메라의 정도를 추정

주 : 키메라 수준 일주 BMT 이후에 말초 혈액에서 통상적 변수이며, 이러한 키메라 레벨은​​ 통상 적어도 이주 BMT 이후로 추정된다. Chim은의 수준erism 포스트 BMT 3-4주 내 말초 혈액에서> 80 % GFP + 세포에 도달해야한다.

  1. FACS 완충액 (PBS 2 mM의 EDTA + 2 % 소 태아 혈청)을 준비한다.
    주 : FACS 완충액 몇 주 동안 39 ° C에서 저장 될 수있다.
  2. 금지 튜브에 마우스를 놓고 측면 복재 정맥을 노출 후방 다리에 털을 면도.
  3. 얇게 코트 석유 젤리와 피어스 25 G 바늘과 복재 정맥과 다리.
  4. 헤파린 코팅 된 모세관에 혈액의 약 50 μl를 수집합니다. FACS 완충액 1 ㎖를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브로 혈액을 추가한다. 반전에 의해 튜브를 혼합하고 얼음에 저장합니다.
  5. 다시 케이지에 마우스를 반환하기 전에 정지 출혈까지 주사 부위에 수술 거즈를 잡습니다.
  6. X 900 g에서 5 분 동안 혈액 샘플을 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다.
  7. 적혈구 용혈 버퍼 500 μL에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 8.5 분 동안 얼음에서 인큐베이션.
  8. 용균 버퍼를 해소하기 위해 FACS 버퍼의 1 ML을 추가합니다.
  9. g X 900에서 5 분 동안 원심 분리. 제거하고 상층 액을 버린다.
  10. 적혈구 용혈 버퍼 500 μL에 두 번째 용해 단계를 수행합니다. 8.5 분 동안 얼음에서 인큐베이션.
  11. 용균 버퍼를 해소하기 위해 FACS 버퍼의 1 ML을 추가합니다.
  12. g X 900에서 5 분 동안 원심 분리. 제거하고 상층 액을 버린다. 펠렛은 이제 흰색 있는지 확인합니다.
    주 : 펠렛이 여전히 적색 나타나면 추가적인 분해 단계는 다음 단계로 진행하기 전에 필요할 수있다.
  13. FACS 완충액 1 ㎖에서 펠릿을 다시 일시. g X 900에서 5 분 동안 원심 분리. 제거하고 상층 액을 버린다.
  14. FACS 완충액 300 μL의 펠릿을 다시 중지하고 유세포 사용 GFP + 세포를 정량화 (주 :이 시점에서 셀로부터 임의의 면역 염색은 표준 기술을 이용하여 수행 될 수 있으며, 종래는 유세포 분석 유동).

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Representative Results

60 ~ 100 mg을 투여 / 부설 판의 kg은 일반적으로 잘 마우스에 의해 허용됩니다. 그러나 동물은 일반적으로 식습관을 격려하기 위해 조사 해바라기 씨 등의 치료와 보완 될 필요가있다 조절 단계 (~ 5 ~ 10 %) 때문에 다이어트 중에 체중을 잃게됩니다. 말초 혈액에서> 80 % GFP + 세포의 키메라와 BM의 수준은 60 ~ 100 ㎎ / ㎏ 부설 판 (7)을 사용하여 지속적으로 달성해야한다. 우리의 실험은 성공적으로 말초 혈액 및 BM에서> 80 % GFP + 세포와 100여 키메라 쥐를 생성하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있으며, 동계 기증자와받는 사람을 사용하는 경우 우리의 BMTs의 거의 모든 성공이다. 그림 1 키메라의 수준이 주간 정량 표시 성공적인 동계 BMT 수용 100 ㎎ / kg으로 조절 술판 마우스의 말초 혈액에서 (N = 3)과 동종 BMT 실패를 수신하는 80 ㎎ / kg으로 조절 술판 마우스 (N = 3). > 80 % 수준은 키메라 typicall 아르Y 3 ~ 4 주까지 설립 후 BMT. 그림 2는 말초 혈액 성공 및 실패 BMT를 보여주는 대표 FACS 데이터입니다. (3)이 키메라는 BM에서 1 년 이상 설립 남아 있음을 보여줍니다 (N = 3), 및 그림 비히클 그 컨디셔닝 된 BM 키메라를 유도하기에 충분하지 않은 (N = 3). 이 동안의 BM 키메라의 농도에서 유의 한 차이는 60 내지 100 ㎎ / kg 술판, GFP + 세포는 용량 의존적 방식으로 CNS 내에서의 축적 용량을 이용하여 달성하지 않는다. 또한,이 축적 극적 같은 ALS 7과 같은 신경 퇴행성 장애로 증가한다.도 4는 야생형 (N> 20) 및 ALS 마우스 모델 (n은> 20)에서 척수의 요부 영역 내에 GFP + 세포의 축적을 도시한다.

그림 1
그림 1.받는 사람 마우스는 조절술판와 동계 도너로부터 GFP + 골수 세포를 이식 혈액 지속 키메라 비율의 높은 수준을 달성한다. 동계 하였다 술판 100 ㎎ / kg으로 조절 성공적으로 이식 된 마우스의 말초 혈액에서 GFP + 키메라를 도시 주간 유세포 데이터 골수 이식 (검정)과 성공적으로 이식 된 마우스 동종 골수 이식 (회색) 뒤에 술판의 80 ㎎ / kg으로 조절. 결과는 N = 3 마우스 / 그룹에서 수단, 오차 막대는 SEM을 나타냅니다.

그림 2
도 100 ㎎ / kg의 술판. (A) 산점도 도시 게이팅 전략, (B)으로 조절 실패 allogen 3주 생쥐 골수 이식 후 말초 혈액에서 GFP + 세포를 도시 2. 주제 유세포 데이터EIC 골수 이식, 및 (C) 성공적인 동계 골수 이식. 결과 N> 3 마우스의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 골수 일년 후 골수 이식에 GFP + 세포를 보여주는 3. 대표 유세포 데이터. (A) 산점도 (B), 차량 에어컨 생쥐 게이팅 전략을 도시하고, (C) 100 ㎎ / kg 술판 에어컨 쥐. 결과는 N = 3 마우스의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


도 4 골수 유래 세포는 골수 이식 주어진 술판 컨디셔닝 된 마우스의 CNS에 축적된다. (A, C) 야생형 마우스 및 늦은 (B, D)로부터 단리 척수의 요부 영역의 섹션의 면역 조직 화학적 분석을 병기 ALS 마우스. GFP + 세포는 녹색으로 표시됩니다. 결과는 각 모델에 대한 N> 20 마우스의 대표 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

술판 조절은 쉽게 감지 할 수 있습니다 조혈 세포와 생쥐에서 높은 수준의 BM의 키메라의 생성을 허용합니다. 이러한 조절은, 조사 설비를 필요로하지 않고 행할 수있다. 더욱이,이 프로토콜에 설명 술판의 투여 량으로 골수 억제는 잘 조사 골수 투여에 의한 독성 부작용을 최소화 허용하고, 따라서 더 많은 아르 젊은 오래 또는 병에 걸린 마우스에서 BM의 키메라를 생성하기 위해 더 적합한 기술 일 수있다 조사를 골수에 민감. 술판로 달성보다 낮 키메라 레벨을 초래할 수 있으며, 일부 RIC 프로토콜 부작용을 최소화하기 위해 전신 조사 낮은 비 myleoablative 투여 량을 사용하지만, 이러한 프로토콜은 여전히​​ 방사선의 투여 량에 따라, 조사 시설을 필요 에어컨 (13). 최근 treosulfan는 BM 조절 8, 14 사용되어왔다. 술판처럼, treosulfan 컨디셔닝oning 및 BMT는 14 BM 키메라의 고도의 마우스를 생성 할 수있다. 그러나 treosulfan 북미에서 쉽게 달성되지 않으며, 술판 조절에 키메라의 비교 수준을 달성하는 데 필요한 treosulfan의 용량은 부설 판 (~ 5 ~ 10 배) (14)보다 훨씬 높다. 또한, 부설 판에 비해 마우스의 독성 부작용 (K. Peake에, J. 매닝, 그리고 C. 크리거, 관찰되지 않은)가 나타납니다 treosulfan이 효과적인 투여 량. 말초 혈액 키메라 또한 외과 도너 마우스받는 마우스의 순환을 연결하는 것을 포함 parabiotic 생쥐의 발생을 통해 확립 될 수있다. parabiosis 만 주위염 중 50 % 도너 세포 ~ 결과 기술적으로 어려운 과정이지만 전체 BM 이식 달리 parabiosis는, 순환에 BM-제한 전구 세포를 도입하지 않고 이상의 생체 방식으로 확립되어야 말초 혈액 키메라 허용받는 사람 쥐 (15)의 pheral 혈액.

여기에 설명 된 프로토콜은 이식 거부 반응의 가능성을 최소화하기 위해, 동일한 성별 아르 신과 도우너 생쥐를 사용뿐만 아니라 수신자 기증자 동계 마우스 균주를 사용에 의존한다. 많은 적합한 기증자와받는 사람 균주가 시판되고 있지만, 일치하지 않는 동종 쥐에서 키메라를 설정 (즉, MHC 일배 체형에 유의 한 차이가) 문제가 될 수 있습니다. 동종 마우스는 마우스에만 적합 가능한 그러한 경우, 연구는 예비 컨디셔닝 제 술판 안정 키메라 비율​​의 높은 수준을 선도 할 수있는 경우 결정하기 위해 마우스의 작은 그룹에 수행되어야한다. 모든 이식 생쥐가 지속 키메라 (~ 30 %)를 설립하지만, SJL받는 사람, 우리는 C57BL / 6에 C57BL / 6-GFP 마우스에서 분리 된 기증자 BMDCs 이식 어느 정도 성공을 거두었다는 것입니다. 시클로 포스 파 미드 이외에, 종종 강한 면역 억제제 U부설 판 (16)와 함께 임상 적으로 나오지, 동종 이식 성공률을 향상시키기 위해 사용될 수있다. C57BL / 6-GFP 세포가 혼합 된 C57BL / 6에 알츠하이머 병의 삼중 형질 전환 마우스 모델에 이식 하였다 그러나 129 유전 적 배경, 부 술판 및 시클로 컨디셔닝 안정 생착 반면 안정 BM 키메라 (도 2B)를 생성하기에 불충분했다 치명적인 방사선 조사 가능했다. 따라서, 동종 이식이 필요한 상황에서, 조사로 인해 발생하는 전체 myeloablation 심각한 면역 억제에보다 적절한 조절 처방 할 수있다.

몇 가지 추가 대책이 프로토콜의 키메라 비율​​ 및 일관성을 최대화하기 위해주의해야한다. 그것은 부설 판의 효능이 장기간 감소 될 나타나는 부설 판의 신선한 희석이 이상적으로 직전 술판 투여, 주사 준비하는 것이 중요합니다저장. 세포 해리를 분쇄하여 BM 때 또한, 상기 BM 세포를 손상시키지 않도록 부드럽게 넣도록하는 것이 중요하다. 이것은 완전히 더 좋을 것이다 결과적으로 해리 세포의 약간 낮은 수율, 전반적인 건강과 품질을 해리, 그리고 아르 조직의 일부 덩어리가 발생할 수있다. 마찬가지로, 펠릿의 재 정지가 필요한 단계는 조심스럽게 수행해야합니다.

키메라의 높은 수준은 지속적으로 달성 될 수 60, 80 및 100 ㎎ / kg 부설 판 (7)의 용량 (도 1-3). 또한, 야생형 8,97 ALS 마우스의 CNS에서 GFP + 세포의 축적 용량 의존적으로 증가한다. 우리 등도 야생형 마우스에 비해 7,8,10 신경 퇴행의 마우스 모델의 CNS 내 GFP + 세포 축적의 증가를 관찰 하였다. GFP + BM의 더 큰 수의 치명적인 조사 결과DC가 60 ~ 100 ㎎ / ㎏ 투여 부설 판 (7)의 최근의 연구는 뇌의 GFP + 세포의 높은 숫자의 부설 판 (125 ㎎ / ㎏) 결과의 골수 투여 량은 몸 전체 조사 구에 비해 시사하는 비교. 증거는 치사량의 방사선 조사 된 마우스로 CNS BMDC 항목 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 중단에, 적어도 부분적으로 기인 할 수 있음을 시사한다. 술판은 CNS (11) 내에서 혈청 단백질 (알부민)의 부재에 기초 BBB를 방해 나타나지 않지만 술판 용이 BBB (17, 18)을 통과 할 수 있고, 따라서 그것은 술판 컨디셔닝 내의 틈새 공간을 열 수 있다고 제안되어왔다 이후 BMDCs 8 가득 CNS. 흥미롭게도, 윌킨슨 등.의 결과는 치명적으로 조사 된 마우스에서 GFP + 세포의 축적이 inflammator에 의한 것으로 보인다 동안 GFP + 세포에 의한 케모카인 모집 메커니즘에 술판 조건 쥐의 중추 신경계에 축적하는 것이 좋습니다조사 자체 (9)에 의해 생성 된 Y 메커니즘. Treosulfan는 CNS 컨디셔닝하도록 나타나지 않고 결과적으로 몇 GFP + 세포 treosulfan 조건 마우스 (8)의 CNS에서 발견되었다. 술판가 간, 폐, 신장 및 6을 대상으로 알려져 있지만 이는, CNS 이외의 조직에 미칠 수있는 효과 술판의 상이한 투여 량을 결정하기 위해 남아있다. 새로운 실험 술판의 도즈를 선택할 때 다른 조직을 컨디셔닝 수 술판을 참작하여야한다.

이 술판 컨디셔닝 프로토콜을 수행하는 비교적 간단하지만, BM 키메라 생쥐의 발생이 조혈 세포를 조사하는데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 유전자 엔지니어 마우스 및 BMDCs하는 능력과 함께 시판 트랜스 제닉 마우스의 다양한이 극적이 프로토콜의 전위를 증가시킨다. 예를 들어, 다양한 마우스 모델은 GFP 발현에 제한이있는 경우가 존재myelomonocytic 혈통 셀 (19)에 주로 GFP를 표현 등 CX3CR1-GFP 마우스와 같은 특정 세포 유형 및 계통. 이러한 마우스는 생체 내에서 특정 조혈 세포 집단의 조사를 허용 공여체로서 사용될 수있다. 상이한 형광 물질의 개수 또한, 경쟁 분석 (20)에 이용 될 수있는 기술을 이식하고 두 개 이상의 별개의 기증자 BMDCs을 모니터하기 위해 사용될 수 GFP 외에도 존재한다. 또한, 질병의 상이한 트랜스 제닉 마우스 모델의 수는 그 질환의 다양한 BMDCs의 역할을 조사하기 위해 수신자로서 사용될 수있는. 이식 후, 도너 세포는 면역 조직 화학 법을 사용하여 분석 할 수 있고, 또는 FACS에 의해 단리 및 생화학 적 기술을 사용하여 조사 범위. 또한, 이러한 두 광자 현미경 같은 첨단 영상 기술은 GFP 형광 물질 (21) 등의 생체 내에서 실시간 검출을 위해 구현 될 수있다. 궁극적으로, 그것을BMDCs는 유전자 조작 및 술판 에어컨받는 이러한 CNS 같은 표적 조직 치료 분자를 전달하기 위해 사용될 수 있다는 것을 구상한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

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References

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