Busulfan come mielosoppressiva agente per la generazione stabile ad alto livello di midollo osseo chimerismo nei topi

Medicine

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Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

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Abstract

Protocol

NOTA: Etica Dichiarazione: Questo protocollo è stato esaminato e approvato dal Comitato di Simon Fraser University Animal Care (UACC; consentire numeri 1037K-12 e 1060K-03) ed è in conformità con il Consiglio canadese cura degli animali, la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e la direttiva del Consiglio CEE.

1. Considerazioni particolari

NOTA: Busulfan è citotossico. Manipolare e smaltire secondo la scheda dati di sicurezza e le linee guida istituzionali.

  1. Eseguire tutte le tecniche asetticamente in una cappa a flusso laminare.
  2. Sterilizzare strumenti prima dell'uso avvolgendo in un materiale di imballaggio appropriato, ad esempio un pacchetto buccia e autoclave.
  3. Mentre il rischio di infezione è più basso con condizionata busulfan rispetto a irraggiamento, gestire gli animali solo in una cappa a flusso laminare per le prime 2 settimane dopo il trapianto.

2. CondizionamentoTopi riceventi

  1. Diluire busulfan a 3 mg / ml con soluzione salina sterile tamponata fosfato (PBS).
    NOTA: E 'importante fare una nuova diluizione del busulfan appena prima di utilizzare ogni giorno di iniezione.
  2. Somministrare 20 mg / kg di busulfan diluito per topi riceventi tramite iniezione IP quotidiana.
  3. Ripetere iniezioni IP giornaliera di 20 mg / kg fino busulfan una dose totale di 60-100 mg / kg è stata consegnata (cioè, per una dose totale di 80 mg / kg, somministrare 20 mg / kg di busulfan per 4 giorni consecutivi).

3. Isolamento del donatore di midollo osseo Cells

NOTA: Questo protocollo è stato utilizzato con successo per isolare e preparare cellule BM da un massimo di 5 topi donatori. Tipicamente la resa delle cellule per il mouse è di circa 30-40.000.000 BMDCs, che è sufficiente a trapiantare 12-16 topi riceventi. Se sono necessarie più topi donatori il protocollo può avere bisogno di essere adeguato di conseguenza.

  1. Dopo l'ultimo giorno di busulfan condizionata euthanize un topo GFP donatore (1-6 mesi) con CO 2 (o da altra procedura eutanasia accettato istituto). Per evitare complicazioni innesto utilizzano donatori singenici che sono dello stesso sesso come destinatari.
  2. Spray mouse con etanolo al 70%. Pelle Sollevare le forbici chirurgiche addome e con fare un'incisione attraverso la pelle dalla cavità addominale la gamba verso la caviglia. Afferrando il supporto, saldamente tirare la pelle dalla caviglia verso l'anca esposizione del tessuto gamba.
  3. Tagliare via muscoli e tessuto adiposo dal femore per esporre l'articolazione dell'anca.
  4. Mentre delicatamente tirando sul piede di estendere la gamba, premere i forbici contro l'anca. Tagliare appena sopra la testa del femore facendo attenzione a non tagliare femore stesso.
  5. Per aiutare a mantenere la sterilità, tenere la gamba dal piede e pulire qualsiasi restante tessuto dalle ossa strofinando la superficie ossea con i tessuti in autoclave.
  6. Separare femore e tibia tagliando attraverso l'articolazione del ginocchio ecollocare il femore in un piatto di coltura contenente PBS sterile. Incubare in ghiaccio.
  7. Rimuovere e gettare perone tagliando nei punti in cui la fibula collega alla tibia. Posizionare la tibia nel piatto cultura con il femore e incubare su ghiaccio.
  8. Ripetere i passaggi 3,2-3,7 per l'altra gamba, e se necessario, topi donatori supplementari. Dopo la rimozione delle ossa, sterilizzare gli strumenti chirurgici con un tallone sterilizzatrice a caldo o utilizzare una nuova serie di strumenti sterili per le fasi successive.
  9. Per i femori, tenere il femore con una pinza e con le forbici chirurgiche attentamente 'barba' distale finisce l'osso. Rimuovere il meno dell'osso se necessario per esporre la cavità BM.
  10. Riempire una siringa con 3 ml di PBS sterile e inserire un ago G 23. Portava con attenzione l'ago nella cavità BM e lavare la BM in un piatto di coltura sterile. Assicurati di raschiare cavità midollare con la punta dell'ago per garantire la rimozione di tutte le cellule desiderate. Dopo l'estrazione,assicurare che il rosso BM non è più visibile e l'osso appare ora bianco.
  11. Ripetere i passaggi 3,9-3,10 per femori successivi, mettendo in comune tutte le BM nello stesso piatto cultura.
  12. Per la tibie, tenere la tibia con una pinza e con attenzione 'barba' alla fine dove la tibia è stata allegata al ginocchio per esporre la cavità BM. Fare un secondo taglio lungo l'osso in cui termina la BM rosso visibile.
  13. Riempire una siringa con 3 ml di PBS sterile e inserire un ago G 25. Inserire delicatamente l'ago nella cavità BM (dalla fine che era attaccato al ginocchio) e lavare la BM nel piatto di coltura contenente la BM dal femore. Raschiare le pareti della cavità BM con l'ago per rimuovere tutte le cellule. Dopo l'estrazione, assicurarsi che il rosso BM non è più visibile e l'osso ora appare bianco.
  14. Ripetere i passaggi 3,12-3,13 per la successiva tibie, riunendo tutti i BM nello stesso piatto cultura.
  15. Triturare delicatamente la BM con un 1 ml pipetta punta a dissociare la cells.
  16. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro a cestello 40 mM in una sterile 50 mL provetta da centrifuga. Sciacquare il piatto con PBS per ottenere tutte le cellule residue e trasferire questo attraverso il filtro nel tubo da centrifuga.
  17. Centrifugare per 5 minuti a 450 xga 4 ° C. Rimuovere e scartare il surnatante.
  18. Risospendere il pellet in 3 ml di eritrociti tampone di lisi. Incubare in ghiaccio per 8.5 min.
  19. Aggiungi ~ 30 ml di PBS sterile per placare il buffer di lisi.
  20. Centrifugare per 5 minuti a 450 xga 4 ° C. Rimuovere e scartare il surnatante.
  21. Risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile. Mantenere su ghiaccio.
  22. Prendere una piccola aliquota della omogenato cellulare e diluire con PBS (1: 100 per 1 mouse, 1: 200 per 2 topi, etc.) per quantificare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
  23. Diluire la sospensione cellulare a 8 x 10 6 cellule / ml e incubare in ghiaccio fino iniezione.

4. trapianto di midollo osseo

  1. Fill una siringa da 0,5 ml (con insulina ago 28 G) con 300 ml di sospensione cellulare diluita per ogni mouse da iniettare. Assicurarsi di rimuovere eventuali bolle d'aria presenti nella siringa.
  2. Posizionare la gabbia del mouse che contiene i topi riceventi condizionati su una piastra elettrica e consentire le vene coda di dilatarsi.
  3. Prendete un mouse destinatario e posto nel dispositivo di ritenuta. Pulire la coda con una garza chirurgica imbevuta di etanolo al 70%.
  4. Tenere saldamente la coda e lo smusso up, inserire delicatamente l'ago in una delle vene coda laterali e iniettare la sospensione cellulare.
  5. Tenere garza chirurgica sul sito di iniezione fino a emorragia si ferma prima di introdurre il mouse in una nuova gabbia pulita.

5. valutare l'estensione di BM chimerismo

NOTA: i livelli di chimerismo sono in genere variabile nel sangue periferico dopo 1 settimana post-BMT, e come tali livelli chimerismo sono normalmente stimate almeno 2 settimane dopo BMT. Livelli di chimerism dovrebbe raggiungere> 80% GFP + cellule del sangue periferico entro 3-4 settimane dopo BMT.

  1. Preparare tampone FACS (2 mM EDTA + 2% di siero fetale bovino in PBS).
    NOTA: tampone FACS può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane.
  2. Posizionare il mouse in un tubo di contenimento e accorciare il pelo sulla gamba posteriore, per esporre la vena safena laterale.
  3. Cappotto sottilmente la gamba con vaselina e forare la vena safena con un ago 25 G.
  4. Raccogliere circa 50 ml di sangue con un tubo capillare eparina rivestito. Aggiungere il sangue in una provetta micro-centrifuga contenente 1 ml di tampone FACS. Mescolare il tubo per inversione e memorizzare su ghiaccio.
  5. Tenere garza chirurgica sul sito di iniezione fino a quando il sanguinamento si arresta prima di tornare mouse avanti alla gabbia.
  6. Centrifugare i campioni di sangue per 5 min a 900 x g. Rimuovere e scartare il surnatante.
  7. Risospendere il pellet in 500 ml di eritrociti buffer di lisi. Incubare in ghiaccio per 8.5 min.
  8. Aggiungere 1 ml di tampone FACS per placare il buffer di lisi.
  9. Centrifugare i campioni per 5 min a 900 x g. Rimuovere e scartare il surnatante.
  10. Eseguire una seconda fase di lisi in 500 ml di buffer di lisi degli eritrociti. Incubare in ghiaccio per 8.5 min.
  11. Aggiungere 1 ml di tampone FACS per placare il buffer di lisi.
  12. Centrifugare i campioni per 5 min a 900 x g. Rimuovere e scartare il surnatante. Controllare che il pellet è ora bianca.
    NOTA: Se il pellet appare ancora rosso, un passo lisi supplementare può essere necessario prima di procedere alla fase successiva.
  13. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone FACS. Centrifugare i campioni per 5 min a 900 x g. Rimuovere e scartare il surnatante.
  14. Risospendere il pellet in 300 ml di tampone FACS e quantificare + cellule GFP mediante citometria a flusso (NOTA: A questo punto qualsiasi immunocolorazione desiderato delle cellule può essere eseguita, utilizzando tecniche standard, prima analisi citofluorimetrica).

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Representative Results

La somministrazione di 60-100 mg / kg di busulfan è generalmente ben tollerato dai topi. Tuttavia, gli animali in genere perdere peso durante la fase di condizionamento (~ 5-10%) e, quindi, la dieta può essere integrata con gli ossequi, come semi di girasole irradiati per incoraggiare mangiare. Livelli di chimerismo di GFP + cellule> 80% nel sangue periferico e BM dovrebbero essere sempre raggiungibili con 60-100 mg / kg busulfan 7. Il nostro laboratorio ha utilizzato con successo questo protocollo per generare oltre 100 topi chimerici con> 80% GFP + cellule del sangue periferico e BM, e praticamente tutti i nostri BMTs sono riuscita quando si utilizzano i donatori singenici e riceventi. La figura 1 mostra i livelli di chimerismo quantificati settimanale nel sangue periferico di topi condizionati con 100 mg / kg busulfan riceve un successo singenici BMT (n = 3) e topi condizionati con 80 mg / kg busulfan ricevono un'errata allogenico BMT (n = 3). Livelli chimerismo> 80% sono typically stabilita da 3-4 settimane post-BMT. figura 2 è FACS dati rappresentativi di sangue periferico mostra un BMT successo e insuccesso. La Figura 3 mostra che questo chimerismo rimane costituita per almeno un anno nel BM (n = 3), e che condizionata con veicolo non è sufficiente ad indurre BM chimerismo (n = 3). Mentre non ci sono differenze significative nei livelli di BM chimerismo ottenuti utilizzando dosi di 60-100 mg / kg busulfan, cellule GFP + si accumulano all'interno del sistema nervoso centrale in modo dose-dipendente. Inoltre, questo accumulo è drammaticamente aumentata in malattie neurodegenerative come la SLA 7. Figura 4 illustra GFP + accumulo di cellule all'interno della regione lombare del midollo spinale in una wild-type (n> 20) e modello di topo ALS (n> 20).

Figura 1
Figura 1. topi riceventi condizionaticon busulfan e trapiantato con cellule GFP + midollo osseo da un donatore singenici raggiungere un elevato livello di chimerismo sostenuta nel sangue. I dati di citometria a flusso settimanali mostrano GFP + chimerismo nel sangue periferico di topi trapiantati con successo condizionata con 100 mg / kg di busulfan seguite da singenici trapianto di midollo osseo (nero) e topi senza successo trapiantati condizionata con 80 mg / kg di busulfan seguita da trapianto allogenico di midollo osseo (grigio). I risultati sono mezzi da n = 3 topi / gruppo, barre di errore rappresentano SEM.

Figura 2
Figura 2. I dati di citometria a flusso rappresentativi mostrano GFP + cellule del sangue periferico 3 settimane dopo il trapianto di midollo osseo in topi condizionati con 100 mg / kg di busulfan. (A) Dispersione strategia che mostra gating, (B) un allogen infruttuosoEIC trapianto di midollo osseo, e (C) un trapianto di midollo osseo singenico successo. I risultati sono rappresentativi di n> 3 topi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Dati di citometria a flusso rappresentativi mostrano GFP + cellule del trapianto di midollo osseo 1 anno dopo l'midollo osseo. (A) a dispersione mostra gating strategia, (B) veicoli condizionata topi, e (C) 100 mg / kg di busulfan condizionata topi. I risultati sono rappresentativi di n = 3 topi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Cellule derivate Figura 4. midollo osseo accumulano nel SNC di busulfan condizionata topi dato un trapianto di midollo osseo. Analisi immunoistochimica di sezioni della regione lombare del midollo spinale isolato da (A, C) wild type e topi (B, D) ritardo stadio della malattia topi affetti da SLA. Cellule GFP + sono mostrati in verde. I risultati sono immagini rappresentative n> 20 topi per ogni modello. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Condizionata busulfan consente la generazione di alto livello BM chimerismo in topi con cellule ematopoietiche che sono facilmente rilevabili. Questo condizionamento può essere eseguita senza la necessità di impianti di irradiazione. Inoltre, mielosoppressione con le dosi di busulfan descritto in questo protocollo è ben tollerato, riducendo al minimo gli effetti collaterali tossici causati da dosi mieloablativi di irradiazione, e quindi può essere una tecnica più adatta a generare BM chimerismo nei giovani, vecchi, malati o topi che sono più suscettibile di mieloablativa irradiazione. Alcuni protocolli RIC utilizzano basse dosi non myleoablative di irradiazione corporea totale per minimizzare gli effetti collaterali, ma questi protocolli ancora richiedono impianti di irradiazione e, a seconda della dose di irradiazione, può causare livelli chimerismo che sono inferiori a quelle ottenibili con busulfan condizionata 13. Recentemente, Treosulfan è stato usato per BM condizionata 8,14. Come busulfan, conditi Treosulfanoning e BMT è capace di generare topi con un alto grado di chimerismo nel BM 14. Tuttavia, Treosulfan non è facilmente raggiungibile in Nord America, e la dose di Treosulfan necessaria per raggiungere livelli comparabili di chimerismo al condizionamento busulfan è significativamente superiore busulfan (~ 5-10 volte) 14. Inoltre, a queste dosi efficaci Treosulfan sembra avere effetti collaterali più tossici nei topi rispetto a busulfan (K. Peake, J. Manning, e C. Krieger, osservazioni non pubblicate). Periferico chimerismo sangue può anche essere stabilito attraverso la generazione di topi parabiotic, che comporta chirurgicamente collegano la circolazione di un topo ricevente ad un mouse donatore. A differenza di interi trapianti BM, parabiosi consente periferiche chimerismo sangue per stabilire in modo più fisiologico senza introdurre cellule progenitrici BM-ristrette nella circolazione, anche se parabiosi è una procedura tecnicamente impegnativo, che si traduce solo in ~ cellule del donatore del 50% nei perisangue pheral di destinatario topi 15.

Il protocollo descritto qui invoca usando topi riceventi e donatori che sono dello stesso sesso, nonché utilizzando destinatario e topo donatore ceppi singenici, al fine di minimizzare la possibilità di rigetto del trapianto. Anche se molti ceppi donatori e riceventi adatti sono disponibili in commercio, che stabilisce chimerismo in corrispondenti topi allogenico (cioè differire in modo significativo in MHC aplotipo) può essere problematico. Nei casi in cui topi allogeniche sono gli unici topi idonee, uno studio preliminare deve prima essere effettuata su un piccolo gruppo di topi per determinare se condizionata busulfan è in grado di condurre ad un alto grado di chimerismo stabile. Abbiamo avuto un certo successo il trapianto BMDCs donatori isolati da topi C57BL / 6-GFP in C57BL / 6, destinatari SJL, anche se non tutti i topi trapiantati stabiliti chimerismo sostenuta (~ 30%). L'aggiunta di ciclofosfamide, un forte agente immunosoppressivo spesso used in collaborazione con busulfan clinicamente 16, possono essere utilizzati per migliorare il tasso di successo dei trapianti allogenici. Tuttavia, quando le cellule / 6-GFP C57BL sono stati trapiantati in un modello di topo transgenico tripla della malattia di Alzheimer in un C57BL / 6 mista; 129 genetica sfondo, busulfan e ciclofosfamide condizionata erano insufficienti per generare chimere BM stabili (Figura 2B), considerando che attecchimento stabile è stato possibile dopo irradiazione letale. Così, in situazioni in cui sono richieste trapianti allogenici, l'irradiazione può essere un regime di condizionamento più corretta a causa della mieloablazione completo e l'immunosoppressione grave che si verifica.

Dovrebbero essere prese diverse misure supplementari al fine di massimizzare il chimerismo e la coerenza di questo protocollo. E 'fondamentale che diluizioni fresche di busulfan sono preparati per l'iniezione, idealmente appena prima della somministrazione busulfan, come la potenza di busulfan sembra essere ridotto a lungo terminestoccaggio. Inoltre, quando la triturazione BM dissociare le cellule, è importante farlo delicatamente per non danneggiare le cellule BM. Mentre questo può risultare in alcuni ciuffi di tessuto che non sono completamente dissociati, e di conseguenza una resa leggermente inferiore, la salute generale e la qualità delle cellule dissociate sarà migliore. Allo stesso modo, tutte le misure che richiedono risospensione del pellet dovrebbero essere fatto con delicatezza.

Alti livelli di chimerismo possono sempre essere raggiunti con il 60, ​​80 e 100 mg / kg di dosi busulfan 7 (figure 1 - 3). Inoltre, vi è un aumento dose-dipendente l'accumulo di GFP + cellule nel SNC di tipo selvaggio 8,9 e topi ALS 7. Noi e altri abbiamo anche osservato un aumento del numero di accumulare GFP + cellule nel sistema nervoso centrale dei modelli murini di neurodegenerazione rispetto ai topi wild-type 7,8,10. Risultati irradiazione letale in un numero ancora maggiore di GFP + BMDC rispetto a 60-100 mg / kg dosi di busulfan 7 sebbene uno studio recente suggerisce che una dose di busulfan mieloablativa (125 mg / kg) risultati in un maggior numero di cellule GFP + nel cervello rispetto al corpo di radiazione totale 9. L'evidenza suggerisce che BMDC ingresso nel SNC di topi irradiati lethally può essere dovuto, almeno in parte, alla rottura della barriera ematoencefalica (BBB). Mentre busulfan non sembra disturbare il BBB basata sull'assenza di proteine ​​del siero (albumina) all'interno del sistema nervoso centrale 11, busulfan è in grado di attraversare rapidamente la BBB 17,18 e quindi è stato suggerito che il condizionamento busulfan può aprire uno spazio di nicchia all'interno SNC che viene successivamente riempito da BMDCs 8. È interessante notare che i risultati di Wilkinson et al. Suggeriscono che le cellule GFP + si accumulano nel sistema nervoso centrale di busulfan condizionato topi a causa di un meccanismo di chemochine reclutamento mentre l'accumulo di cellule GFP + in topi irradiati letale sembra essere dovuto a inflammatormeccanismi y generati dalla stessa irraggiamento 9. Treosulfan non sembra condizionare SNC e quindi poche cellule GFP + sono stati trovati nel SNC di topi Treosulfan condizionata 8. Resta da determinare l'effetto diverse dosi di busulfan possono avere sui tessuti diversi dal sistema nervoso centrale, anche se busulfan è noto a bersaglio il fegato, polmoni e reni 6. Che busulfan può condizionare altri tessuti dovrebbero essere presi in considerazione quando si sceglie una dose di busulfan per nuovi esperimenti.

Mentre questo protocollo condizionata busulfan è relativamente semplice da eseguire, la generazione di topi con chimerico BM è un potente strumento che può essere usato per studiare cellule ematopoietiche. La vasta gamma di topi transgenici disponibili in commercio, insieme con la capacità di topi geneticamente ingegnere e BMDCs, aumenta notevolmente le potenzialità di questo protocollo. Ad esempio, esistono vari modelli murini in cui l'espressione GFP è limitato atipi specifici di cellule e linee, come i topi CX3CR1-GFP che esprimono GFP prevalentemente in cellule della linea mielomonocitica 19. Questi topi possono essere usati come donatori consentono la ricerca di specifiche popolazioni cellulari ematopoietiche in vivo. Un certo numero di differenti fluorofori esistono anche oltre al GFP, che può essere utilizzato per trapiantare e monitorare BMDCs da due (o più) donatori distinte, una tecnica che può essere impiegata per le prove di concorrenza 20. Inoltre, un certo numero di diversi modelli di topi transgenici di malattia esiste che può essere utilizzato come destinatari per studiare il ruolo di BMDCs in una varietà di disturbi. Dopo il trapianto, le cellule del donatore possono essere analizzati utilizzando immunoistochimica, o isolate da FACS e studiato utilizzando una gamma di tecniche biochimiche. Inoltre, le tecnologie di imaging avanzate come la microscopia a due fotoni possono essere implementate per vivere nella rilevazione vivo di fluorofori come la GFP 21. In definitiva,È previsto che BMDCs potrebbero essere geneticamente e utilizzati per fornire molecole terapeutiche per tessuti come il CNS in riceventi-busulfan condizionata bersaglio.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

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References

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