Busulfan כסוכן Myelosuppressive ליצירת ברמה גבוהה יציבה מח עצם chimerism בעכברים

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

הערה: אתיקה הצהרה: פרוטוקול זה נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת סיימון פרייזר (UACC; להתיר מספרי 1037K-1060K 12 ו- 03) ועומד במועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, מדריך NIH ל הטיפול ושימוש בחי מעבדה, והוראת מועצת EEC.

1. שיקולים מיוחדים

הערה: Busulfan הוא רעיל לתאים. נהלי טיפול והשלכה על פי גיליון נתוני בטיחות חומרים והנחיות מוסדיות.

  1. לבצע את כל טכניקות סביבה נקיות מחיידקים בזרימה למינרית.
  2. לעקר מכשירים לפני השימוש על ידי עטיפה בחומר אריזה מתאימה, כגון חבילת קליפה, ומעוקר.
  3. בעוד שהסיכון לזיהום נמוך עם אוויר busulfan בהשוואה לקרינה, להתמודד עם בעלי חיים רק בזרימה למינרית במשך 2 השבועות הראשונים שלאחר השתלה.

2. אוויר שלעכברים נמען

  1. לדלל busulfan עד 3 מ"ג / מיליליטר עם פוספט סטרילי שנאגרו (PBS).
    הערה: חשוב לעשות דילול טרי של busulfan רק לפני שימוש בכל יום של זריקה.
  2. לנהל 20 מ"ג / קילוגרם של busulfan המדולל לעכברי נמען באמצעות הזרקת IP יומית.
  3. חזור על זריקות IP יומיות של 20 מ"ג / קילוגרם busulfan עד מינון כולל של 60-100 מ"ג / קילוגרם נמסר (כלומר, ל- 80 מ"ג / קילוגרם מינון כולל, לנהל 20 מ"ג / קילוגרם של busulfan במשך 4 ימים רצופים).

3. בידוד של תאי מח העצם תורמים

הערה: פרוטוקול זה שמש בהצלחה לבידוד והכנת תאי BM ממרחק של עד 5 עכברי תורם. בדרך כלל תשואת התא לכל עכבר היא כ 30-40 מ'BMDCs, אשר די בו כדי להשתיל 12-16 עכברי נמען. אם יש צורך יותר עכברי תורם הפרוטוקול ייתכן שיהיה הצורך להיות בהתאם.

  1. בעקבות היום האחרון של euth אוויר busulfananize עכבר תורם GFP (ישן 05:59 חודשים) באמצעות CO 2 (או על ידי הליך המתת חסד אחר מקובל במוסד). כדי להימנע מסיבוכי שתל להשתמש תורמי syngeneic שאותו המין כמקבלים.
  2. תרסיס עכבר עם אתנול 70%. עור מעלית במספרי כירורגיות הבטן ושימוש עושה חתך דרך העור מחלל הבטן את הרגל לכיוון הקרסול. מחזיק הרגל, בתקיפות למשוך את העור מהקרסול לכיוון הירך חושפת את רקמת הרגל.
  3. חתוך את שריר ורקמת שומן מהירך לחשוף את מפרק הירך.
  4. תוך משיכת בעדינות על הרגל כדי להאריך את הרגל, לחץ על המספריים נגד מפרק הירך. לחתוך בדיוק מעל הראש של טיפול לקיחת עצם ירך לא לחתוך את עצם הירך עצמו.
  5. כדי לעזור לשמור על סטריליות, להחזיק את הרגל על ​​ידי הרגל ולנקות את כל רקמה שנותרה מהעצמות על ידי שפשוף פני השטח העצם עם רקמות autoclaved.
  6. הפרד את עצם הירך ועצם שוק על ידי חיתוך דרך מפרק הברך ולמקם את עצם הירך בצלחת תרבות המכילה PBS סטרילי. דגירה על קרח.
  7. להסיר ולסלק שוקית על ידי חיתוך בנקודות שבי שוקית מתחברת לעצם השוק. הנח את השוקה בצלחת התרבות עם עצם הירך ולדגור על קרח.
  8. חזור על שלבים 3.2-3.7 לרגל השנייה, ואם יש צורך, עכברים תורמים נוספים. לאחר פינוי העצמות, לעקר את הכלים כירורגיים עם מעקר חרוז חם או להשתמש סט חדש של כלים סטריליים לשלבים הבאים.
  9. לעצמות הירך, להחזיק את עצם הירך עם מלקחיים ובאמצעות מספריים כירורגיות בזהירות לגלח דיסטלי מסתיים מעל העצם. הסר קטן כמו של עצם הצורך לחשוף את חלל BM.
  10. ממלאי מזרק עם 3 מיליליטר של PBS סטרילי ולצרף מחט G 23. נשא בזהירות את המחט לתוך החלל בע"מ ולשטוף את BM לתוך צלחת תרבות סטרילי. הקפד לגרד את החלל הלשדי עם נקודת המחט על מנת להבטיח הסרה של כל התאים הרצויים. לאחר מיצוי,להבטיח שBM האדום הוא כבר לא נראה לעין והעצם מופיע כעת לבן.
  11. חזור על השלבים 3.9-3.10 לעצמות ירך שלאחר מכן, איגום כל BM באותה צלחת התרבות.
  12. לtibiae, להחזיק את עצם השוק עם מלקחיים ובזהירות "גילוח" הסוף שבו השוקה צורפה לברך לחשוף את חלל BM. לעשות חתך שני לאורך העצם שבו BM האדום הגלוי מסתיים.
  13. ממלאי מזרק עם 3 מיליליטר של PBS סטרילי ולצרף מחט 25 G. הכנס בעדינות את המחט לתוך החלל בע"מ (מהסוף שהיה מחובר לברך) ולשטוף את BM לתוך צלחת התרבות המכילה BM מעצמות הירך. לגרד את הקירות של חלל BM עם המחט כדי להסיר את כל התאים. לאחר מיצוי, להבטיח כי BM האדום הוא כבר לא נראה לעין והעצם מופיע כעת לבן.
  14. חזור על השלבים 3.12-3.13 לtibiae שלאחר מכן, איגום כל BM באותה צלחת התרבות.
  15. בעדינות triturate BM עם טיפ פיפטה 1 מיליליטר לניתק גאמות.
  16. להעביר את ההשעיה התא דרך מסנן סל 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 50 מ"ל. יש לשטוף את המנה עם PBS כדי לקבל את כל תאים שנותרו ולהעביר את זה דרך המסנן לתוך צינור צנטריפוגות.
  17. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C. להסיר ולסלק supernatant.
  18. להשעות מחדש את הכדור ב 3 מיליליטר של חיץ lysing כדורית אדומה. לדגור על קרח במשך 8.5 דקות.
  19. להוסיף ~ 30 מיליליטר של PBS סטרילי כדי להרוות את חיץ lysing.
  20. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C. להסיר ולסלק supernatant.
  21. מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של PBS סטרילי. שמור על קרח.
  22. קח aliquot קטן של homogenate התא ולדלל עם PBS (1: 100 לעכבר 1; 1: 200 עבור 2 עכברים, וכו ') כדי לכמת את המספר הסלולרי באמצעות haemocytometer.
  23. לדלל את ההשעיה התא עד 8 ​​x 10 6 תאים / מיליליטר ו דגירה על קרח עד הזרקה.

4. השתלת מח עצם

  1. Fill מזרק 0.5 מיליליטר (עם מחט אינסולין 28 G) עם 300 μl של השעיה תא מדוללת לכל עכבר להיות מוזרק. הקפד להסיר את כל בועות אוויר הנוכחיות במזרק.
  2. מניחים את כלוב העכבר שמכיל את עכברי נמען המותנה בכרית חימום ולאפשר ורידי הזנב להתרחב.
  3. קח עכבר נמען ומקום במכשיר ההרחקה. נגב את הזנב עם גזה טבולה כירורגית עם 70% אתנול.
  4. בתוקף להחזיק את הזנב ועם השיפוע של עד, בעדינות להכניס את המחט לתוך אחד מורידי הזנב לרוחב ולהזריק את ההשעיה התא.
  5. להחזיק גזה כירורגית באתר ההזרקה עד הדימום מפסיק לפני החדרת העכבר לכלוב נקי חדש.

5. הערכת היקף BM chimerism

הערה: רמות chimerism הן בדרך כלל משתנים בדם ההיקפי בשבוע שלאחר BMT 1, וכמו רמות chimerism כזה בדרך כלל נאמדים בלפחות 2 שבועות לאחר BMT. רמות של chimerism צריך להגיע> GFP 80% + תאים בדם ההיקפי בתוך 3-4 שבועות לאחר BMT.

  1. הכן חיץ FACS (2 EDTA 2% בסרום שור עוברי מ"מ + PBS).
    הערה: חיץ FACS יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  2. מניחים את העכבר בצינור מניעה ולגלח את הפרווה על הרגל האחורית כדי לחשוף את וריד saphenous לרוחב.
  3. מעיל דק הרגל עם וזלין ופירס וריד saphenous עם מחט 25 G.
  4. לאסוף כ -50 μl דם עם צינור נימי הפרין מצופה. הוסף את הדם לצינור מיקרו צנטריפוגות המכיל 1 מיליליטר של חיץ FACS. מערבבים את הצינור על ידי היפוך ולאחסן על קרח.
  5. להחזיק גזה כירורגית באתר ההזרקה עד הדימום מפסיק לפני החזרת עכבר חזרה לכלוב.
  6. צנטריפוגה דגימות הדם במשך 5 דקות ב 900 x g. להסיר ולסלק supernatant.
  7. להשעות מחדש את הכדור ב 500 μl של חיץ lysing כדורית אדומה. לדגור על קרח במשך 8.5 דקות.
  8. הוסף 1 מיליליטר של חיץ FACS כדי להרוות את חיץ lysing.
  9. צנטריפוגה הדגימות למשך 5 דקות ב 900 x g. להסיר ולסלק supernatant.
  10. לבצע צעד תמוגה שני ב 500 μl של חיץ lysing כדורית אדומה. לדגור על קרח במשך 8.5 דקות.
  11. הוסף 1 מיליליטר של חיץ FACS כדי להרוות את חיץ lysing.
  12. צנטריפוגה הדגימות למשך 5 דקות ב 900 x g. להסיר ולסלק supernatant. בדוק שהגלולה היא כעת לבנה.
    הערה: אם גלולה עדיין נראית אדומה, ייתכן שיהיה צורך שלב תמוגה נוסף לפני שימשיך לשלב הבא.
  13. מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ FACS. צנטריפוגה הדגימות למשך 5 דקות ב 900 x g. להסיר ולסלק supernatant.
  14. להשעות מחדש את הכדור ב 300 μl של חיץ FACS ולכמת GFP + תאים באמצעות cytometry הזרימה (הערה: בשלב זה כל immunostaining רצוי של התאים יכול להתבצע, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית, לפני ניתוח תזרים cytometric).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הממשל של 60-100 מ"ג / קילוגרם של busulfan בדרך כלל נסבל היטב על ידי עכברים. עם זאת, בעלי חיים בדרך כלל לרדת במשקל בשלב האוויר (~ 5-10%) ובכך הדיאטה ייתכן שיהיה צורך בתוספת פינוקים כגון זרעי חמניות מוקרנים לעודד אכילה. רמות של chimerism של GFP + תאים> 80% בדם ההיקפי וBM צריכה להיות ברות השגה באופן עקבי באמצעות 60-100 מ"ג / קילוגרם busulfan 7. המעבדה שלנו השתמשה בהצלחה בפרוטוקול זה כדי לייצר מעל 100 עכברי chimeric עם> GFP 80% + תאים בדם ההיקפי וBM, וכמעט כל BMTs שלנו הם מוצלחים בעת שימוש בתורמים ומקבלי syngeneic. איור 1 מציגה את הרמות של chimerism לכמת שבועיות בדם ההיקפי של עכברים ממוזגים עם 100 מ"ג / קילוגרם busulfan קבלת BMT syngeneic מוצלח (n = 3) והעכברים ממוזגים עם 80 מ"ג / קילוגרם busulfan קבלת BMT אלוגנאית לא מוצלח (n = 3). רמות chimerism> 80% הן typically הוקם על ידי 3-4 שבועות לאחר BMT. איור 2 הוא נתונים FACS נציג של דם היקפי מראה BMT מוצלח ולא מוצלח. איור 3 מראה כי chimerism זה נשאר הוקם לשנה אחת לפחות בבע"מ (n = 3), ו אוויר שעם רכב הוא לא מספיק כדי לגרום chimerism בע"מ (n = 3). אמנם יש הבדלים משמעותיים ברמות של chimerism BM מושגים באמצעות מינונים של 60-100 מ"ג / קילוגרם busulfan, תאי GFP + לצבור בתוך מערכת העצבים המרכזית באופן תלוי מינון. יתר על כן, הצטברות זו עלתה באופן דרמטי בהפרעות ניווניות כגון 7 ALS. איור 4 ממחיש GFP + הצטברות תאים בתוך האזור המותני של עמוד השדרה בwild-type (n> 20) ומודל ALS עכבר (n> 20).

איור 1
איור 1. עכברי נמען מותניםעם busulfan ומושתל עם תאי GFP + מח עצם מתורם syngeneic להשיג רמה גבוהה של chimerism ספג בדם. נתוני הזרימה cytometric שבועיים מראים GFP + chimerism בדם ההיקפי של עכברים מושתלים בהצלחה ממוזגת עם 100 מ"ג / קילוגרם של busulfan אחרי syngeneic השתלת מח עצם (שחור) ועכברים מושתלים ללא הצלחה ממוזגת עם 80 מ"ג / קילוגרם של busulfan אחרי השתלת מח עצם אלוגנאית (אפור). תוצאות הן אמצעי מn = 3 עכברים / קבוצה, ברים שגיאה מייצגים SEM.

איור 2
איור 2. נתוני הזרימה cytometric נציג מראים GFP + תאים בדם ההיקפי 3 שבועות לאחר השתלת מח עצם בעכברים ממוזגים עם 100 מ"ג / קילוגרם אסטרטגיה של busulfan. () Scatterplot מראה gating, (B) allogen לא מוצלח השתלת מח עצם EIC, והשתלת מח עצם syngeneic מוצלחת (C). תוצאות הן נציג מn> 3 עכברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
3. נתוני הזרימה cytometric נציג מראים GFP + תאים במח עצם 1 שנה לאחר השתלת מח עצם איור. Scatterplot () מראה gating אסטרטגיה, עכברים (B) רכב ממוזג, ועכברים (C) 100 מ"ג / קילוגרם busulfan מותנה. תוצאות הן נציג מn = 3 עכברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"תמיד"> איור 4
תאים שמקורם במח עצם 4. איור מצטברים במערכת העצבים המרכזית של עכברי busulfan מותנים ניתנו להשתלת מח עצם. ניתוח אימונוהיסטוכימיים סעיפים של האזור המותני של עמוד השדרה מבודד מ( A, C) עכברי סוג בר ו( B, D) מאוחר עכברי ALS שלב מחלה. תאי GFP + מוצגים בירוק. תוצאות הן תמונות מייצגות מn> 20 עכברים לכל דגם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אוויר Busulfan מאפשר לדור של chimerism BM ברמה גבוהה בעכברים עם תאי hematopoietic שהם לגילוי בקלות. אוויר זה יכול להתבצע ללא צורך במתקני קרינה. יתר על כן, myelosuppression עם המינונים של busulfan המפורטים בפרוטוקול זה נסבל היטב, מזעור תופעות לוואי רעיל הנגרמות על ידי מינוני myeloablative של קרינה, ולכן עשוי להיות טכניקה מתאימה יותר ליצירת chimerism BM בעכברים צעירים, זקנים, או חולים, כי הם יותר רגיש לקרינת myeloablative. כמה פרוטוקולי RIC להשתמש במינונים נמוכים, שאינו myleoablative מכלל קרינת גוף כדי למזער את תופעות לוואי השליליות, אך הפרוטוקולים הללו עדיין דורשים מתקני קרינה ו, בהתאם למינון של קרינה, עלול לגרום לרמות chimerism שנמוכות מאלה השגה עם busulfan אוויר 13. לאחרונה, treosulfan היה בשימוש כבר BM אוויר 8,14. כמו busulfan, conditi treosulfanoning וBMT הוא מסוגל לייצר עכברים עם רמה גבוהה של chimerism בBM 14. עם זאת, treosulfan הוא לא בקלות להשגה בצפון אמריקה, והמנה של treosulfan הנדרש כדי להשיג רמות דומות של chimerism לאוויר busulfan גבוהה משמעותי מbusulfan (~ 5-10 פי) 14. יתר על כן, במינונים היעילים אלה treosulfan נראה שיש תופעות לוואי רעילות יותר בהשוואה לעכברי busulfan (ק פיק, ג 'מאנינג, וג קריגר, תצפיות לא פורסמו). chimerism דם היקפי גם יכול להתקבל באמצעות דור של עכברי parabiotic, שניתוח כרוך מקשרים את זרימת עכבר נמען לעכבר תורם. בניגוד להשתלות BM כל, parabiosis מאפשר לchimerism דם ההיקפי שיוקם באופן פיסיולוגי יותר ללא החדרת תאים מוגבלים-BM למחזור הדם, אם כי parabiosis הוא הליך מאתגר מבחינה טכנית, כי תוצאות רק ב~ תאי תורם של 50% בפרידם pheral של עכברי נמען 15.

הפרוטוקול המתואר כאן מסתמך על שימוש בעכברי נמען ותורם שאותו המין, כמו גם שימוש בזני נמען ועכבר תורם syngeneic, כדי למזער את האפשרות של דחיית שתל. למרות שרבי זני תורם והמקבל מתאימים זמינים מסחריים, הקמת chimerism בעכברים אלוגנאית תואמים (כלומר, שונה באופן משמעותי בhaplotype MHC) יכול להיות בעייתי. במקרים כאלה שבי עכברים אלוגנאית הם העכברים המתאימים רק זמינים, צריך ראשון יבוצעו מחקר ראשוני על קבוצה קטנה של עכברים כדי לקבוע אם אוויר busulfan הוא מסוגל להוביל לרמה גבוהה של chimerism היציב. היו לנו הצלחה מסוימת השתלת BMDCs תורם מבודד מעכברי C57BL / 6-GFP לC57BL / 6; מקבלי SJL, אם כי לא כל העכברים המושתלים הוקמו chimerism ספג (~ 30%). התוספת של ציקלופוספמיד, סוכן מדכא את מערכת חיסון חזק לעתים קרובות used בשיתוף עם busulfan קליני 16, ניתן להשתמש כדי לשפר את שיעור ההצלחה של ההשתלות אלוגנאית. עם זאת, כאשר תאים / 6-GFP C57BL הושתלו מודל עכבר מהונדס משולש של מחלת אלצהיימר על C57BL / 6 מעורב; 129 רקע, busulfan וציקלופוספמיד אוויר גנטי אינם מספיקים ליצירת מפלצות יציבה בע"מ (איור 2), ואילו engraftment היציבה היה אפשרי לאחר הקרנה קטלנית. לפיכך, במצבים שבם השתלות אלוגנאית נדרשות, קרינה יכולה להיות משטר אוויר מתאים יותר בשל myeloablation המלא והדיכוי החיסוני חמור המתרחש.

כמה צעדים נוספים יש לנקוט על מנת למקסם את chimerism והעקביות של פרוטוקול זה. זה חיוני כי דילולים טריים של busulfan מוכנים להזרקה, באופן אידיאלי רק לפני ממשל busulfan, כעצמה של busulfan מופיעה להיות מופחתת עם טווח ארוךאחסון. בנוסף, כאשר triturating BM לנתק את התאים, חשוב לעשות זאת בעדינות כדי שלא לגרום נזק לתאי BM. אמנם זה עלול לגרום לכמה גושים של רקמה שאינם מנותקים לחלוטין, וכתוצאה מכך תשואה מעט נמוכה יותר, בריאות הכללית ואיכות של התאים ניתקו יהיה טוב יותר. כמו כן, צריכים להיעשות גם כל צעדים שדורשים מחדש השעיה של גלולה בעדינות.

רמות גבוהות של chimerism יכולות באופן עקבי יושגו עם 60, 80 ו -100 מ"ג / קילוגרם מינונים של busulfan 7 (איורים 1-3). יתר על כן, יש עלייה תלויה-מינון בהצטברות של GFP + תאים במערכת העצבים המרכזית של wild-type 8,9 ועכברים ALS 7. גם אנו ואחרים נצפו עלייה במספר של צבירת GFP + תאים בתוך מערכת העצבים המרכזית של מודלים עכבר של ניוון מוחיים בהשוואה לעכברי wild-type 7,8,10. תוצאות קרינה קטלניות במספר גדול עוד יותר של GFP + BMDCs לעומת 60-100 מ"ג / קילוגרם מינונים של busulfan 7 למרות שמחקר אחד האחרון מצביע על כך שמינון myeloablative של busulfan (125 מ"ג / קילוגרם) תוצאות במספר גבוה יותר של ה- GFP + תאים במוח בהשוואה לגוף כולל הקרנה 9. ראיות עולה כי כניסת BMDC למערכת העצבים המרכזית של עכברים קטלני המוקרנים עשויה לנבוע, לפחות בחלקו, לשיבוש של מחסום דם-המוח (BBB). בעוד busulfan אינו מופיע לשבש BBB מבוסס על העדר חלבונים בסרום (אלבומין) בתוך 11 CNS, busulfan הוא מסוגל לחצות בקלות BBB 17,18 ובכך זה כבר הציע שאוויר busulfan עשוי לפתוח מרחב נישה בתוך מערכת העצבים המרכזית כי הוא מלא בהמשך על ידי BMDCs 8. מעניין לציין, כי הממצאים של et al וילקינסון. מציעים שGFP + התאים מצטברים במערכת העצבים המרכזית של עכברי busulfan מותנים בשל מנגנון גיוס chemokine תוך הצטברות תאי GFP + בעכברים קטלני המוקרנים נראית בשל inflammatorמנגנוני y שנוצרו על ידי ההקרנה עצמו 9. Treosulfan אינו מופיע להתנות את מערכת העצבים המרכזית וכתוצאה מכך תאים כמה GFP + נמצאו בתוך מערכת העצבים המרכזית של עכברים מותנים treosulfan 8. זה עדיין לא נקבע המינונים שונים השפעת busulfan אולי על רקמות אחרות מאשר במערכת העצבים המרכזית, אם כי busulfan ידוע למקד את הכבד, ריאות, הכליות ו6. busulfan שעשוי להתנות את הרקמות אחרות צריך להילקח בחשבון בעת ​​בחירת מינון של busulfan לניסויים חדשים.

בעוד פרוטוקול אוויר busulfan זה הוא פשוט יחסית לביצוע, הדור של עכברים עם BM chimeric הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור תאי hematopoietic. מגוון הרחב של עכברים הטרנסגניים זמינים מסחרי, יחד עם היכולת הגנטית עכברי מהנדס וBMDCs, מגדיל באופן דרמטי את הפוטנציאל של פרוטוקול זה. לדוגמא, מודלים של עכברים שונים קיימים בי ביטוי GFP מוגבל לסוגי תאים מסוימים ושושלות, כגון עכברי CX3CR1-GFP שמבטאים GFP בעיקר בתאי שושלת myelomonocytic 19. עכברים אלו יכולים לשמש כתורמים המאפשרים החקירה של אוכלוסיות תאים ספציפיות hematopoietic in vivo. מספר fluorophores שונה קיים גם בנוסף לGFP, אשר ניתן להשתמש בי כדי להשתיל ולפקח BMDCs משני (או יותר) תורמים שונים, טכניקה שיכולה להיות מועסק למבחני תחרות 20. יתר על כן, במספר המודלים עכבר מהונדסים שונים של מחלה קיים שיכול לשמש כמקבלים לחקור את התפקיד של BMDCs במגוון רחב של הפרעות. לאחר השתלה, ניתן לנתח תאי תורם באמצעות אימונוהיסטוכימיה, או מבודדים על ידי FACS ונחקרו תוך שימוש במגוון של טכניקות ביוכימיים. יתר על כן, יכולות להיות מיושמות טכנולוגיות הדמיה מתקדמות כגון מיקרוסקופ שני פוטונים לחיים באיתור vivo של fluorophores כגון GFP 21. סופו של דבר, זההוא חזה כי BMDCs יכול להיות מהונדס גנטית ומשמש להעברת מולקולות טיפוליות למקד רקמות כגון מערכת העצבים המרכזית במקבלי מיזוג busulfan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330, (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239, (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21, (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2, (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9, (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8, (4), e60661 (2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21, (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8, (3), e58544 (2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14, (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77, (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32, (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10, (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8, (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4, (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30, (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20, (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55, (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics