종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

Developmental Biology
 

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Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

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Abstract

Introduction

암은 시간이 지남에 병리학 적 돌연변이, 삭제 및 염색체 이익의 축적에 의해 표시 진보적 인 질병이다. 이러한 유전 적 이상이 저산소증과 같은 스트레스 반응 세포 골격의 세포주기, 세포 사멸, 에너지 대사 및 조립에 이르기까지 다수의 세포 과정에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 종양은 생물학적 과정의 스펙트럼에 걸쳐 여러 유전 수차의 집단 행동을 반영한다. 전체 게놈 시퀀싱, 진유 전체 시퀀싱, 타겟 시퀀싱, 깊은 시퀀싱 및 게놈 넓은 협회 연구 등을 포함하여 통합 게놈 연구 노력은, 종양 1-4 본질적으로 모든 종류의 새로운 유전 적 변화의 증가를 확인했다. 많은 경우에, 유전 적 병변은 질병의 발병 기전에서의 협력을 제안, 랜덤하지 않은 방식 5-8에서 함께 발생합니다. F를 결과 비정상적으로 발현 유전자의 큰 배열의 발암 역할을 해부이러한 게놈 병변 ROM 새로운 치료 전략을 고안하고 이러한 에이전트에 종양 세포의 반응을 이해할 필요가 있지만, 이것은 높은 처리량 기능적 게놈 분석의 수행에 대해 매우 강력한 동물 모델 시스템을 필요 곤란한 과제를 증명했다 생체.

포유 동물, 특히 쥐가 암 생물학에서 선호하는 모델이지만, 제브라 피쉬는 상당한 관심을 끌기 시작했다. 경골 제브라 피쉬 (다리오 레 리오 (rerio))는 1960 년대 이후 개발 연구를위한 모델 생물로 사용되었으며, 1982 9-11 종양 발병 기전의 연구에 적용 하였다. 유지 보수, 작은 몸 크기, 높은 생산력의 용이성 제브라 피쉬의 이상과 병리학 적 표현형 (10)을 부여 돌연변이를 확인하는 대규모 앞으로 유전 화면을위한 강력한 모델합니다. 제브라 피쉬 배아의 광학 투명성,이 암 모델의 넓은 사용을 지원하는 또 다른 핵심 기능입니다그것은, 실시간 9 설치류 (12)에 상대적으로 어려운 응용 프로그램을 종양 발생을 찾기 위해 실시하는 생체 내 이미징에 있습니다. 제브라 피쉬 참조 게놈 (Zv9)의 최근 비교 게놈 분석은, 71 %는 82 %가 남자 (OMIM) 데이터베이스 (13)에 온라인 멘델의 상속 질병 관련 유전자와 상관 관계가있는 인간의 orthologues을 갖는, 26,206 단백질 코딩 유전자를 밝혀 (14). 따라서, 제브라 피쉬가 신경 모세포종 (8)을 포함하여 인간의 암의 다양한 유형을 모델링하는 데 사용되었습니다, T 세포 급성 림프 구성 백혈병 (T-ALL) 15, 16, 흑색 종 (17, 18), 유잉 육종 (19), 횡문근 육종 (20, 21), 췌장암 22, 간세포 암 (23)과 골수는 24, 25을 악성 종양, 이종 이식에 대한 암 모델 11,26 연구로 선정되었습니다.

안정적인 형질 전환제브라 피쉬의 접근 방식은 일반적으로 기능 획득 정상적인 발달 또는 질병의 발병 기전 (27, 28)에서 유전자의 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 모델 (도 1a)을 개발하기 위해, 하나의 셀은 하나의 야생형으로 배아 조직 - 특이 적 프로모터에 의해 구동 관심 유전자를 포함하는 DNA 작 제물을 주사. 주입 된 배아는 성적 성숙에 도달하면 세 4 개월 주사 후, 그들은 설립자 물고기로 라이센스를 자신의 생식 세포에 건설 DNA의 통합을 보여주는 것들에 대한 선별 야생 형 물고기와 outcrossed된다. 그러한 카피 수와 트랜스 진의 통합 사이트 등 많은 요소, 안정한 유전자 변형 라인에서의 유전자 발현에 영향을 미친다. 그러므로, 트랜스 제닉 종양 모델을 개발하기 위해, 하나의 종양 유전자를 과발현하는 형질 전환 계통 안정 다중 먼저 생성되고 종양을 유도 이어질 수도 수준에서 트랜스 유전자를 발현하는 라인에 대해 스크리닝 할 수있다. 그러나, 후보 O 과발현ncogene가 생식 세포에 독성이며, 직접 트랜스 29 과발현 형질 전환하여 안정된 선을 생성하는 것이 곤란하다. 따라서, 이러한 접근법은 적절한 암 모델을 생성하기 위해 고장 위험이 높은, 시간 소모적 일 수있다.

여기서 우리는 생체 내에서 기능 게놈 연구에 대한 기존의 안정적인 transgenesis를 통해 독특한 장점을 제공 모자이크 과도 transgenesis (그림 1B)에 따라 다른 전략을 설명한다. 이 방법에서는, 하나 이상의 형질 전환 유전자 구조체는 형질 전환 또는 야생형의 하나의 배아 세포 단계로 주입된다. 유전자를 포함하는 주입 된 DNA 구조는 개별 물고기 (30)의 여러 세포 집단 내에서 혼합 된 유전자형의 결과로, 다음 mosaically 무작위로 차 주입 물고기에 통합되어 있습니다. 또한, 여러 DNA의 공사 출 하나의 세포 배아의 구축은 공동의 통합을 위해 임의의 사이트에서 동일한 셀에, TRA 하나를 허용 리드유전자의 발현과 세포를 CE 및 모자이크 동물 (31)의 질병 발병시 다른 유전자의 상호 작용을 탐구한다. 원리의 증거로서, 우리는 일시적으로 야생 형 물고기와 MYCN 과발현 형질 전환 어류의 도파민 베타 수산화 (D의 βh) 프로모터의 제어하에 주변 교감 신경계 (PSNS)에 mCherry 리포터 유전자와 mutationally 활성화 ALK를 (F1174L) 과발현. 수용체 티로신 키나제를 코딩 ALK는 고위험 신경 모세포종 5-7,32,33에서 가장 빈번하게 돌연변이 된 유전자이다. ALK 가장 빈번한 활성화 및 유력한 체세포 돌연변이 중 하나 (F1174L)은, 표현 위에-IS MYCN- 고위험 신경 모세포종 환자를 증폭하고 안정적인 형질 전환 마우스 및 형질 전환 제브라 피쉬 모델 8,34,35 모두에서 신경 모세포종의 종양 발생을 촉진 MYCN 과발현과 synergizes. 모자이크으로MYCN 유전자 변형 물고기 mCherry와 ALK (F1174L)의 과도 과발현, 우리는 모자이크 transgenesis 전략에 신속하고 효율적으로 사용될 수 있음을 시사 ALK (F1174L)MYCN 모두를 과발현 안정적인 형질 전환 어류에서 관찰 된 종양 발병의 가속도를 효과적으로 요약 생체 내 종양 개시에 여러 개의 종양 유전자의 상대적 기여도를 평가합니다.

Protocol

참고 : 모든 제브라 피쉬의 연구와 동물의 유지 보수는 메이요 클리닉 연구소 IACUC 승인 프로토콜 # A41213에 맞게 시행 하였다.

Transgenesis 1. DNA를 구축

  1. DNA 서식 파일로 (BACPAC 자원 센터 (BPRC)에서) CH211-270H11 BAC 클론을 사용하여 5.2 kb의 도파민 베타 수산화 (D βh) 프로모터 영역 (8)을 증폭. 2 분 94 ° C (94 ° C, 15 초, 50 ° C, 10주기 30 초, 68 ° : 긴 DNA 템플릿의 길고 정확한 PCR 증폭을위한 PCR 시스템 적절하고 PCR에 대해 다음주기 프로그램을 사용하여 (94 ° C, 15 초, 53 ° C, 30 초, 68 ° C, 8 분), 68 ° C, 4 분 (정방향 프라이머 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 '30 회 반복 C, 8 분), 역방향 프라이머 5' GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. D βh -pDONRP4-P1R 항목 클리오 만들기NE 8 등 다중 게이트웨이로 상업 재조합 복제 시스템을 사용하는 경우. 정제 dβh PCR 제품 (172 NG / μL) 1 μL (150 NG / μL) pDONRP4-P1R 기증자 벡터의 1 μl를 혼합 (다른 게이트웨이 벡터 박사 카이 빈 치엔, 대학교에서 관대 한 선물은과 함께. 유타) , TE 완충액 (pH 8.0) BP clonase 효소 믹스의 2 μL와의 4 μL는 25 ° C에서 1 시간 동안 배양 한 다음 원샷 TOP10 관할 E.로 변환 대장균 제조 업체의 프로토콜에 따라.
  3. 생성 D βh : EGFP-MYCN 유전자 변형 단계 1.2에서 언급 한 8 사용하여 재조합 복제 시스템을 구축. 각 항목 클론의 1 μL 5.2 킬로바이트 dβh 프로모터 (dβh -pDONR P4-P1R 구조), EGFP가 정지 코돈 (PME-EGFP 구조를) 부족을 포함하여 (150 NG / μL), 인간 MYCN의 cDNA를 혼합 (관대 한 선물 박사 호가 티에서 펜실베니아의 어린이 병원, MYCN - pDONRP2R-P3 구조), 1 μL I-SceI 제한 효소 인식 부위 (박사 C. Grabher, 기술의 카를 스루에 연구소, 카를 스루에, 독일)에서 관대 한 선물, TE 버퍼의 4 μl를 포함하는 수정 대상 벡터의 (150 NG / μL) ( LR Clonase 효소 믹스의 2 μL으로 pH 8.0), 25 ° C에서 1 시간 동안 배양 한 다음 변환 화학적으로 유능한 E.을에 대장균과 같은 하나의 샷 10 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
  4. MITF합니다 : MITF 유전자가 PNP-MITF 벡터 소화에 의해 8을 구성 NotI을 SalI을 제한 효소로 2 시간 동안 실온에서, 그리고 발표 2.65 kb의 서브 클로닝하여 (박사 D. Raible, 대학교에서 관대 한 선물을 워싱턴.) MITF 플 랭킹 프로모터I-SceI 제한 효소 절단 부위를 함유하는 개질 된 벡터의 pBluescript 계을 NotIMluI 부위에 지브라 피쉬 MITF 유전자의 코딩 서열을 함유하는 DNA 단편 (휘 박사로부터 철 기질 선물NG, 보스턴 대학), 제조자의 프로토콜에 따라 T4 DNA 리가 제를 사용.
    참고 : 안정적인 MYCN 발현 라인을 생성의 효율성을 높이기 위해, D는 βh : EGFP-MYCN와 MITF :. MITF DNA 구조는 하나의 세포 단계의 진주층의 배아에 coinjected되는 자개가 신경이 부족 돌연변이 물고기의 유형 지정 크레스트 유래 개발 36시 melanophore. 따라서, 안료 분사 배아 세포의 모양 MITF의 통합을 시사한다 : MITF DNA는 게놈에 생성한다. 이것은 두세 coinjected DNA 작 제물은 물고기 유전체 (31)에 공적분 될 수 있음을 입증되었다. EGFP-MYCN 유전자와 MYCN 안정적인 형질 전환 라인의 식별을 용이 : 따라서, MITF 발현에 의한 색소 침착은 dβh의 통합을위한 마커 역할을 할 수 있습니다.
  5. EGFP-MYCN과 MITF : D의 βh 믹스 MITF DNA를I-SceI 제한 효소 효소 1 μL 버퍼 0.75 μL와 15 μL 반응의 총 부피 : 1 비율로 3에서 구축합니다. 반응에서 DNA의 총량이 750 NG를 초과하지 않도록하십시오.
  6. 4 시간 또는 O / N에 대한 RT에서 I-SceI 제한 효소 소화를 수행하십시오. 둘째 날, I-SceI-하는 DNA는이 마이크로 인젝션 준비 또는 미래에 주입 -20 ° C에서 저장 될 수 소화. 효소의 효율을 유지하기 위해 작은 분취 량을 -80 ℃에서 I-SceI 제한 효소를 저장.
  7. 박사 C. Grabher에서 (관대 한 선물을 pENTRY1A 벡터의 EcoRINotI으로 ​​사이트에 한 pcDNA3TM 벡터에서 인간 ALKF1174L 및 야생 형 ALK 유전자 (다나 - 파버 암 연구소에서 박사 조지 관대 한 선물) 7 서브 클론, 기술의 카를 스루에 연구소, 카를 스루에, 독일)는 제조업체의 프로토콜에 따라 T4의 DNA 리가 아제를 사용하여.
  8. D의 βh 생성 : ALKF1174L을 </ EM> 또는 dβh 프로토콜 : 1.2에서 언급 한 바와 같이 시스템을 사용하여 재조합 ALKWT 유전자 작 제물. 간단히 세 가지 항목 클론을 결합, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (또는 ALKWT -pENTRY1A)과 P3E - 폴리 -A, I-SceI 제한 효소 인식 부위 (박사 C. Grabher, 카를 스루에에서 관대 한 선물을 포함하는 수정 대상 벡터에 기술 연구소, 카를 스루에, 독일), 제조 업체의 프로토콜에 따라, LR Clonase 효소 믹스를 사용하여.
  9. 혼합 D βh : ALKF1174L (또는 dβh : ALKWT)과 dβh : mCherry DNA가 3에서 구축 : 1의 비율 및 프로토콜 1.5-1.6에 설명 된대로 I-SceI 제한 효소 효소로 선형화.

2. 미세 주입

  1. 모든 주사 37 1.0 mm 직경 유리 마이크로 피펫을 사용합니다. 주입 전에 면도날 유리 마이크로 피펫의 팁을 끊다. 분사에 의해 주입 부피를 보정미네랄 오일 방울로 H 2 O를 보내고. 생성 된 방울의 직경을 측정하고 주입 부피는 하나의 셀 단 배아 세포의 총 부피의 10 % 미만임을 보장하는 마이크로 인젝터 (압력 또는 압력 펄스의 지속 기간)을 조정한다.
  2. DNA를 함유하는 주사 용액 5 μL의 신선한 I-SceI 제한 효소 (5 유닛 / μL)을 추가로 0.5 μl를 추가하면 주입 transgenesis (38)의 효율을 증가시키기 직전 구성한다. 하나의 세포 단계의 배아의 세포질에 선형화 된 DNA 구조의 50 ~ 80 페이지를 주입한다. 주사의 성공을 보장하기 위해, 시각화를위한 0.25 % 페놀 레드 샘플을 섞는다. 세포 주입 후 빨간색을 설정하면, 미세 주입이 성공. 형질 전환 어류를 생성하는 높은 성공률을 보장하기 위해, 우리는 일반적으로 500 개의 배아를 주입.
  3. EGFP-MYC : 안정적으로 MYCN를 발현하는 형질 전환 어류를 생성하려면, 선형화 된 D의 βh을 coinjectN과 MITF : MITF DNA 구조 (3에서 : 1 비율) 한 세포 단계에서 색소 돌연변이 진주층의 제브라 피쉬의 배아에. MITF의 발현은 물고기 게놈의 유전자 구조의 통합을위한 기자 역할을합니다.
  4. dβh로 : ALK F1174L (ALKWT 또는 dβh :) : 야생 형 또는 MYCN 유전자 변형 배아에서 ALK의 모자이크 과발현를 들어, 선형 개발 βh 공동 주입 한 세포로 : mCherry DNA (1 비율 3에서) 구축 야생 형 AB 물고기 형질 전환 어류 : F1 이형의 Tg (EGFP-MYCN dβh)의 번식에 의한 배아. 따라서, 자손의 절반은 MCYN을위한 형질 전환하고 반은 야생 형이다.

안정 또는 모자이크 형질 전환 어류 3. 화면

  1. tricaine (0.02 %)로 주로 주입 진주층 배아 마취, MYCN 안정한 발현 라인 식별의 효율성을 증가시키기t 일 색소 침착에 대한 postfertilization 및 화면의 3-5. 생식 세포에서 EGFP-MYCN 유전자 : D βh을 수행 설립자 물고기에 대한 추가 검사를 위해 성적 성숙에 신선한 계란 물에 새로운 배양 접시에 색소 침착 배아를 전송하고 올립니다.
  2. EGFP-MYCN, 더 유전자형 1 ~ 2 일 후 수정에서 EGFP 양성 배아 야생 형 AB 물고기와 화면 교배 색소 F0 성인 물고기의 생식 전송과 설립자를 식별합니다. PCR 튜브에 하나의 EGFP 양성 F1 배아를 놓고 모든 액체를 제거합니다. 4 배 용해 버퍼의 12.5 μL, 35 μL의 H 2 O 2.5 ㎕의 단백질 분해 효소 K 단일 배아 (10 ㎎ / ㎖)를 포함 gDNA를 추출 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 4 배의 용해 완충액 50 mL로 K. 단백질 분해 효소를 불 활성화 98ºC에서 배양 10 분 뒤에 55 ° C에서 2 ~ 3 시간 동안 반응을 품어 1M 트리스의 500 μl를 추가 (PH 8.4), 2.5 ml의 1M의 의 KCl의 tH 2 O의 O를 47 ml의 참고 : F0 MYCN 안정적인 형질 전환 어류가 야생 형 AB 물고기와 자란 후, 자손의 모든 색소입니다. 따라서, 색소 침착 MYCN- 긍정적 인 물고기의 식별 마커로 사용될 수 없습니다. MYCN 형질 전환 어류에있는 동안, EGFP-MYCN 융합 단백질 등 및 연수에 같은 우수한 경부 신경절 및 교감 체인 순차 분절 신경절 및 비 PSNS의 도파민 성 뉴런의 교감 신경을 포함한 PSNS 표현된다 뇌 신경 8. 따라서, EGFP의 표현은 MYCN 안정적인 형질 전환 배아의 식별을위한 마커 역할을 할 수 있습니다.
  3. , 템플릿으로 색소 F1 배아에서 추출한 gDNA를 2 μl를 사용하는 것은 MYCN을 프라이머 - 테스트 F1 : 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3 : 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 '다음 프로그램 위트시간 GC-RICH PCR 시스템 : 3 분 95 ° C의 1주기, 30 초 동안 95 ° C의 25주기, 30 초 동안 58 ° C, 3 분 동안 72 ° C. 우리는 일반적으로 착색 된 배아의 통합 MYCN 전이 유전자의 존재, MITF와 MYCN를 과발현 6 개 이상의 설립자 물고기가이 방법에 의해 확인 된 사항을 확인하기 위해 하나의 결합에서 14 ~ 16 착색 된 배아를 유전자형.
  4. EGFP 양성 F1 배아의 나머지 부분을 올립니다. 핀은 상기 클립 물고기로 MYCN 트랜스의 통합을 확인하기 프로토콜을 사용하여 상기 세 2-3 개월 째 그들을 유전자형. F1 MYCN에게 야생 형 AB 물고기 안정적인 유전자 변형 물고기 새끼를 낳. ALK F1174L (또는 dβh : ALKWT) dβh과 : 선형화 개발 βh을 공동-주입 프로토콜 2.4에 설명 된대로 mCherry DNA는 하나의 세포 배아로 구성한다.
  5. 정렬 실험에서 배아를 발현 MYCN는 입체 불소를 사용하여 프로토콜 2.4에 설명escence 현미경 일 PSNS에서 EGFP-MYCN의 발현에 대한 postfertilization 1-3에서 주로 주입 된 배아를 화면. 그런 다음, 일 postfertilization의 2-5시, tricaine (0.02 %)와 배아를 마취 및 입체 형광 현미경을 사용하여 PSNS에 mCherry의 발현에 따라 다시 그 MYCN- 양 또는 음의 배아를 정렬 할 수 있습니다. mCherry의 발현은 모자이크 차 주입 동물의 조직에서 ALK의 동시 발현 마커 역할을합니다.
    참고 : ALK F1174Ldβh : mCherry, dβh : ALKWTdβh : mCherry, 또는 dβh 야생 형 물고기와 MYCN 안정적인 형질 전환 어류의 번식으로 인한 ~ 600 자손 D의 βh 포함, 선형화 된 DNA 구조와 그룹 당 주입 하였다 : mCherry 혼자, 각각. mCherry의 모자이크 식을 주로 주입 물고기 70 ~ 90 %를 관찰 할 수있다. 한 반은 일 대주입 된 물고기의 세 번째는 종양 시계의 애벌레 단계를 통해 살아 남았다.
  6. mCherry + MYCN + 및 mCherry + MYCN의 모든 올립니다 - 제브라 피쉬의 책 (39)의 표준 프로토콜에 따라 배아를 5 주 postfertilization에서 시작 종양 발병을 모니터링 할 수 있습니다.

모자이크 형질 전환 어류 4. 종양 시계

  1. 종양 발병의 증거 5 주 postfertilization에서 시작하여 매 2 주마다 mCherry- 긍정적 주로 주입 물고기를 모니터링합니다.
  2. mCherry의 존재 tricaine (0.02 %)와 화면 물고기 마취 -와 EGFP가 디지털 광경 DS-U1 카메라 장착 니콘 SMZ-1500 형광 입체 현미경 PSNS 종양에서 발현.
  3. 종양이 ALK 변이 유전자를 발현 여부를 확인하려면 mCherry-와 ALK 유전자 분석 PCR에 대한 EGFP 양성 대중을 격리 할 것.
  4. PCR을 사용하여, 게놈 DNA를 증폭ALK P7 : 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT의 GC-3 '와 ALK P18 : 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3'과 다음 PCR 반응 : 1주기 다음 프라이머와 개발 종양에서 추출 5 분 94 ° C의 30주기 (30 초 30 초 94 ° C, 55 ° C, 60 초 동안 72 ° C). 이어서, 시퀀스의 ALK P7 프라이머로 PCR의 생성물은 더 mCherry 양성 종양에서 돌연변이 또는 야생형 ALK의 존재를 확인한다.

Representative Results

mutationally 활성화 ALK의 F1174L 또는 야생형 ALK의 과발현은 신경 모세포종 유도에서 MYCN과 협력 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 MYCN를 과발현하는 형질 전환 어류의 PSNS의 개발 βh 프로모터의 제어하에 활성화 인간의 ALK 또는 야생 형 인간 ALK를 과발현. ALKF1174L 또는 dβh - - 다음과 같은 구조, dβh 중 하나 ALKWT는 dβh와 coinjected 한 - mCherry를 하나의 셀 야생 형 또는 MYCN 유전자 변형 배아 (그림 2A) 8로. mCherry의 발현은 모자이크 차 주입 동물의 조직에서 ALK의 동시 발현 마커 역임했다. 예상 유전자형의 모든 주입 된 물고기로 표현되었다 : 활성화 ALKF1174LmCherry의 모자이크 동시 발현 (1) MYCN 발현 물고기 ALK 및 mCherry의 모자이크 동시 발현, 지정된 MYCN (2) MYCN 발현 물고기; (3) mCherry의 모자이크 식으로 물고기를 발현 MYCN, MYCN 지정, 모자이크 mCherry; 모자이크 ALKmut, 활성화 ALKF1174LmCherry, 지정된 WT의 모자이크 동시 발현 (4) 야생 형 물고기; 및 WT 지정된 야생 형 ALKmCherry의 모자이크 동시 발현과 (5) 야생 형 물고기, 모자이크 ALKWT. 종양 시계는 492 주입 동물의 총 5 주 postfertilization (WPF)에서 2 주마다 실시 하였다.

여덟 GFP + / mCherry + 종양이 MYCN 발현 물고기 9 WPF에 의해, interrenal 선에서 인간의 부신 상당을 발생 coinjected와 D βh - ALKF1174 L과 dβh - mCherry (그림 2B, 3). 이 종양은 histolo했다gically, 인간의 신경 모세포종에 대한 면역 조직 화학 염색을하고, ultrastructurally 비교 (데이터 참조 (8)에서 찾을 수있다). dβh로 (=도 2C, 3, P 0.002) mCherry 또는 주입 - - ALKWTdβh - 반면, 어떤 종양이 MYCN 발현 dβh와 coinjected 물고기 시대의 구주가 관찰되지 않았다 mCherry 혼자 (그림 2 차원3, P = 0.007). 종양은 모두 MYCN에서 발생, 모자이크 ALKWT 및 MYCN, 12 세 주 후 유도의 같은 비율 모자이크 mCherry 물고기입니다. 또한, 신경 아세포종 모니터링의 15 주 동안 야생 형 ALKmCherry 또는 ALKF1174LmCherry 유전자 중 하나에 coinjected 어떤 야생 형 물고기에서 검출되지 않았다. 함께 찍은, 이러한 결과는 mutationally 활성화 ALK의 모자이크 과발현이 MYCN 유도 된 종양 O를 가속 것을 보여NSET에 관계없이 개인의 모자이크 동물의 통합 사이트 및 dβh 프로모터에 의해 구동 수준에서 야생 형 ALK의 과발현이 모델 시스템에서 신경 모세포종을 유도 MYCN 과발현와 협력 나타나지 않습니다.

그림 1
그림 1 : 기존의 안정적이고 종양에 후보 종양 유전자의 협동 기여금의 연구에서 모자이크 과도 제브라 피쉬의 형질 전환 전략의 도식 개요 (A) 안정 형질 전환 전략.. 선형화 된 트랜스 제닉 DNA 구조체 함유 후보 종양 유전자는 트랜스 무작위 게놈 유전자좌에서 생선 게놈 내로 통합 될 수있는 하나의 세포 단계 야생형 또는 돌연변이 진주층 제브라 피쉬 배아 내로 주입된다. 생식 세포로 형질 전환 유전자의 통합 generatio 필요안정적인 형질 전환 라인의 명. 주로 주입 된 배아는 유전자의 배아 전송 창업자와 생선을 선별하는 야생 형 또는 진주층 돌연변이 물고기와 outcrossed됩니다 성적 성숙 (물고기의 F0 세대), 도달하는 3-4개월 걸릴. 설립자 물고기의 결과 자손, F1 세대라고 자신의 게놈 유전자의 이형 접합 대립 유전자를 운반. 종양에서 이러한 유전자와 같은 2 개의 후보 유전자 (oncogene), ""유전자 "B"의 공동 효과를 측정하기 위해서 복합 트랜스 진을 운반하는 자손의 1/4만이,이 유전자를 과발현하는 두 안정한 형질 전환 계통의 F1 자손 사육. 때문에 안정한 형질 전환 계통 발생의 상대적으로 낮은 효율이 방법은 높은 처리량을위한 기능성 게놈 분석에 적합하지 않다. (B) 모자이크 일시적인 형질 전략. 안정적인 transgenesis 유사하게, 선형 형질 전환 DNA 공동 후보 유전자를 함유 한 nstructs 세포 단계 야생형 배아 내로 주입 될 수있다. 형질 전환 유전자는 생식 세포의 게놈에 통합 될 필요가 없기 때문에 많은 시간과 노력이 설립자 물고기를 식별하는 과정에서 저장 될 수있다. 후보 종양 유전자 중 하나를 과발현하는 형질 전환 어류 라인 (우리의 경우, MYCN 유전자 변형 물고기가 개발되었다)을 사용할 수있는 경우 또는, 다른 후보 유전자를 포함하는 선형 형질 전환 DNA 구조는 그들의 협력을 공부 한 세포 단계의 유전자 변형 배아에 주입 될 수있다 종양. coinjected과 주로 주입 물고기 (31)에 동시 발현 될 수있는 세 가지 유전자 구조까지; 따라서, 종양의 후보 종양 유전자의 상호 작용은 주로 주입 물고기에서 평가 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2 :. 활성화 ALK의 모자이크 식 MYCN의 발병은 엘스 비어 (참조 3466510609819)에서 권한이있는 신경 모세포종 (8) 수정 된 그림 - 유도 가속화. 모자이크 transgenesis를 구성하는 (A) 접근. (BF) 주로 주입 배아 2 일 된 애벌레. 병합 된 형광 시야 이미지 (상단 패널)에서 두개골 신경 (CG, 화살촉)를 포함하여 도파민 신경 세포의 안정적인 EGFP 발현의 측면보기. 두개골 신경 (CG, 화살촉), 연수 나 (MO, 화살표)에서 모자이크 mCherry 식 (하단 패널)의 측면 전망. 일부 mCherry 이소성 발현은 비 PSNS 비 도파민 뉴런에서 관찰된다. (G - K) 7 주령 주로 주입 물고기.(B, G) MYCN 발현 물고기 coinjected와 D βh - ALKF1174Ldβh - mCherry가 구축 (MYCN, 모자이크 ALKmut). EGFP - 그리고 mCherry 양성 종양은 칠주 (G 흰색 빈 화살표)에서 일어났다. (C, H) ​​dβh와 coinjected 물고기 발현 MYCN - ALKWTdβh을 - mCherry가 (MYCN, 모자이크 ALKWT)를 구성한다. (D, I) dβh 주입 물고기를 발현 MYCN - mCherry 혼자 (MYCN, 모자이크 mCherry)를 구성. (E, J) 야생 - 타입 (WT) dβh와 coinjected 물고기 - ALKF1174Ldβh을 - mCherry은 (WT를, 모자이크 ALKmut) 구성한다. ALKWTdβh - - dβh와 coinjected (F, K) 야생 - 타입 (WT) 물고기 mCher스피 구조 (WT; 모자이크 ALKWT). mCherry 또는 dβh - - 신경 아세포종은 dβh-ALKWTdβh와 coinjected 물고기 발현 MYCN에서 관찰되지 않았다 혼자 7 WPF에서 mCherry을하거나, MYCN 전이 유전자를 상속하지 않았고 어느 ALKWT 유전자 또는 주입 된 형제의의 ALKF1174L 유전자. 스케일 바, 100 B μm의 - F와 G에 1mm - K. 디지털 광경 DS-U1 카메라 라이카 DFC 345FX 디지털 카메라를 구비 한 라이카 MZ10F 입체 형광 현미경이 장착 니콘 SMZ-1500 입체 형광 현미경 이미지를 처리​​ 및 어도비 포토샵 컴파일 된 얻은 형광 이미지에 적용을 캡처하는 데 사용 된 일러스트 레이터 CS3는 (어도비) 소프트웨어. 여기를 클릭하십시오 더 큰 버전을 볼 수 있습니다이 그림의.

그림 3
그림 3 : DNA를 구축과 모자이크 Coinjected로 MYCN 유전자 변형 물고기에 신경 모세포종의 발병 또는 야생 - 타입 (WT) 물고기. . 엘스 비어 (참조 3466510609819)에서 허가 재판 D βh - ALKF1174 L과 dβh - mCherry (모자이크 ALKmut) dβh - ALKWTdβh - mCherry (모자이크 ALKWT); 또는 dβh - mCherry (모자이크 mCherry) 혼자 8. dβh와 coinjected MYCN 줄에 그 - ALKWT (모자이크 ALKmut MYCN) mCherr Y - ALKF1174 L과 dβh - dβh와 coinjected MYCN 발현 물고기 9 WPF에 의해 종양 발병의 차이 dβh - mCherry (MYCN, 모자이크 ALKWT) 또는 dβh - mCherry 혼자 (MYCN, 모자이크 mCherry)는 두 꼬리 피셔의 정확한 시험으로, 각각 P = 0.002, P = 0.007,에서 중요하다.

Discussion

이 대표 연구에서는이 유전자가 현저히 화합물 안정적인 형질 전환 어류 coexpressing에서 우리의 이전 연구 결과와 일치하는 신경 모세포종의 발병을 가속화하기 위해 협력 것을 보여주기 위해 유전자 변형 물고기를 발현 MYCN의 mCherry 리포터 유전자로 과도 공사 출 활성화 ALK의 동시 발현을 사용 모두 ALK와 MYCN 8 활성화. 이 형질 전환 방법은 모자이크 종래 방법에 비해 여러 고유 이점을 갖는다. 가장 중요한, 이러한 통상적 ALK 안정 발현의 사육 및 식별에 관련된 과도한 시간과 노동력을 제거 안정한 형질 전환 동물에 대한 요구없이 주로 주입 동물에서 후보 종양 유전자 (F0 세대) coexpressing의 효과의 신속한 검사를 가능하게 형질 전환 어류. 또한 이상과 MYCN없이 야생형 ALK의 과발현의 효과를 조사종양 개시에 표현. 우리의 결과는 물고기 모델 야생형 ALK의 일시적인 관계없이 과발현 MYCN 종양 유전자의 상태, 신경 아세포종 종양 형성을 개시하기에 충분하지 않다 것을 보여준다. 그것은 야생 형 물고기에서 모두 활성화 ALK와 MYCN의 과도 동시 발현은 주로 주입 물고기 종양의 이전 발병을 유도 할 수 있는지 미래에 테스트 흥미로운 일이 될 것이다. 본 연구는보다 충실히 두 유전자의 체세포 변경 고위험 신경 모세포종 환자 (5)의 일부에 공동이 발생하는 질환 실제 콘텍스트를 모방한다.

모자이크 과도 형질 전환 전략의 중요한 디자인 요소는 주로 주입 제브라 피쉬 배아 중과의 긍정적 인 물고기를 모니터링하는 유전자의 성공적인 통합과 동물을위한 선별 검사에서 에이즈 관심의 후보 유전자 (oncogene)와 공동 사출에 대한 리포터 유전자를 포함입니다 tumoR 발병과 진행. transgenesis의 효율을 높이기 위해 상당히 meganuclease (38)와 주입 배아의 76 %로 meganuclease 않고 주로 주입 배아의 26 %에서 도입 유전자의 균일 프로모터 의존성 발현을 증가 I-SceI 제한 효소 meganuclease - 매개 형질 전환 방법을 적용한 . I-SceI 제한 효소 meganuclease - 매개 형질 전환 방법의 사용은 현저 transgenesis의 효율을 개선 하였지만, 적극적으로 도입 유전자 주입 된 배아의 비율은 여전히 100 % 이하로 잘 유지된다. 따라서 coinjected 리포터 유전자의 발현은 상기 종양의 발병 전에 물고기 모니터링 후보 유전자의 성공적인 통합 주입 배아를 식별 마커로서 기능 할 수있다. 반면, TOL2의 트랜스포존 매개 형질 전환 방법은 모델 척추 동물에서 인기있는 유전 도구가되었습니다 성공적으로 transgenesis,에서 삽입 돌연변이 유발, 유전자 트랩에 사용 된핑 (ping) 및 증강은 40, 41 트래핑. 수정 된 배아에 트랜스의 mRNA와 TOL2 트랜스포존의 공사 출 염색체 통합의 효율을 증가시키고, 트랜스 (42)의 성공적인 생식선 전달을 증강 초기 통합 이벤트를 용이하게 할 수있다. 그러나, DNA의 전위의 "잘라 내기 및 붙여 넣기"메커니즘으로 인해, 도입 유전자의 단일 복사본이 삽입 궤적 (42) 당 염색체에 통합되어 있습니다. 따라서, coinjected 후보 유전자는 대부분 다른 세포에서 후보 유전자의 발현과 주로 주입 물고기 coinjected 유전자의 더 복잡한 일시적 모자이크 표현 패턴으로 이어질 수있는 다른 사이트에서 물고기 게놈에 개별적으로 통합된다.

전반적으로, 현재의 연구 협력, 아마도 시너지 효과, 높은 번째에 여러 개의 종양 유전자 사이의 관계를 평가하기 위해 신속한 수단으로 모자이크 transgenesis의 미래 사용을 지원합니다roughput 방식, 설치류를 포함한 다른 동물 모델, 만나 어려운 도전. 지금까지,이 전략은 성공적 횡문근 육종 (31)의 활성화를 개시 RAS - 유도 억제 MYC 유도 된 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 (31)의 방사선 민감성을 수정 유전자를 동정하기 위해 형질 전환 지브라 피쉬에 적용되어왔다. 또한, Langenau 등은, (15)은 열 충격을 유도 형질 전환 방법으로 공사 출 방식을 결합하여, 주로 주입 물고기에 열 충격에 의해 유전자 발현을 유도 할 수있다 종양에서 종양 유전자의 협력 역할을 탐험에 매우 유용 할 수있는 것을 증명하고있다 그 유전자의 발현을 허용하는 것처럼 차 종양이 수립 된 후 진행 온한다. 아주 최근에, Langenau와 동료들은 설계 아연 손가락으로 rag2 유전자를 대상으로 첫 번째 면역 제브라 피쉬 모델 (43) 뉴 클레아 개발했다. 손실rag2의 기능, 치료, 후보 유전자를 과발현과 자기 갱신 용량에 모자이크 유전자 발현의 효과를 평가하는 이종 암세포 이식에 유용 할 수있는 장점을 여러 조직 및 암 세포 (43)의 견고하고 장기간 생착 허용 이러한 반응과 암세포의 성장 속도.

마지막으로, 모자이크 transgenesis 안정적인 transgenesis 통해 다른 독특한 장점을 제공합니다. 안정적인 형질 전환 동물에서 형질 전환 유전자는 신체의 모든 단일 세포의 게놈에 통합 대대로 (27)에 유전되어 있습니다. 그러나 대부분의 암은 생식 세포 (44)에 체세포 대신 상속 된 돌연변이의 유전 적 변화에서 발생한다. 따라서, 기본에 유전자 통합의 모자이크 패턴은 물고기와 더 나은 일을 요점을 되풀이 할 개별 모자이크 형질 전환 어류의 세포 집단 내에서 혼합 유전자형을 주입즉 체세포 결함 환자에서 발견되고 안정된 형질 전환 라인에 하나의 삽입 부위에 의한 인공 위치 효과를 피할 것이다. 한편, 주로 주입 어류 유전자를 과발현하는 세포의 염색체 작은 인구 역학적 연구는 더욱 어렵게 만든다.

요약하면, 모자이크 형질 전환 전략은 종양 개시 및 확산에 암 유전자의 협력 기여의 신속하고 효율적인 평가를위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 미리 급히 발암 기전과 경로의 추가 생산 조사하고 효과적인 표적 치료의 개발에 필요한 유전자 (oncogene) 후보 간의 상호 작용에 정액 정보를 생성 할 것으로 예상된다. 이상 세 coinjected DNA 컨스 공적분의 효율을 올릴 수있는 다양한 유형의 동시 발현 multigene 조합 간의 복잡한 관계의 시험을위한 기회를 열 것이라고탄소 배출권. 미래에 대한 도전이되었습니다, 과발현 만 단백질 코딩을 변경 돌연변이 또는 유전자의 사용을 양성 과정에 중요한 역할을하기보다는 제한 할 수있는 게놈 또는 후생 유전 학적 변화를 수용 할 수있는 모자이크 형질 전환 전략을 수정하는 것 또는 증폭. 최근에는 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENS) (45) 및 클러스터 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR) / CRISPR - 관련 (CAS) 시스템 (46), 개선 된 게놈 편집 기술은,보다 신속하게하는 데 효율적 내인성 수정 널리되었다 세포 및 유기체 (46)의 다양한 종류의 유전자. 이러한 기술은 우리 지브라 피쉬 모델 시스템에서, 게놈 서열 및 유전자 발현의 효율적인 변경을 타겟팅 수행하고 더 종양 발병 게놈 또는 후생 유전 학적 변화의 역할을 기본 메커니즘 (들)을 이해할 수 있도록한다. 이 차례로 번째 박차를 가할 가능성이있다암의 범위에 대한 새로운 분자 치료제의 전자 개발.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix
Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

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