Mosaic Zebrafish Transgenesi per analisi genomica funzionale di geni candidati cooperative in Tumor Patogenesi

Developmental Biology
 

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Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

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Abstract

Introduction

Tumori sono malattie progressive contrassegnati da un accumulo di mutazioni patologiche, delezioni cromosomiche e guadagni nel corso del tempo. Queste anomalie genetiche possono influenzare molteplici processi cellulari che vanno dal ciclo cellulare, morte cellulare, metabolismo energetico e l'assemblaggio del citoscheletro sottolineare risposte come ipossia. Quindi, tumorigenesi riflette le azioni collettive di più aberrazioni genetiche attraverso una gamma di processi biologici. I recenti sforzi integrative genomiche di ricerca, tra cui intero sequenziamento del genoma, exome sequencing, sequenziamento mirato, sequenziamento profondo e gli studi di associazione sull'intero genoma, hanno identificato un numero crescente di nuove alterazioni genetiche in essenzialmente tutti i tipi di tumori 1-4. In molti casi, le lesioni genetiche presentano insieme in maniera non casuale 5-8, suggerendo loro cooperazione nella patogenesi della malattia. Analisi dei ruoli oncogeniche della vasta gamma di geni espressi aberrante derivanti fROM queste lesioni genomiche È necessario elaborare nuove strategie terapeutiche e di comprendere le risposte delle cellule tumorali a questi agenti, ma questo ha dimostrato di essere un compito arduo, che richiede molto robusti sistemi modello animale per lo svolgimento di high-throughput analisi genomica funzionale vivo.

Anche se i mammiferi, in particolare roditori, sono modelli favorite in biologia del cancro, il pesce zebra ha iniziato ad attirare una notevole attenzione. Il pesce zebra teleosteo (Dario rerio) è stata utilizzata come organismo modello per lo studio dello sviluppo dal 1960 ed è stata applicata la prima allo studio della patogenesi del tumore nel 1982 9-11. Facilità di manutenzione, di piccola dimensione del corpo, e l'alta fecondità rendono il zebrafish un modello robusto per schermi genetici a termine su larga scala per identificare le mutazioni che conferiscono fenotipi anormali e patologiche 10. La trasparenza ottica di embrioni di zebrafish è un altro elemento chiave a sostegno più ampio uso di questo modello di cancro, comepermette imaging in vivo ad essere condotti per individuare lo sviluppo del tumore in tempo reale 9, un'applicazione che è relativamente difficile nei roditori 12. Genomica comparativa recente analisi del genoma di riferimento zebrafish (Zv9) ha rivelato 26.206 geni codificanti proteine, il 71% ha ortologhi umani, di cui l'82% sono correlati con i geni associati alla malattia della linea mendeliana Inheritance in Man (OMIM) del database 13, 14. Di conseguenza, il pesce zebra è stato utilizzato per modellare diversi tipi di tumori umani, tra cui 8 neuroblastoma, cellule T leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) 15,16, il melanoma 17,18, sarcoma di Ewing 19, rabdomiosarcoma 20,21, carcinoma pancreatico 22, 23 e carcinoma epatocellulare mieloide neoplasie 24,25, ed è stato selezionato come un modello di cancro per lo xenotrapianto studi 11,26.

A transgenico stabileapproccio in zebrafish è comunemente usato per studiare l'effetto di guadagno-di-funzione dei geni nello sviluppo normale o malattia patogenesi 27,28. Per sviluppare un tale modello (Figura 1A), si inietta un costrutto di DNA contenente il gene di interesse azionato da un promotore tessuto-specifico in una cellule wild-type embrioni. Tre o quattro mesi dopo l'iniezione, quando gli embrioni iniettati raggiungono la maturità sessuale, sono outcrossed con wild-type di pesce per lo screening per i più mostrano integrazione del DNA costruire nella loro linea germinale, che concede in licenza il pesce fondatore. Molti fattori, come il numero di copie e sito di integrazione del transgene, influenzano l'espressione del transgene in linee transgeniche stabili. Così, per sviluppare un modello di tumore transgenico, più linee transgeniche stabili sovraesprimono un singolo oncogene devono essere generati prima e screening per la linea esprimere il transgene ad un livello che potrebbe condurre a tumori indotti. Tuttavia, se la sovraespressione di un candidato oncogene è tossico per le cellule germinali, è difficile generare una linea transgenica stabile sovraespressione direttamente il transgene 29. Pertanto, questo approccio può richiedere molto tempo, con un elevato rischio di fallimento per generare un modello di cancro adatto.

Qui illustriamo una strategia alternativa basata su mosaico transgenesi transitoria (Figura 1B), che fornisce vantaggi unici rispetto transgenesi tradizionale stabile per lo studio di genomica funzionale in vivo. In questo approccio, una o più costrutti transgenici sono iniettati nello stadio unicellulare di transgenici o wild-type embrioni. I costrutti di DNA contenenti iniettate transgeni sono poi mosaically e casualmente integrati nel pesce iniettato primario, con conseguente genotipi misti in popolazioni di cellule più in singoli pesci 30. Inoltre, co-iniezione di DNA multiple costruisce in embrioni di una cellule porta alla co-integrazione nella stessa cella in siti casuali, permettendo di TRACe le cellule con l'espressione dei transgeni ed esplorare le interazioni dei diversi geni durante patogenesi della malattia negli animali mosaico 31. Come prova di principio, siamo transitoriamente sovraespresso ALK mutationally attivato (F1174L) con mCherry gene reporter nel sistema nervoso simpatico periferico (PSNS) sotto il controllo del idrossilasi beta dopamina (d βh) promotore wild-type di pesce e pesce transgenico sovraespressione MYCN. ALK, che codifica un recettore tirosina chinasi, è il gene più frequentemente mutato in neuroblastoma ad alto rischio 5-7,32,33. ALK (F1174L), come una delle mutazioni somatiche attivazione più frequenti e potenti, è sovra-rappresentata in MYCN- amplificato pazienti neuroblastoma ad alto rischio e con synergizes MYCN sovraespressione di accelerare neuroblastoma tumorigenesi sia nei topi transgenici stabili e transgenici modelli zebrafish 8,34,35. By mosaicosovraespressione transiente di ALK (F1174L) con mCherry nel pesce transgenico MYCN, abbiamo ricapitolato l'accelerazione di insorgenza del tumore osservata nei pesci transgenici che sovraesprimono stabile sia ALK (F1174L) e MYCN, suggerendo che la strategia transgenesi mosaico può essere utilizzato per rapidamente ed efficacemente valutare i contributi relativi di più oncogeni nel tumore iniziazione in vivo.

Protocol

NOTA: Tutti gli studi di zebrafish e manutenzione degli animali sono stati fatti in accordo con il protocollo Mayo Clinic Institute IACUC approvato # A41213.

1. DNA costrutti per Transgenesi

  1. Amplifica una regione del promotore 5.2-kb beta dopamina idrossilasi (d βh) 8 utilizzando il clone CH211-270H11 BAC (dal BacPac Centro risorse (BPRC)) come modello di DNA. Utilizzare un sistema adeguato per PCR lungo e accurato l'amplificazione PCR di modelli di DNA lunghe e seguenti programmi ciclo di PCR: 94 ° C per 2 min, 10 cicli di (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), seguita da 30 cicli di (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (forward primer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' e primer reverse 5'GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. Creare il d βh -pDONRP4-P1R entry clone 8 utilizzando commercial Sistema clonazione ricombinante come gateway di multisito. Mescolare 1 ml di dβh purificato prodotto della PCR (172 ng / ml), 1 ml (150 ng / ml) pDONRP4-P1R donatore vettore (insieme ad altri vettori di gateway sono doni generosi del dottor Chi-Bin Chien, Univ. Di Utah) , 4 microlitri di tampone TE (pH 8.0) con 2 ml di BP mix clonase enzima, incubare per 1 ora a 25 ° C e poi a trasformare One Shot TOP10 competente E. coli secondo il protocollo del produttore.
  3. Generare il d βh: transgenica EGFP-MYCN costruire 8 utilizzando il sistema di clonazione ricombinante di cui al punto 1.2. Mescolare 1 ml di ogni clone di entrata (150 ng / mL) tra cui un-kb 5.2 promoter dβh (dβh -pDONR P4-P1R costrutto), EGFP manca un codone di stop (PME-EGFP costrutto), e umano MYCN cDNA (un dono generoso Dr. Hogarty all'ospedale dei Bambini di Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 costrutto), 1 ml (150 ng / ml) del vettore di destinazione modificato contenente siti di riconoscimento I-SCEI (un dono generoso del Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germania), 4 pl di tampone TE ( pH 8.0) con 2 ml di LR Clonase miscela enzimatica, incubare per 1 ora a 25 ° C e poi a trasformare chimicamente competente E. coli quali One top sparato 10 e seguire il protocollo del produttore.
  4. Fai MITF: transgenica MITF costruire 8 digerendo il vettore PNP-MITF con NotI e Sali enzimi di restrizione per 2 ore a RT, e la subcloning rilasciato 2.65-kb (un dono generoso da Dr. D. Raible, Univ of Washington.) frammento di DNA che contiene il promotore MITF e la sequenza codificante del gene MITF zebrafish nei siti NotI e MluI di un vettore pBluescript modificato contenente accompagnamento siti di riconoscimento I-SCEI (un dono generoso da Dr. Hui Feng, Boston University), utilizzando DNA ligasi T4 secondo il protocollo del produttore.
    NOTA: per aumentare l'efficienza di generare linee MYCN esprimente stabili, d βh: EGFP-MYCN e MITF:. Costrutti DNA MITF sono coinjected in una delle cellule di embrioni fase madreperla Nacre designa un tipo di pesce mutante manca un neurale derivati ​​dalla cresta melanophore durante lo sviluppo 36. Così, la comparsa di cellule del pigmento negli embrioni iniettati suggerisce l'integrazione di MITF: DNA MITF costruisce nel genoma. È stato dimostrato che due o tre costrutti di DNA possono essere coinjected cointegrate nel genoma pesci 31. Così, pigmentazione causata da espressione MITF può servire come marker per l'integrazione della dβh: transgene EGFP-MYCN e per una più facile individuazione di MYCN linea transgenica stabile.
  5. Mescolare il d βh: EGFP-MYCN e MITF: DNA MITFcostrutti in un rapporto 3: 1 in un volume totale di una reazione di 15 microlitri di 1 ml di I-SCEI enzima e 0,75 ml di tampone. Assicurarsi che la quantità totale di DNA nella reazione non superi 750 ng.
  6. Effettuare la digestione I-SCEI a temperatura ambiente per 4 ore o O / N. Il secondo giorno, la I-SceI- digerito DNA sono pronti per microiniezione o possono essere conservati a -20 ° C per l'iniezione in futuro. Conservare l'enzima I-SCEI a -80 ° C in piccole aliquote per mantenere la sua efficacia enzima.
  7. Subclone la ALKF1174L umano e wild-type del gene ALK dal pcDNA3 vettore (un dono generoso del Dr. George al Dana-Farber Cancer Institute) 7 in EcoRI e NotI siti di un vettore pENTRY1A (un dono generoso del Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germania) utilizzando DNA ligasi T4 secondo il protocollo del produttore.
  8. Generare il d βh: ALKF1174L </ Em> o dβh: costrutti transgenici ALKWT utilizzando il sistema ricombinante di cui al protocollo 1.2. In breve, unire tre cloni di ingresso, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (o ALKWT -pENTRY1A) e P3E-polyA, nel vettore di destinazione modificato contenente siti di riconoscimento I-SCEI (un dono generoso del Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germania), con LR Clonase enzima Mix, secondo il protocollo del produttore.
  9. Mescolare il d βh: ALKF1174L (o dβh: ALKWT) e dβh: DNA mCherry costruisce in un rapporto di 3: 1 e linearizzare con I-SCEI enzima, come descritto nel protocollo 1,5-1,6.

2. Microiniezione

  1. Utilizzare micropipette di vetro con diametro di 1,0 mm per tutte le iniezioni di 37. Spezzare la punta delle micropipette di vetro con una lametta prima dell'iniezione. Calibrare il volume di iniezione per iniezioneing H 2 O in una goccia di olio minerale. Misurare il diametro delle goccioline risultanti e regolare la microinjector (pressione o durata di impulso di pressione) per assicurare che il volume di iniezione è inferiore al 10% del volume cellulare totale di uno embrioni cellule stadio.
  2. Aggiungere un ulteriore 0,5 l di fresco I-SCEI enzima (5 unità / ml) in 5 ml di soluzione iniettabile contenente DNA costruisce destra prima dell'iniezione per aumentare l'efficienza della transgenesi 38. Iniettare 50-80 pg di costrutti di DNA linearizzate nel citoplasma di una cellula-embrioni stadio. Per assicurare il successo di iniezione, miscelare il campione con 0,25% di rosso fenolo per la visualizzazione. Se le cellule diventano rossi dopo l'iniezione, indica la microiniezione è riuscita. Per garantire un alto tasso di successo per la generazione di pesci transgenici, di solito iniettare fino a 500 embrioni.
  3. Per generare pesci transgenici che esprimono stabilmente MYCN, coinject il linearizzato d βh: EGFP-MYCN e MITF: costrutti DNA MITF (in un rapporto di 3: 1) in embrioni di pigmentazione mutante madreperla zebrafish allo stadio unicellulare. L'espressione di Mitf serve come reporter per l'integrazione di costrutti transgenici nel genoma pesci.
  4. Per sovraespressione mosaico di ALK nel wild-type o MYCN embrioni transgenici, co-iniettare il linearizzato d βh: ALK F1174L (o dβh: ALKWT) con dβh: DNA mCherry costruisce (in un rapporto di 3: 1) nella cellula uno embrioni risultanti da allevamento di F1 eterozigoti Tg (dβh: EGFP-MYCN) pesci transgenici con wild-type AB pesce. Così, la metà dei figli sono transgenici per MCYN e mezzo sono wild-type.

3. Schermo per Pesce stabile o Mosaic transgenici

  1. Per aumentare l'efficienza di identificazione delle linee MYCN esprimente stabili, anestetizzare gli embrioni madreperla principalmente iniettati con tricaine (0,02%) at giorni 3-5 di postfertilization e schermo per la pigmentazione. Trasferire gli embrioni con pigmentazione ad una nuova capsula di Petri con acqua fresca all'uovo ed aumentare loro di maturità sessuale per ulteriori controlli per il pesce fondatore, che portano il d βh: transgene EGFP-MYCN nelle cellule germinali.
  2. Per identificare il fondatore con la trasmissione germinale di EGFP-MYCN, outcross pigmentato pesce F0 adulto con wild-type AB pesci e dello schermo per embrioni EGFP-positivi a 1-2 giorni dopo la fecondazione per ulteriori genotipizzazione. Posizionare un singolo embrione F1 EGFP-positivi in ​​un tubo di PCR e rimuovere tutto il liquido. Aggiungere 50 ml di tampone di estrazione gDNA che contiene 12,5 ml di tampone di lisi 4x, 35 ml di H 2 O e 2,5 ml proteinasi K (10 mg / ml) per singolo embrione. Incubare la reazione per 2-3 ore a 55 ° C, seguita da 10 minuti di incubazione a 98 º C per inattivare proteinasi K. Per 50 ml di tampone di lisi 4x, aggiungere 500 ml di 1M Tris (pH 8,4), 2,5 ml di 1M KCl to 47 ml di H 2 O. NOTA: Dopo F0 MYCN stabile pesci transgenici sono allevati con wild-type AB pesce, tutti i figli sono pigmentate. Così, la pigmentazione non può servire come marcatore per l'identificazione di MYCN- pesci positive. Mentre nel pesce transgenico MYCN, la proteina di fusione EGFP-MYCN è espresso nella PSNS, compresi i neuroni simpatici del ganglio cervicale superiore e sequenziale segmentale gangli della catena simpatica ei PSNs non neuroni dopaminergici, come il midollo allungato e gangli cranica 8. Così, l'espressione di EGFP può servire come marker per l'identificazione degli embrioni transgenici stabili MYCN.
  3. Utilizzare 2 ml di gDNA estratte dall'embrione F1 pigmentata come modello, primer MYCN-test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 ', e la seguente ingegno programmah GC-RICH PCR: 1 ciclo di 95 ° C per 3 minuti, 25 cicli di 95 ° C per 30 sec, 58 ° C per 30 sec e 72 ° C per 3 min. Noi di solito genotipo 14-16 embrioni pigmentati da un unico accoppiamento per confermare la presenza di transgene MYCN integrati negli embrioni pigmentati, più di 6 fondatore pesce iperespressione MITF e MYCN sono stati individuati con questo metodo.
  4. Sollevare il resto degli embrioni F1 EGFP-positivi. Clip Fin e genotipo a 2-3 mesi di età utilizzando il protocollo di cui sopra per confermare ulteriormente l'integrazione di MYCN transgene nel pesce. Razza F1 MYCN pesci transgenici stabile con wild-type AB pesce. Co-iniettare il linearizzato d βh: ALK F1174L (o dβh: ALKWT) con dβh: DNA mCherry costruisce in embrioni uno cellule, come descritto nel protocollo 2.4.
  5. Ordina la MYCN esprimente embrioni nell'esperimento descritto nel protocollo 2.4 utilizzando un fluoro stereoscopicaMicroscopio escence e schermare gli embrioni principalmente iniettati a giorni 1-3 del postfertilization per l'espressione di EGFP-MYCN nella PSNS. Poi, nei giorni 2-5 di postfertilization, anestetizzare gli embrioni con tricaine (0,02%) e ordinare quegli embrioni MYCN- positivi o negativi di nuovo in base all'espressione dei mCherry nelle PSNS utilizzando un microscopio a fluorescenza stereoscopico. L'espressione di mCherry serve come un marcatore per la coespressione di ALK nei tessuti degli animali primaria mosaico iniettati.
    NOTA: ~ 600 prole derivante dall'allevamento di MYCN stabile pesci transgenici con wild-type di pesce sono stati iniettati per gruppo con i costrutti di DNA linearizzate, tra cui d βh: ALK F1174L e dβh: mCherry, dβh: ALKWT e dβh: mCherry, o dβh : mCherry solo, rispettivamente. Espressione Mosaico di mCherry può essere osservato nel 70-90% dei pesci principalmente iniettato. La metà di One-terzo del pesce iniettato sopravvissuto attraverso la fase di larve per la vigilanza del tumore.
  6. Sollevare tutto il mCherry + MYCN + e mCherry + MYCN - embrioni secondo i protocolli standard del libro zebrafish 39 e monitorare tumore insorgenza inizio alle cinque settimane postfertilization.

4. Tumore Orologio in Mosaic Transgenic Pesce

  1. Monitorare mCherry- positivo pesci principalmente iniettata ogni 2 settimane a partire da 5 settimane postfertilization per l'evidenza di tumore insorgenza.
  2. Anestetizzare pesce con tricaine (0,02%) e lo schermo per la presenza di mCherry - e EGFP esprimente tumori nei PSNS sotto la Nikon SMZ-1500 microscopio a fluorescenza stereoscopico dotato di una vista fotocamera digitale DS-U1.
  3. Per verificare se i tumori esprimono il transgene ALK, isolare il mCherry- e masse EGFP-positivi per ALK genotipizzazione PCR.
  4. Usando PCR, amplificare DNA genomicoestratto da tumori sviluppati con i seguenti primer: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 'e ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3' e la seguente reazione PCR: 1 ciclo di 94 ° C per 5 minuti, 30 cicli di (94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 60 sec). Quindi, la sequenza del prodotto PCR con ALK P7 fondo per confermare ulteriormente l'esistenza di mutante o wild-type ALK nei tumori mCherry-positivi.

Representative Results

Per verificare se la sovraespressione di mutationally attivato F1174L ALK o wild-type ALK potrebbe collaborare con MYCN in induzione neuroblastoma, abbiamo sovraespresso o ALK umano attivo o wild-type ALK umana sotto il controllo del promotore d βh nel PSNS di pesci transgenici iperespressione MYCN. Uno dei seguenti costrutti, dβh - ALKF1174L o dβh - ALKWT, sono stati coinjected con dβh - mCherry in una cella wild-type o MYCN embrioni transgenici (Figura 2a) 8. L'espressione di mCherry servito come marcatore per la coespressione di ALK nei tessuti degli animali primaria mosaico iniettati. Tutti i genotipi attesi erano rappresentati nel pesce iniettato: (1) MYCN esprimente il pesce con coexpression mosaico di attivazione ALKF1174L e mCherry MYCN esprimente il pesce con coexpression mosaico di wild-type ALK e mCherry, MYCN designato; mosaico ALKWT; (3) MYCN esprimente il pesce con l'espressione mosaico di mCherry, MYCN designato; mosaico mCherry; (4) wild-type pesce con coexpression mosaico di attivazione ALKF1174L e mCherry, WT designato; mosaico ALKmut; e (5) wild-type pesce con coexpression mosaico di wild-type ALK e mCherry, designato WT; mosaico ALKWT. Un orologio tumore è stata quindi eseguita ogni 2 settimane da cinque settimane postfertilization (WPF) su un totale di 492 animali iniettati.

Otto GFP + / + mCherry tumori sorsero nella ghiandola interrenal, la ghiandola surrenale equivalente umano, da 9 WPF nel pesce MYCN esprimente coinjected con d βh - ALKF1174 L e dβh - mCherry (figure 2B e 3). Questi tumori sono stati histologicamente, immunoistochimica, ultrastrutturale e paragonabile a neuroblastoma umano (dati possono essere trovati in riferimento 8). Per contro, nessun tumore sono stati osservati da 9 settimane di età nel MYCN esprimente il pesce coinjected con dβh - ALKWT e dβh - mCherry (Figure 2C e 3, p = 0,002) o iniettati con dβh - mCherry alone (figure 2D e 3, p = 0,007). I tumori sono sorte sia nel MYCN, mosaico ALKWT e MYCN; mosaico mCherry pesce con lo stesso tasso di induzione dopo 12 settimane di età. Inoltre, neuroblastomi non sono stati rilevati in qualsiasi tipo selvaggio pesce coinjected sia con la wild-type ALK e mCherry o ALKF1174L e mCherry transgeni nel corso delle 15 settimane di monitoraggio. Presi insieme, questi risultati mostrano che la sovraespressione mosaico di mutationally attivato ALK accelera MYCN tumorale indotta onrif, indipendentemente dal sito di integrazione nei singoli animali mosaico, e che la sovraespressione di tipo selvaggio ALK ai livelli guidato dal promotore dβh non sembra collaborare con MYCN sovraespressione di indurre neuroblastoma in questo sistema modello.

Figura 1
Figura 1: schema Schema di stabile convenzionale e mosaico transitori zebrafish strategie transgenici nello studio dei contributi Cooperativa di oncogeni candidati alla tumorigenesi (A) Stabile strategia transgenici.. Linearizzato transgenico costrutto DNA contenente candidato oncogene viene iniettato in fase unicellulare wild-type o madreperla embrioni mutanti di zebrafish in cui il transgene può essere integrato nel genoma del pesce a caso loci genomici. È necessaria l'integrazione di transgene nelle cellule germinali per la generation di linea transgenica stabile. Principalmente embrioni iniettati prendere 3 o 4 mesi per raggiungere la maturità sessuale (generazione F0 di pesce), che sarà outcrossed con wild-type o madreperla pesce mutante per lo screening per il pesce fondatore con la trasmissione transgene germinale. La prole risultante di pesce fondatore, chiamato generazione F1, portano gli alleli eterozigoti del transgene nel loro genoma. Per valutare gli effetti di collaborazione di due oncogeni candidati, come gene "a" e gene "b", nella tumorigenesi, abbiamo allevato la prole F1 di due linee transgeniche stabili sovraesprimono questi transgeni, con solo un quarto della prole che trasportano i transgeni composti. A causa della relativamente bassa efficienza di generare linee transgeniche stabili, questo approccio non è fattibile per high-throughput analisi di genomica funzionale. (B) Mosaico strategia transgenici transitoria. Simile alla transgenesi stabile, linearizzato co DNA transgenico nstructs contenenti geni candidati possono essere iniettati in fase unicellulare wild-type embrioni. Perché il transgene non deve essere integrato nel genoma delle cellule germinali, molto tempo e fatica possono essere salvati nel processo di identificazione dei pesci fondatore. In alternativa, se la linea di pesci transgenici che sovraesprimono uno degli oncogeni candidati è disponibile (nel nostro caso, MYCN pesci transgenici sono stati sviluppati), costrutti di DNA linearizzato transgenici contenenti altri geni possono essere iniettati in un cella embrioni fase transgenici per studiare la loro cooperazione tumorigenesi. Fino a tre costrutti transgenici possono essere coinjected e coespressi nel pesce soprattutto iniettato 31; in tal modo, l'interazione di oncogeni candidati tumorigenesi può essere valutata nel pesce soprattutto iniettato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Mosaico Espressione del Attivato ALK Accelera l'insorgenza di MYCN indotta Neuroblastoma 8 modificata figura con il permesso di Elsevier (riferimento 3466510609819).. (A) approccio per la costruzione di transgenesi mosaico. (BF) 2-day-old larve di embrioni principalmente iniettati. Vista laterale di espressione stabile EGFP nei neuroni dopaminergici, compresi gangli cranica (CG, punte di freccia) in immagini di fluorescenza-brightfield unite (pannelli superiori). Vista laterale di espressione mCherry mosaico (pannelli inferiori) nei gangli cranica (CG, punte di freccia), midollo allungato (MO, frecce). Alcuni espressione mCherry ectopica si osserva nel non-PSNS e neuroni non-dopaminergici. (G - K) 7 settimane di età pesci principalmente iniettati.(B, G) MYCN esprimente il pesce coinjected con d βh - ALKF1174L e dβh - mCherry costruisce (MYCN; mosaico ALKmut). EGFP - e tumori -positive mCherry sorsero a 7 settimane (frecce vuote bianchi G). (C, H) ​​MYCN esprimente il pesce coinjected con dβh - ALKWT e dβh - mCherry costruisce (MYCN; mosaico ALKWT). (D, I) MYCN esprimente il pesce iniettato con dβh - mCherry costruire da solo (MYCN; mosaico mCherry). (E, J) Wild-type (WT) di pesce coinjected con dβh - ALKF1174L e dβh - mCherry costruisce (WT; mosaico ALKmut). (F, K) Wild-type (WT) di pesce coinjected con dβh - ALKWT e dβh - mChercostrutti Ry (WT; mosaico ALKWT). I neuroblastomi non sono stati osservati nel MYCN esprimente il pesce coinjected con dβh-ALKWT e dβh - mCherry o dβh - mCherry solo alle 7 WPF, o in uno qualsiasi dei fratelli che non ereditano il transgene MYCN e sono stati iniettati sia con il gene ALKWT o il gene ALKF1174L. Bar Scala, 100 micron in B - F e 1 mm in G - K. Una Nikon SMZ-1500 microscopio a fluorescenza stereoscopico dotato di una vista fotocamera digitale DS-U1 e un Leica MZ10F microscopio a fluorescenza stereoscopico dotato di una fotocamera digitale Leica DFC 345FX sono stati usati per catturare l'images.The fluorescente immagini acquisite sono stati elaborati e compilati con Adobe Photoshop e Illustrator CS3 software (Adobe). Cliccate qui per vedere una versione più grandedi questa figura.

Figura 3
Figura 3: L'insorgenza di Neuroblastoma in MYCN Transgenic pesce o Wild-type (WT) Pesci Mosaici Coinjected con i costrutti di DNA. Ristampato con il permesso di Elsevier (riferimento 3466510609819) d βh - ALKF1174 L e dβh - mCherry (mosaico ALKmut). Dβh - ALKWT e dβh - mCherry (ALKWT mosaico); o dβh - mCherry (mosaico mCherry) solo 8. La differenza tra tumore insorgenza del 9 WPF in MYCN esprimente il pesce coinjected con dβh - ALKF1174 L e dβh - mCherr y (MYCN; mosaico ALKmut) e che, in linea MYCN coinjected con dβh - ALKWT dβh - mCherry (MYCN; mosaico ALKWT) o dβh - mCherry alone (MYCN; mosaico mCherry) è significativa a p = 0.002 ep = 0.007, rispettivamente, da due code test esatto di Fisher.

Discussion

In questo studio rappresentativo, abbiamo utilizzato coiniezione transitoria e coexpression di ALK attivato con il gene reporter mCherry in MYCN esprimente il pesce transgenico per dimostrare che questi geni cooperano per accelerare notevolmente l'insorgenza di neuroblastoma, in linea con la nostra scoperta precedente composto stabile transgenici coexpressing pesce sia attivato ALK e MYCN 8. Questo approccio transgenico mosaico possiede diversi vantaggi rispetto al metodo convenzionale. Il più importante, consente un rapido esame degli effetti della coexpressing oncogeni candidati negli animali principalmente iniettati (generazione F0) senza la necessità di animali transgenici stabili, come ad esempio eliminando il tempo eccessivo e del lavoro in genere partecipato alla selezione e l'identificazione di ALK esprimente stabile pesci transgenici. Abbiamo esaminato anche l'effetto della sovraespressione di wild-type ALK, con o senza MYCN overespressione, il tumore iniziazione. I risultati mostrano che la sovraespressione transiente di tipo selvaggio ALK nel nostro modello pesce non è sufficiente per avviare neuroblastoma tumorigenesi, indipendentemente dallo stato del oncogene MYCN. Sarebbe interessante verificare in futuro se coexpression transitoria sia ALK attivato e MYCN in pesce selvatico-tipo potrebbe indurre prima insorgenza della tumorigenesi nel pesce soprattutto iniettato. Questo studio avrebbe più fedelmente imitare il contesto malattia reale, in cui alterazioni somatiche di entrambi i geni co-si verificano in un sottogruppo di pazienti ad alto rischio di neuroblastoma 5.

Un importante elemento di design della strategia transgenico transitorio mosaico è l'inserimento di un gene reporter per la co-iniezione con qualsiasi oncogeni candidati di interesse, che aiuta a screening per animali con successo dell'integrazione dei transgeni tra gli embrioni di zebrafish soprattutto iniettati e per monitorare il pesce positivo per Tumor insorgenza e la progressione. Per aumentare l'efficienza di transgenesi, abbiamo applicato l'approccio transgenico meganuclease mediata I-SCEI, che aumenta significativamente l'espressione promotore-dipendente uniforme transgeni dal 26% degli embrioni principalmente iniettato senza meganuclease al 76% degli embrioni iniettati con 38 meganuclease . Sebbene l'uso di un approccio transgenico I-SCEI meganuclease mediata ha migliorato l'efficienza di transgenesi notevolmente, la percentuale di embrioni iniettati positivamente ai transgeni rimane inferiore al 100%. Pertanto, l'espressione di un gene reporter coinjected può servire come marcatore per identificare embrioni iniettati con successo dell'integrazione dei transgeni candidati prima monitorare ulteriormente il pesce per l'insorgenza di tumori. Al contrario, un approccio transgenico Tol2 transposon-mediata è diventato uno strumento genetico popolare modello vertebrati ed è stato utilizzato con successo per transgenesi, mutagenesi inserzionale, trappola geneping, e enhancer intrappolando 40,41. Co-iniezione di trasposoni Tol2 con trasposasi mRNA in embrioni fecondati può facilitare eventi di integrazione iniziali che aumenta l'efficienza di integrazione cromosomiche e potenzia il successo della trasmissione germinale del transgene 42. Tuttavia, a causa del meccanismo di "cut-e-incolla" di trasposizione DNA, una singola copia del transgene è integrato nel cromosoma di inserimento per locus 42. Così, geni candidati coinjected sono molto probabilmente integrati singolarmente nel genoma pesci in siti differenti, che potrebbe portare alla espressione di geni in cellule diverse e più complicato modello transitori e mosaico espressione di geni coinjected nel pesce principalmente iniettato.

Nel complesso, questo studio supporta l'utilizzo futuro di transgenesi mosaico come un mezzo rapido per valutare la collaborazione, forse sinergica, le relazioni tra più oncogeni in un high-esimomaniera roughput, una sfida che è difficile incontrare con altri modelli animali, tra cui roditori. Finora, questa strategia è anche stato applicato con successo in zebrafish transgenico per identificare i geni che sopprimono il attivata RAS avvio indotta di rabdomiosarcoma 31 e modificano la sensibilità alle radiazioni delle cellule T MYC indotta leucemia linfoblastica acuta 31. Inoltre, Langenau et al, 15 hanno dimostrato che combinando l'approccio co-iniezione, con un approccio transgenico heat-shock-inducibile può indurre l'espressione del transgene da shock termico nel pesce soprattutto iniettato, che sarebbe molto utile per esplorare i ruoli di cooperazione di oncogeni nel tumore progressione, in quanto consente l'espressione genica di essere acceso dopo che è stabilito il tumore primario. Molto recentemente, Langenau e colleghi hanno sviluppato il primo modello zebrafish immunocompromessi di mira gene RAG2 con ingegnerizzato zinc-finger nucleasi 43. Perditadella funzione di RAG2 consentito robusto e di lunga durata attecchimento di molteplici tessuti e cellule tumorali 43, un vantaggio che potrebbe essere utile per il trapianto delle cellule tumorali che iperesprimono eterogenee transgeni candidati e valutare l'effetto di espressione del transgene mosaico sulla capacità di auto-rinnovamento, terapeutico risposte e il tasso di crescita di queste cellule tumorali.

Infine, la transgenesi mosaico offre un altro vantaggio unico sopra transgenesi stabile. Negli animali transgenici stabili, i transgeni sono integrati nel genoma di ogni singola cellula del corpo e sono ereditarie di generazione in generazione 27. Tuttavia, molti tumori derivano da alterazioni genetiche nelle cellule somatiche invece di mutazioni ereditarie nelle cellule germinali 44. Così, il mosaico di integrazione transgene nel primario iniettato pesce e genotipi misti in popolazioni di cellule dei singoli pesci transgenici mosaico sarebbe meglio ricapitolare the difetti somatici trovati nei pazienti e sarebbe evitare l'effetto posizionale artificiale provocata da un singolo sito di inserimento in una linea transgenica stabile. D'altra parte, la popolazione mosaicismo e piccolo di cellule che overesprimono i transgeni in pesci principalmente iniettato studio meccanicistico rende più difficile.

In sintesi, la strategia transgenico mosaico fornisce uno strumento robusto per la valutazione rapida ed efficace del contributo cooperativa di oncogeni dell'inizio del tumore e la diffusione. Questo progresso dovrebbe generare informazioni seminale sull'interazione tra oncogeni candidati, che è urgente per ulteriori indagini produttiva dei meccanismi oncogeni e percorsi e per lo sviluppo efficace terapia mirata. Aumentare l'efficienza di cointegrazione di più di tre costrutti di DNA coinjected avrebbe aperto la possibilità per l'esame delle complesse relazioni tra combinazioni multigeniche contemporaneamente espresse in vari tipi di lattaCER. Le sfide per il futuro sarà quello di modificare la strategia transgenico mosaico per accomodare ogni modifica genomico o epigenetico che potrebbe svolgere un ruolo nel processo neoplastico, piuttosto che limitare il suo uso a mutazioni che cambiano solo la proteina-codifica o ai geni sono overexpressed, guadagnato o amplificato. Recentemente, il miglioramento delle tecniche di editing del genoma, come la trascrizione nucleasi attivatore-like effettrici (Talens) 45 e cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) (Cas) sistemi / CRISPR associate 46, si sono ampiamente utilizzati per più rapidamente e modificare efficacemente endogena geni in diversi tipi di cellule e organismi 46. Tali tecniche ci permetterebbe di effettuare mirata, altamente efficienti modifiche di sequenza del genoma e l'espressione genica nel sistema modello zebrafish e di capire meglio il meccanismo (s) alla base del ruolo delle alterazioni genomiche o epigenetiche nel tumore patogenesi. Questi, a loro volta, sono suscettibili di stimolare the sviluppo di terapie molecolari per una serie di tumori.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix
Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

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