Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

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Bioengineering

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Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding. J. Vis. Exp. (96), e52576, doi:10.3791/52576 (2015).

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Abstract

Introduction

Die Haut ist das größte Organ des Körpers. Es schafft eine Barriere zwischen der äußeren Umgebung und der inneren Organe. Darüber hinaus schützt die Haut den Körper von Flüssigkeitsverlust, Umwelteinflüsse, Verletzungen und Infektionen und hilft bei der Körpertemperatur 1 regulieren. Aufgrund seiner exponierten Lage ist die Haut oft durch mechanische, thermische oder chemische Trauma betroffen. Obwohl die Haut in der Regel in der Lage, Selbstreparatur ist, können mehrere lokale Faktoren wie Infektionen, Sauerstoffzufuhr und venösen Versorgung zu Wundheilungsstörungen führen. Die Wundheilung kann auch durch systemische Faktoren, wie Fettsucht, Alkoholismus, Rauchen, Medikamente, Lebensmittel und Krankheiten wie Diabetes griffen werden. 2

(I) die Entzündungsphase, (ii) die proliferative und die (iii) Remodellierungsphase: Der Prozess der Wundheilung kann in 3 Phasen eingeteilt werden. Bei Verletzung der Haut beginnt eine komplexe Signalkaskaden, die zum Verschließen der Wunde. 3Nach einer Verletzung wird die Wunde Blutungen und ein Blutgerinnsel gebildet wird. Fibroblasten in die Blutgerinnsel zu bewegen und ersetzen sie durch neue Gewebe, die anschließend über Jahre umgebaut wird.

Das aktuelle Verständnis der biologischen Prozesse zugrunde liegenden Hautreparatur ist begrenzt. Kleintier und Schweinemodellen verwendet worden, um die Wundheilung zu untersuchen. Jedoch können diese Ergebnisse nicht direkt auf den Menschen durch speziesspezifische Unterschiede übertragen werden. Zusätzlich zu diesen in vivo-Modellen können einige Aspekte der Wundheilung durch Simulieren eines Wundsituation via Zerkratzen in vitro Schichtkulturen anhand von immortalisierten Zelllinien oder primäre Zellen untersucht werden kann. 4 Diese Kratzer Modelle sind weitgehend standardisiert, aber nicht ausreichend reflektieren das komplexen in vivo Physiologie 5 Neben zweidimensionalen Modellen. haben dreidimensionale menschliche Haut-Äquivalente für dermatologische Forschung entwickelt. Die dermale Teil dieser Modelle sind generated Verwendung verschiedener Gerüste einschließlich dezellularisierte Dermis 6 Kollagen Hydrogelen 7,8 Glycosaminoglycane 9 oder synthetischen Materialien. 10, der diese Hautäquivalente, die Rolle von epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen 11, die Reepithelialisierung der zellulären Sprechen zwischen Fibroblasten und Keratinozyten und Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren untersucht werden können. Darüber hinaus sind diese Modelle nützlich, um neue Erkenntnisse darüber, wie Fibroblasten wandern in die verwundeten Bereich und wie chemotaktische Faktoren beeinflussen die Geweberegeneration zu erhalten. 12

Nicht nur die Erzeugung des Wundheilungsmodell selbst ist schwierig, aber auch die Einrichtung einer hochstandardisierten Wunde in einem Modell ist problematisch. Gemeinsame Techniken zu schaffen Wunden sind Kratztests, 13 Verbrennungen, 14 Bandabrieb, 15 thermische Schädigung, 16 Saugblasen, 17 mit flüssigem Stickstoff, 18 Laser, 19 18 Vernetzer 6 und Biopsieausstanzungen. 20 Die meisten dieser Methoden haben die gleichen Fallstricke. Verletzungen manuell implementiert sind schwer zu standardisieren und zwischen Mehrfachtests zu reproduzieren. Größe, Form und Tiefe der Wunde liegen zwischen Studien und damit die Qualität der Forschungsdaten beeinträchtigen. Die Verwendung eines Lasers zur definierten Haut Verwundung relativ leicht standardisiert werden, sondern führt zu einer Situation nachahmt Verbrennungswunden. Wärme, die durch Laser angewendet kann dazu führen, Proteindenaturierung, Thrombozyten-Aggregation oder Gefäße Verengung, die nekrotischen Gewebes führen kann.

In einem alternativen Ansatz, ein automatisiertes Gerät Verwundung (AWD), die uns definiert und präzise Hautwunden unter sterilen Bedingungen zu generieren entwickelt. Verwundung Parameter wie Tiefe und Geschwindigkeit der Penetration sowie Umdrehungen des Bohrkopfes geregelt werden kann. In dieser Studie, kombinierten wir die AWD mit selbst entwickelten Vollhautäquivalenten (ftSE), die zu einer durch Gangatirkar et al veröffentlichten Protokoll vergleichbar sind. 8. Die dermale Schicht des Hautäquivalent aus humanen dermalen Fibroblasten (HDF), die in einer Kollagen I Hydrogel eingebettet sind. Auf der Hautschicht, sind menschliche epidermale Keratinozyten (HEK) ausgesät. Innerhalb von zwei Wochen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche der HEK Aufbau einer Epidermis von mehreren lebenswichtigen Zellschichten und einer Hornschicht besteht. Neben der Generation dieses Modells zeigt diese Studie die Verwendung von AWD auf, genau definierten Wunden im FTSE erstellen.

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Protocol

HINWEIS: Das Protokoll wird für die Produktion von 24 Vollhautäquivalenten entwickelt. Humane dermale Fibroblasten und Keratinozyten wurden aus Hautbiopsien nach einem vorher veröffentlichten Protokoll isoliert. 21,22 Einverständniserklärung wurde zuvor erhalten und die Studie wurde von der Ethikausschuss für Menschenforschung der Julius-Maximilians-Universität Würzburg genehmigt (182 stimmen / 10).

1. Herstellung von Dermal Component

  1. Löse Kollagen mit 0,1% Essigsäure bis zu einer Endkonzentration von 6 mg / ml. Für die Gel-Neutralisationslösung, Mischung 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml fötalem Kälberserum, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml Chondroitinsulfat (5 mg / ml). Halten Gel Neutralisationslösung und Kollagenlösung auf Eis. Berechnen Sie 500 ul Gel pro Einsatz / Hautäquivalent.
    Hinweis: Da die Gel-Neutralisationslösung wird mit zwei Teilen Kollagenlösung prepa gemischt werdenWieder doppelte Menge an Kollagen.
  2. Zeigen 24 Einsätze in eine Platte mit 24 Vertiefungen.
  3. Resuspendieren menschlichen dermalen Fibroblasten (HDF) in 10 ml DMEM, Zentrifuge für 5 Minuten bei 270 xg und zählen Sie die Zellen. Ermitteln der benötigten Menge aus HDF (5 x 10 4 Zellen pro 500 ul Kollagen-Gel) und die Zentrifuge die Zellen 5 min bei 270 x g.
  4. Entfernen Sie den Überstand und sorgfältig resuspendieren HDF in 4 ml gekühlte Gel-Neutralisationslösung, ohne Luftblasen. Von diesem Schritt stellen Sie sicher, so schnell wie möglich zu arbeiten, um ein vorzeitiges Erstarren der Kollagengele vermeiden.
  5. Resuspendieren Sie die Lösung mit 8 ml Kollagenlösung.
  6. Nehmen Sie die Kollagen-Zell-Mischung mit einem mehrstufigen-Pipette und füllen schnell 500 ul der Mischung in jedem Einsatz. Die Gele für 20 Minuten in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2), um die Gele gelieren.
  7. Versenken der Gele in 2 ml nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Kälberserum (FCS) pro Wellund Inkubation er 24 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2).

2. Zugabe von humanen epidermalen Keratinozyten (HEK)

  1. Entfernen Medium nach 24 Stunden. Löse Fibronektin Humanprotein mit hochreinem Wasser in einer Endkonzentration von 50 ug / ml. Cover jede Hautäquivalent mit 25 ul von Fibronektin-Lösung. Die Gele für 30 Minuten in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2).
  2. In der Zwischenzeit resuspendieren HEK in 10 ml KGM-2 und setzen Zellkonzentration bis 1 x 10 6 Zellen / ml mit KGM-2 bereit, + 5% FCS. Seed 1 x 10 5 Hek auf jedem Gel. Gele Inkubieren für 45 min im Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2), um Zellen zu haften.
  3. Submerse die Gele mit KGM-2 bereit + 5% FCS und Kultur sie im Inkubator (37 ° C, 5% CO 2).

3. Kultur des Vollhautäquivalente (FTSE)

  1. Kultur FTSE 6-7 Tagein absteigender FCS-Konzentration (5%, 2% bzw. 0% FCS). Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage mit der nächst niedrigeren FCS Konzentration. Dazu das Medium vollständig zu entfernen, und fügen Sie 1,6 ml frisches Medium.
  2. Am Tag 7 Medium vollständig zu entfernen.
    HINWEIS: Der FTSE Oberfläche berühren nicht mit der Spitze der Pipette während dies zu tun.
  3. Zeigen alle stecken in ein Well einer 6-Well-Platte mit einer sterilen Pinzette. 1,5 ml Luftbrücke Medium pro Well, sorgen nicht in den FTSE Oberfläche benetzen. Ändern Medium alle 2-3 Tage für weitere 14 Tage.
    HINWEIS: Der Füllstand des Mediums ist Sache des Meniskus des FTSE.

4. Die histologische Analyse

  1. Fixierung und Paraffin-Einbettung des FTSE
    1. Entfernen Kulturmedium, übertragen Einsätze in frische Platten mit 24 Vertiefungen und fixieren Gewebe durch Zugabe von 1,6 ml 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Gewebe für 2 h bei RT. Achtung! Paraformaldehyd ist giftig, manipulieren unter Abzug vornehmen. TransferDer FTSE auf eine gewebeEinbettungsKassette. Entfernen Sie verbleibende Fixiermittel durch Waschen mit Wasser und entwässern das Gewebe mit aufsteigenden Ethanolkonzentrationen.
    2. Teilen Sie die Hautäquivalent durch einen vertikalen Schnitt in der Mitte. Legen Sie die beiden Stücke in einem Paraffin gefüllten Metallgrundform mit Schnittflächen nach unten. Fügen Sie die Gewebekassette auf der Form als Unterlage.
    3. Schneiden Sie 3-5 um Scheiben und schweben sie auf einem 40 ° C Wasserbad für Begradigungen montieren Folien auf geeignete Objektträger. Trockene Scheiben gründlich.
  2. Hämatoxylin und Eosin (H & E) und immunhistochemische (IHC) Färbung
    1. Platz rutscht in Rack und Inkubation für 1 h bei 60 ° C. Stellen Sie sicher, dass Paraffin geschmolzen ist. Stain rehydriert Scheiben mit H & E als standardisierte Übersichtsfärbung.
    2. Für H & E Färbung vorzubereiten 4x Glasfärbung Küvetten mit Xylol, 3x mit Ethanol 96%, 2x mit Ethanol 70%, 1x mit Ethanol 50%, 4x VE-Wasser, 1x Hämatoxylin, 1x HCl-ethanol (13,7 ml 1 M HCl ad 200 ml 50% Ethanol), 1x Leitungswasser, 1x Eosin (1 g Eosin in 100 ml VE-Wasser) und 2 x 2-Propanol.
    3. Die Objektträger 10 min in Xylol I und 10 min in Xylol II entparaffinieren und rehydrieren Rutschen. Dip Slides 3x in Ethanol 96% I, 3x in Ethanol 96% II, 3x in Ethanol 70% und 3x in Ethanol 50%. Drehen Sie Folien in VE-Wasser. Um Hämatoxylin Farbstoff, Tauch 2x in HCl-Ethanol unterscheiden. Spülen in deionisiertem Wasser. Zum Bläuen, Platz gleitet 5 min in Leitungswasser. Für Eosin-Färbung, Ort Folien 1 min in Eosin und anschließend waschen in VE-Wasser. Zur Dehydratisierung, 2x dip Folien in Ethanol 70%, 2x in Ethanol 96% und legt sie 5 min in 2-Propanol I, für 5 min in 2-Propanol II, 5 min in Xylol I und 5 min in Xylol II. Nach H & E Färbung, sind die Zellkerne in blau, Zytoplasma und der extrazellulären Matrix gefärbt sind rot gefärbt.
    4. Für Antigen-Retrieval, entfernen Paraffin mit Xylol und rehydrieren Scheiben für die Färbung. Die Scheibenin Dampfgarer und kochen entparaffinierten und rehydratisierten Schnitte für 20 Minuten im vorgeheizten 10 mM Citratpuffer (pH 6).
    5. Die Objektträger in Waschpuffer (PBS-Puffer + 0,5% Polysorbat 20) und Kreisscheiben mit einem flüssigkeitsabweisenden Schiebe Filzstift oder Diamantspitze.
    6. Die Objektträger in eine feuchte Kammer. Block endogene Peroxidase durch Zugabe von 100 ul 3% Wasserstoffperoxid-Lösung auf jede Scheibe. Achtung! Sehr gefährlich im Falle von Haut- und Augenkontakt. Handgriff mit persönlicher Schutzausrüstung. Wasch gleitet in Waschpuffer.
    7. Den primären Antikörper und Inkubation für 1 h bei RT. Wasch gleitet dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Von nun an sollten die Proben im Dunkeln gehalten werden.
    8. Verwenden Biotin-Streptavidin-Detektionssystem zum Nachweis von spezifischen Antigen-Antikörper-Bindung.
    9. Gegenfärbung Kerne mit Hämatoxylin für 1 min. Entwässern und montieren Folien.
    10. Bild Proben unter Verwendung eines inversen Mikroskop.
<p class = "jove_title"> 5. Verletzungen, die durch Nutzung der automatisierten Verwundung Geräte (AWD)

  1. Bereiten Sie die AWD durch Desinfektion der Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und UV-Licht. Achten Sie darauf, den Bohrkopf der gewünschten Größe (zB 1 mm) angebracht ist.
  2. Zeigen Hautäquivalente in ausgewiesenen Bereichen des Autoklaven Probenträgerplatte mit einer sterilen Pinzette. Setzen Sie den Probenträgerplatte in die Buchse unter dem Bohrkopf.
  3. Verwenden Sie die Steuersoftware, um verwundete Parameter wie folgt: Drehgeschwindigkeit: 15.000 min; Penetration: 1,5 mm; Antrieb: 100 Hz. Diese Parameter müssen für jeden Probentyp individuell festgelegt werden. Über Verwundung Parameter an die AWD.
  4. Starten Verwundung Verfahren. Entfernen Probenträgerplatte aus der Steckdose. Über verwundet FTSE wieder in Einsätze für Kultur mit einer sterilen Pinzette eingesetzt.
  5. Fahren Sie mit der Kultur der Verwundeten FTSE im Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2) zur Untersuchung der Regeneration. Alnativ, verwenden Sie die Modelle für die histologische Analyse zu jeder Zeit.

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Representative Results

Die isolierte HDF- und HEK unterscheiden sich sowohl in der Morphologie und der Expression von typischen Markierungen. HDF zeigten typische spindel Form Morphologie, während die Morphologie der HEK kann durch eine Kopfsteinpflastermorphologie beschrieben werden. Die Zellen wurden durch immunhistochemische Färbung (Figur 1) vor ihrer Verwendung für ftse gekennzeichnet. HDF positiv für Vimentin (1A), einem Marker für Fibroblasten. Primäre HEK hoch auszudrücken frühe Differenzierung Protein Cytokeratin-14 (Abbildung 1B), aber fast kein Ende Keratinozytendifferenzierung Protein Cytokeratin-10 (1C).

Nach Primärkultur, freistehende wir die Zellen aus den Zellkulturflaschen und benutzte sie für die Erzeugung von FTSE. Der FTSE wurden 7 Tage unter submers Medium Bedingungen (2A), gefolgt von einem 14 Tage-Kultur an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (2B) kultiviert. Während dieses Prozesses, der ftSE Vertrag deutlich. Innerhalb von 21 Tagen werden die HEK proliferierenden (2C-E). Durch die Veränderung der mittleren Ebene in der Weise, dass die Oberfläche der Modelle ist, um Luft und durch die Erhöhung der Calciumkonzentration ausgesetzt ist, die Hek stimuliert werden, in einen multizellulären Epidermis, die aus mehreren vitalen Zellschichten der Keratinocyten in verschiedenen Differenzierungszuständen zusammengesetzt ist, zu unterscheiden und eine Hornschicht (2E).

Vergleicht man die Hämatoxylin & Eosin-Färbung von FTSE (2E) mit nativer menschlicher Haut (2F) wird deutlich, dass FTSE imitiert histologische Architektur der Haut. Dies kann durch Immunhistochemie (Figur 3) gezeigt werden. HDF im Kollagen I Hydrogel kann mit primären Antikörpern gegen Vimentin (3A, E) angefärbt werden. Keratinozyten bilden eine epidermale Schicht von Cytokeratin-14 positiv zusammene-Zellen (3B, F) und der späte Differenzierungsmarker Cytokeratin-10 ist in den supra basalen Schichten (3C, G) zum Ausdruck gebracht. Darüber hinaus ist das Stratum corneum positiv Filaggrin (3D, H).

Nach 21 Tage Kulturperiode, die AWD wurde verwendet, um Hautwunden im FTSE erzeugen. Wie in 4A gezeigt, wird die AWD als geschlossene Box-System, um sterile Bedingungen zu gewährleisten konstruiert. In 4B ist eine schematische Zeichnung der Verwundung Prozess demonstriert. Der FTSE auf einer Probenträgerplatte fixiert. Die ganze Verwundung Prozess einschließlich der Einstellung von Parametern wie Absenkgeschwindigkeit und Revolutionen des Bohrkopfes (4D) sowie die Eindringtiefe geregelt wird computergestützt. Die verwundete Verfahren kann optisch über eine Frontscheibe oder durch eine hochauflösende Kamera, die alle Schritte während der Verwundung aufzeichnet überwacht werden Verfahren. Größe, Form und Tiefe der Wunde eintreten kann einzeln (4C) eingestellt werden.

Figur 1
Abbildung 1. Charakterisierung von Zellen, die für die Konstruktion von Vollhautäquivalenten verwendet. Immunhistochemische Färbung von primären humanen dermalen Fibroblasten für Vimentin (A) und des epidermalen Keratinozyten für die frühe Differenzierung Keratin Filament Cytokeratin-14 (B) und der späten Differenzierungs Filament Cytokeratin -10 (C). Eine positive Färbung wird durch braune Farbe angezeigt. Maßstabsbalken zeigen 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 2. Änderungen der Kulturbedingungen und die Reifung von Vollhautäquivalenten. Makroskopische Bilder von Vollhautäquivalente 7 Tage unter submers Bedingungen (A) und 14 Tage an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (B) kultiviert. Vergleich der Hämatoxylin & Eosin-Färbung von Vollhautäquivalenten in verschiedenen Entwicklungsstadien: Nach 7 Tagen (C) 14 Tage (7 Tage an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, D) und 21 Tagen (14 Tage an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, E). Hämatoxylin & Eosin-Färbung von nativen menschlichen Haut (F). Maßstabsbalken zeigen 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 3. Charakterisierung von Vollhautäquivalenten Vergleich immunhistochemische Färbung von Vollhautäquivalenten. (A - D) und native menschliche Haut (E - H) für Vimentin (A, E), Cytokeratin-14 (B, F), Cytokeratin-10 (C, G) und Filaggrin (D, H). Maßstabsbalken zeigen 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. Automatische Verwundung Gerät zur kontrollierten Verwundung auf Vollhautäquivalenten. Die automatisierte Verwundung Gerät (AWD) sorgt sterile conditions beim gesteuerten Verwundung Verfahren (A). Ein angeschlossener Rechner (CPU) steuert die AWD. Die Vollhautäquivalenten (ftSEs) auf der Probenträgerplatte (SCP) platziert werden Abweichungen in Probenmorphologie durch eine Lichtschranke (LB), der die Verwundung Verfahren löst ausgeglichen. Die Wunde Form hängt von der verwendeten Bohrkopf (DH). Der Durchmesser im Bereich von 1 mm (C, obere Bild) bis 2 mm (C, unteres Bild). Die Verwundung Verfahren überwacht und können zur Dokumentation und Qualitätsmanagement (D) aufgezeichnet werden. Hämatoxylin und Eosin gefärbten Querschnitt eines Vollhautäquivalent mit dem automatisierten Verwundung Vorrichtung unter Verwendung eines 1 mm-Bohrkopf (E) verletzt. Alle Skala Balken zeigen 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

In vitro-Zellen werden üblicherweise in zweidimensionalen Zellkulturen, in denen die Zellen auf Kunststoffoberflächen haften erweitert. Allerdings sind diese Kulturbedingungen nicht die physiologischen dreidimensionalen Bedingungen, bei denen Zellen in vivo wachsen zu reflektieren. Unter dreidimensionaler Bedingungen können Zellen, natürlichen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Bindungen einzugehen und wandern in drei Dimensionen. Besonders in der kutanen Wundheilung die Ähnlichkeit der in vivo Situation sind unverzichtbar, um aussagekräftige Daten zu erzeugen, wie die Zellmigration und Matrixerzeugung sind Schlüsselelemente der Wundheilung.

Um diese Bedingungen wir FTSE entwickelt, die der menschlichen Primärzellen zusammengesetzt sind, zu imitieren und spiegeln sowohl die dermale und die epidermale Schicht der Haut. Während zwei Wochen der Kultur an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die Hek bilden eine Epidermis aus mehreren Schichten von Keratinozyten in verschiedenen Differenzierungsphasen und ein Stratum corneum besteht. Furthermore wird die Hautschicht aus HDF, das in einer Kollagen I Hydrogel eingebettet sind. Während der Kulturzeit, HDF umzubauen dermalen Komponente, die zu einer erheblichen Schrumpfung der Modelle (2B) führt.

Um reproduzierbare und standardisierte Wunden vorzubereiten, eine AWD entwickelt. Das computergesteuerte Maschine, genau definierten Hautverletzungen (Abbildung 4). Je nach dem beabsichtigten Forschung, Tiefe, Form und Größe der Verletzung kann angepasst werden. Aufgrund der technischen Spezifikationen der AWD und der Morphologie des FTSE, empfiehlt es sich, eine minimale Penetration von 100 um Reproduzierbarkeit eingestellt. AWD wird unter sterilen Bedingungen, die in einem geschlossenen Kasten-System und alle Komponenten können durch Autoklavieren, Desinfektionsmittel oder UV-Licht sterilisiert werden. In Vorbereitung auf die Verwundung Verfahren müssen die Proben, die an einer Probenträgerplatte übertragen werden. Diese Platte ermöglicht eineexakte Position der Proben. Außerdem ist die Haftung zwischen der Probe und der Probenträgerplatte ist ausreichend, um die Proben an Ort und Stelle während der Verwundung Prozedur beibehalten. Die Verwundung Verfahren selbst kann optisch über eine Frontscheibe oder mit einer hochauflösenden Kamera, die alle Schritte von einer Nahaufnahme Position zeichnet überwacht werden. Im Gegensatz zu anderen Systemen, die Laser verwenden, um Gewebe auszugraben, um eine Wunde zu erzeugen, setzt die AWD einen rotierenden Bohrer. Daher wird keine Wärme während des Verfahrens, die ein wesentliches perquisite auf mechanische Wunden untersuchen aufgebracht. Zusätzlich spezifische Form des Bohrkopfes gewährleistet einen Materialabtrag aus dem Wundkanal. Mit empirisch ermittelt über der Verwundung Verfahren erwähnt Verwundung Parameter können eingestellt werden, um bestimmte physiologische Eigenschaften von entweder der FTSE oder native Hautproben entsprechen. Auf diese Weise unerwünschte Nebenwirkungen, wie ein unbeabsichtigtes Lösen der epidermalen Schichten minimiert und reproduzierbar Verwundung mit einer Erfolgsrate durchgeführt wirdvon 90%.

Diese Studie zeigt, dass die entwickelten ftse teilweise die in vivo Situation der Haut genau nachahmen und können daher als Modell für Wundheilungsstudien eingesetzt werden. Obwohl wichtige Aspekte der Wundheilung, wie der Einfluss des Gefäßsystems, des Blutgerinnsels und das Immunsystem im Modell fehlen, der Epidermis-mesenchymale und Zell-Matrix-Interaktion in einer dreidimensionalen stark standardisierte Umgebung rekapituliert. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die AWD erzeugt standardisierten Wunden in der Haut-Modelle. In Kombination können beide Techniken verwendet werden, um die Wundheilung und die Wirkung von Substanzen und Medikamenten, die den Heilungsprozess zu unterstützen untersuchen. Um die in vivo Situation mehr genau imitieren kann der FTSE durch andere Zellen wie Melanozyten, Hauttumorzellen oder mikrovaskulären Endothelzellen erweitert werden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS PAA L11-003 0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma D8537
Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) Life Technologies 33016-015
Inserts Nunc 140627
6 well plate  Nunc 140685
24 well plate Nunc 142485
Microscope slides R. Langenbrinck 03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, high glucose Life Technologies 11965-092 89% (445 ml)
Fetal bovine serum Bio & Sell FCS.ADD.0500 10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 1% (5 ml)
Keratinozyten culture medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2 Promocell  C-20111 89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack Promocell  C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine PAA G0001,3010 93% (232.5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma C4384-1g 1% (2.5 ml)
Fetal bovine serum Bio & Sell FCS.ADD.0500 3% (7.5 ml)
HEPES Sigma  H3375-1kg 3% (7.5 ml)
Skin model submers medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2 Promocell  C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack Promocell  C-39011
Fetal calf serum Bio & Sell FCS.ADD.0500 5%-2% (25 ml-10 ml) 
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack Promocell  C-39011 adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM) Sigma  C7902-500g 0.62% (3.1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP DCS PD000KIT
Vimentin antibody Abcam ab92547
CK14 antibody Sigma  HPA023040-100µl
CK10 antibody Dako M7002
Filaggrin antibody Abcam ab81468
H&E staining:
Mayer´s Haemalaun AppliChem A0884,2500
Xylol Sigma Aldrich 296325-4X2L
Ethanol Sigma Aldrich 32205-4X2.5L
HCl Sigma Aldrich H1758-500ML
Eosin Sigma Aldrich E4009-5G
2-Propanolol Sigma Aldrich I9516-500ML
Mounting Medium Sigma Aldrich M1289-10ML

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References

  1. Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
  2. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
  3. Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
  4. Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
  5. Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122, (3), 372-381 (2006).
  6. Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14, (2), 203-209 (2006).
  7. Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43, (8), 747-756 (1994).
  8. Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2, (1), 178-186 (2007).
  9. Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36, (6), 791-800 (1998).
  10. El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25, (5), 2987-2996 (2004).
  11. Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112, (Pt 12), 1843-1853 (1999).
  12. Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16, (4), 559-567 (2008).
  13. Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99, (4), 197-207 (2007).
  14. Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80, (1), 69-74 (1998).
  15. Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131, (10), 1134-1138 (1995).
  16. Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274, (15), 10372-10381 (1999).
  17. Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15, (1), 9-10 (1950).
  18. El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84, (1), 102-112 (2004).
  19. Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7, (2), 99-110 (2004).
  20. Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10, (7-8), 1006-1017 (2004).
  21. Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81, (1 Suppl), 2s-10s (1983).
  22. Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
  23. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (10), 839-845 (2007).

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