The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.
In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.
Die Haut ist das größte Organ des Körpers. Es schafft eine Barriere zwischen der äußeren Umgebung und der inneren Organe. Darüber hinaus schützt die Haut den Körper von Flüssigkeitsverlust, Umwelteinflüsse, Verletzungen und Infektionen und hilft bei der Körpertemperatur 1 regulieren. Aufgrund seiner exponierten Lage ist die Haut oft durch mechanische, thermische oder chemische Trauma betroffen. Obwohl die Haut in der Regel in der Lage, Selbstreparatur ist, können mehrere lokale Faktoren wie Infektionen, Sauerstoffzufuhr und venösen Versorgung zu Wundheilungsstörungen führen. Die Wundheilung kann auch durch systemische Faktoren, wie Fettsucht, Alkoholismus, Rauchen, Medikamente, Lebensmittel und Krankheiten wie Diabetes griffen werden. 2
(I) die Entzündungsphase, (ii) die proliferative und die (iii) Remodellierungsphase: Der Prozess der Wundheilung kann in 3 Phasen eingeteilt werden. Bei Verletzung der Haut beginnt eine komplexe Signalkaskaden, die zum Verschließen der Wunde. 3Nach einer Verletzung wird die Wunde Blutungen und ein Blutgerinnsel gebildet wird. Fibroblasten in die Blutgerinnsel zu bewegen und ersetzen sie durch neue Gewebe, die anschließend über Jahre umgebaut wird.
Das aktuelle Verständnis der biologischen Prozesse zugrunde liegenden Hautreparatur ist begrenzt. Kleintier und Schweinemodellen verwendet worden, um die Wundheilung zu untersuchen. Jedoch können diese Ergebnisse nicht direkt auf den Menschen durch speziesspezifische Unterschiede übertragen werden. Zusätzlich zu diesen in vivo-Modellen können einige Aspekte der Wundheilung durch Simulieren eines Wundsituation via Zerkratzen in vitro Schichtkulturen anhand von immortalisierten Zelllinien oder primäre Zellen untersucht werden kann. 4 Diese Kratzer Modelle sind weitgehend standardisiert, aber nicht ausreichend reflektieren das komplexen in vivo Physiologie 5 Neben zweidimensionalen Modellen. haben dreidimensionale menschliche Haut-Äquivalente für dermatologische Forschung entwickelt. Die dermale Teil dieser Modelle sind generated Verwendung verschiedener Gerüste einschließlich dezellularisierte Dermis 6 Kollagen Hydrogelen 7,8 Glycosaminoglycane 9 oder synthetischen Materialien. 10, der diese Hautäquivalente, die Rolle von epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen 11, die Reepithelialisierung der zellulären Sprechen zwischen Fibroblasten und Keratinozyten und Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren untersucht werden können. Darüber hinaus sind diese Modelle nützlich, um neue Erkenntnisse darüber, wie Fibroblasten wandern in die verwundeten Bereich und wie chemotaktische Faktoren beeinflussen die Geweberegeneration zu erhalten. 12
Nicht nur die Erzeugung des Wundheilungsmodell selbst ist schwierig, aber auch die Einrichtung einer hochstandardisierten Wunde in einem Modell ist problematisch. Gemeinsame Techniken zu schaffen Wunden sind Kratztests, 13 Verbrennungen, 14 Bandabrieb, 15 thermische Schädigung, 16 Saugblasen, 17 mit flüssigem Stickstoff, 18 Laser, 19 </sup> Skalpelle, 18 Vernetzer 6 und Biopsieausstanzungen. 20 Die meisten dieser Methoden haben die gleichen Fallstricke. Verletzungen manuell implementiert sind schwer zu standardisieren und zwischen Mehrfachtests zu reproduzieren. Größe, Form und Tiefe der Wunde liegen zwischen Studien und damit die Qualität der Forschungsdaten beeinträchtigen. Die Verwendung eines Lasers zur definierten Haut Verwundung relativ leicht standardisiert werden, sondern führt zu einer Situation nachahmt Verbrennungswunden. Wärme, die durch Laser angewendet kann dazu führen, Proteindenaturierung, Thrombozyten-Aggregation oder Gefäße Verengung, die nekrotischen Gewebes führen kann.
In einem alternativen Ansatz, ein automatisiertes Gerät Verwundung (AWD), die uns definiert und präzise Hautwunden unter sterilen Bedingungen zu generieren entwickelt. Verwundung Parameter wie Tiefe und Geschwindigkeit der Penetration sowie Umdrehungen des Bohrkopfes geregelt werden kann. In dieser Studie, kombinierten wir die AWD mit selbst entwickelten Vollhautäquivalenten (ftSE), die zu einer durch Gangatirkar et al veröffentlichten Protokoll vergleichbar sind. 8. Die dermale Schicht des Hautäquivalent aus humanen dermalen Fibroblasten (HDF), die in einer Kollagen I Hydrogel eingebettet sind. Auf der Hautschicht, sind menschliche epidermale Keratinozyten (HEK) ausgesät. Innerhalb von zwei Wochen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche der HEK Aufbau einer Epidermis von mehreren lebenswichtigen Zellschichten und einer Hornschicht besteht. Neben der Generation dieses Modells zeigt diese Studie die Verwendung von AWD auf, genau definierten Wunden im FTSE erstellen.
In vitro-Zellen werden üblicherweise in zweidimensionalen Zellkulturen, in denen die Zellen auf Kunststoffoberflächen haften erweitert. Allerdings sind diese Kulturbedingungen nicht die physiologischen dreidimensionalen Bedingungen, bei denen Zellen in vivo wachsen zu reflektieren. Unter dreidimensionaler Bedingungen können Zellen, natürlichen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Bindungen einzugehen und wandern in drei Dimensionen. Besonders in der kutanen Wundheilung die Ähnlichkeit der in vivo S…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid) | Produced in house | ||
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
Inserts | Nunc | 140627 | |
6 well plate | Nunc | 140685 | |
24 well plate | Nunc | 142485 | |
Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
Gel neutralization solution (250 ml): | |||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232,5 ml) |
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2,5 ml) |
Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7,5 ml) |
HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7,5 ml) |
Skin model submers medium (500ml): | |||
Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2 |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0,62% (3,1 ml) |
Histology: | |||
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
CK10 antibody | Dako | M7002 | |
Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
H&E staining | |||
Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML |