CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Yaralanmaya yanıt olarak karaciğer iltihabı, monositler, nötrofiller, T hücresi alt kümelerinin, B hücreleri, doğal katil (NK) ve NKT hücreleri de dahil olmak üzere, lökositlerin farklı alt süzmeyi söz konusu eden bir yüksek dinamik bir süreçtir. Bağışıklık hücre göçü izlemek için karaciğer intravital mikroskopi, numune hazırlama ve fiksasyon, optik çözünürlük ve uzun süreli hayvan yaşam konusunda yüksek gereksinimleri özellikle zordur. Ancak, inflamatuar süreçler yanı sıra hücresel etkileşim çalışmaları dinamikleri daha iyi inflamatuar karaciğer hastalığı başlatılması, ilerlemesini ve gerileme anlamak için kritik bilgiler verebilir. Bu nedenle, son derece hassas ve güvenilir bir yöntem yoğun bakım ile kombinasyon halinde göç ve intravital iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu (TPLSM) uzun bir süre (yaklaşık 6 saat) fare karaciğer, farklı bağışıklık hücreleri, hücre-hücre etkileşimini incelemek için kurulmuştur izlenmesi.

esi "> Resim yöntem yumuşak bir hazırlama ve organın en az pertürbasyon ile karaciğerin stabil bir sabitleme içeren, uzun süreli intravital görüntüleme izleme sağlayan, en fazla 6 saat arasında bir zaman dilimi boyunca hemen hemen hiçbir ışıkla ağartma ya da fototoksik etkileri ile çok renkli multiphoton mikroskopi kullanılarak ve fare hayati parametreleri ve dolaşım, sıcaklık ve gaz değişimi istikrar geniş izleme nedeniyle istikrarlı görüntüleme koşulları, özel lökosit alt gruplarının.

CXCR6.gfp karaciğer iltihabı üzerine lenfosit göçünü araştırmak knock-in farelerde bazal şartlar altında ve karbon tetraklorid, periton içine enjekte (ler) i (CCl4) neden olduğu akut ve kronik karaciğer hasarı sonrası intravital karaciğer görüntüleme tabi tutuldu.

Doğal Katil (NK) - - ve aynı zamanda, CD4 T hücreleri gibi T lenfositlerinin alt grupları fakat mukozal Associ CXCR6 esas Doğal Katil T (NKT) lenfositlerin eksprese edilen bir kemokin alıcısı, birated değişmez (MAIT) T hücreleri 1. Bir karaciğer hasarı üzerine kendi değişmiş davranış içine ayrıntılı fikir ve hastalığın ilerlemesinde dolayısıyla potansiyel katılımı izin CXCR6.gfp + bağışıklık hücrelerinin göç desen ve konumlandırma ardından.

Introduction

hücre ve bütün organlarda hücresel fonksiyonlar ya da hatta bütün bir organizma görselleştirme gövde 2'nin hemen hemen tüm parçaları dahil olmak üzere, 50 yıldan fazla bir büyük bir ilgi olmuştur. Bu nedenle, bazı erken çalışmalar zaten karaciğer 3,4 intravital görüntüleme istihdam. Ancak, çeşitli sınırlamalar karaciğer dokusunun uzun vadeli istikrarlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile ilgili güncel var.

Nedeniyle diyafram ve gastrointestinal sistem 5 ile yakın temas içinde karaciğer anatomik pozisyonuna, mikroskobik intravital görüntüleme için en yaygın sorun, bağırsak 6 daha az bir ölçüde, peristaltik hareket solunum nedeniyle ve. Diğer katı organlara kıyasla, karaciğer cerrahisi özellikle zordur. Nedeniyle yoğun mikrovasküler yapı, cerrahi manipülasyon, masif hemorajik lezyonlar ikamet bozulmuş mikrosirkülasyon 7 ve ayrıca aktivasyonunu yol açabilir iBu tür Kupffer hücrelerinde 8 olarak mmune hücreleri. Bu nedenle, doku mekanik tespit 6,9 intravital mikroskopi görüntüleme ile müdahale muhtemeldir yerde yayınlanan.

Sağlıklı bir karaciğer toplam kan hacminin% 10-15 karaciğer damar içinde bulunduğu, ve organ dolaşımdaki değişiklikler (örneğin, kan basıncı dalgalanmaları oldukça duyarlı bir organ oluşturma, genel kalp debisi 10 civarında% 25 alır ). Bu nedenle, aşırı doku işleme veya merkezi dolaşımı yoluyla örneğin, kayma gerilmesi, yerinden, yaralanma hepatik kan akımı aksamalar yanı sıra karaciğer bağışıklık yanıtları etkileyen, lökosit göç davranışı yapay değişiklikler, bozulmuş karaciğer oksijenlenme ve bu nedenle daha fazla karaciğer hasarına yol açacaktır organ koruyucu ve hayvanın genel yaşam süresidir.

Erken mikroskobik çalışmalar Intravital epifloresans mi dayanmaktadırcroscopy, ancak böyle bir fotoğraf ağartma ve düşük penetrasyon derinliği gibi çeşitli teknik kısıtlamalar uzun vadeli karaciğer görüntüleme 4,11,12 için bu tekniğin kullanımını sınırlamak. Bu yeni yöntem, gerçek yaşam durumları 13-15 altında hemen hemen tüm organlarda görüntüleme çalışmaları gerçekleştirmek için teknik yetenekli olduğu gibi 1990'larda multiphoton mikroskopi gelişmesiyle birlikte, fotoğraf beyazlatma veya penetrasyon derinliği sınırlamalar çoğunlukla, çözüldü. Ancak, karaciğer görüntülemesi açısından ana kalan zorluklar vardı: birkaç saat 16 daha uzun süre hepatik Sinüsoidlerde değiştirilmemiş kan akışını ve özellikle kararlı görüntüleme güvence nefes hareketleri, karaciğer dokusunun otofloresansı.

Çeşitli çalışmalar karaciğer 17, örneğin, NKT hücreleri 18-20, T hücreleri 21,22, karaciğer makrofajlar 23,24 veya nötrofiller 25, uzun vadeli multiphoton m fonksiyonu ve çeşitli lökositlerin göçünü ele rağmenicroscopy görüntüleme henüz başarılı nedeniyle daha fazla hasara 26 mevcut hasar ve dolayısıyla daha yüksek duyarlılığa bir görev daha zorlu akut veya kronik karaciğer hastalığı olan hayvanlarda, kurulmuş olmasaydı. Ancak, gerçek zamanlı olarak karaciğerde lökositlerin göç davranışlarını ve hücresel fonksiyonu izleme karaciğer homeostazı ve hastalık 27 kendi özel rolü yeni bakış açıları sağlar.

Kemokin reseptörü CXCR6, doğal öldürücü (NK) hücreler, NKT hücreleri ve bazı T hücresi popülasyonları 18,28 dahil olmak üzere birçok lenfosit alt, ifade edilir. Farelerde Önceki çalışmalar CXCR6 ve aynı kökenli bağ CXCL16 homeostazı karaciğer sinüsoidlerinden üzerinde NKT hücrelerinin devriye kontrol olabileceğini göstermiştir. Sonuç olarak, (CXCR6 lokusunda yeşil floresan protein [GFP] bir knock-in taşıyan) CXCR6.gfp farelerin kullanılması, beyin 29 gibi çeşitli organ lenfosit göçünü araştırmak için tarif edilmiştirve ayrıca karaciğer 18,20, enflamasyon üzerine CXCR6.gfp hücrelerin infiltrasyonunu artış göstererek.

Bu çalışmada verilen yöntemle stabilize koşullar altında uzun bir süre boyunca, bu işlemleri takip edilmesi mümkün olmuştur. Intravital multiphoton bazlı prosedür hayvan ve organın minimal pertürbasyon ile son derece tekrarlanabilir oldu görüntüleme izin; solunum ve dolaşım yakın kontrolü ardından geniş izleme uzun süreli hayvan yaşam için optimize edilmiş; ve son derece esnek ve kolay gibi böbrek veya dalak gibi diğer parankimal organlarda da benimsemeye.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: deneyler (NIH yayın, 8. baskı, 2011) 'bakım ve kullanım Laboratuvar Hayvanlar olan Kılavuzu'nda' Aşağıdaki hayvan çalışmaları düzenleyen Alman mevzuatına uygun olarak yapıldı ve hayvanların korunması konusunda Direktif 2010/63 / AB Bilimsel amaçlı (Avrupa Birliği Resmi Gazetesi, 2010) için kullanılır. Resmi izin hükümet hayvan bakımı ve kullanımı ofis (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Almanya) verildi.

NOT: Kısa vadeli görüntüleme için atlanabilir adımlar hazırlık süresini azaltmak ve cerrahi protokol basitleştirmek için yıldız (*) ile işaretlenmiştir (örn da çekim, 3-D yığınları ya da kısa süreli time-lapse mikroskopi ek). Gerekli Ancak, hayatta kalma süresi büyük ölçüde azalmış olması durumunda Görüntüleme aynı zamanda geniş bir izleme ve sirkülasyon kontrolü olmadan gerçekleştirilebilir.

1. Mikroskop Kurulum ve Ön-cerrahi Hazırlama (5-10 miln)

  1. (Mikroskop, güç Lab, lazer, ısıtma yastığı, klima odasının, web cam, şırınga pompası cihazının, solunum) açın sistemi.
  2. 1.5% Vol Ç 2 Isoflurane Vapor beslemesini ve set İsofluranın seviyesini bağlayın (v / v), küçük bir hayvan solunum cihazına bağlanmak.
    1. Kısa süreli görüntüleme için, sadece ilk ip anestezi indüksiyonu sonrası izofluran kullanarak anestezi korumak (adım 2.2). Daha sonra stabil, karaciğer mikro dolaşımı garanti altına almak için hacimce% 2 (hac / hac), izofluran kullanımı, ve 2 saat aşağıdaki görüntüleme zaman tutmak.
  3. 150-200 ul hacminde 120-140 solunum devir / dak solunum ayarlayın.
  4. Fare agaroz sahne ayarlayın. 40 ° 'lik bir açı ile bir çanak (yaklaşık 10 cm x 15 cm, baz) içine dökülerek,% 3 (w / v) agaroz 100 ml hazırlayın.
  5. Gerekli aletleri toplama cerrahi çalışma alanını ayarlayın. Mikrobiyal enfeksiyonu önlemek için, Sekusept Forte S bir% 1 çözeltisi (kullanarak aletleri% 9.9 w / v dezenfekte) Glutaraldehit w / v% 9.8, deney (Şekil 1A önce 5 dakika için formaldehit).
  6. Kalan bileşenler elde edilir: Cilt dezenfektan (örneğin,% 10 povidon iyot solüsyonu), karaciğer aşama (yığınları ve köprü), agaroz çözeltisi (% 3 (w / v) PBS içinde)% 5, şırınga pompası (ağ / hac) glikoz çözeltisi anestetik çözeltisi (Ketamin 0.1 mg / ml, iksilazin 0.5 mg / ml, Fentanil 5 ug / ml), pamuklu, n-Butil-2-Cyanoacrylat ve 1x PBS ile (G-5), enjektör pompası olabilir. Ön ısıtma için kuluçka odasına agaroz sahne çanak koyun.

2. Trakeotomi (10-15 dk)

  1. 25-28 g ağırlığında ev yetiştiriciliğinde gelen C57BL / 6 fareler kullanın. House, 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık çevrimi olan bir ısı- olarak FELASA kılavuzlarına uygun ve nem kontrollü bir ortamda belirli bir patojen içermeyen koşullar altında fareler. Hayvanların standart fareler diyet (koklayın Standart Kemirgen Diyet) ve su ad libitum ücretsiz erişime izin ver.
  2. Init tarafından fare anestezisiial intraperitonal anestetik II çözeltisi 250 ul (Ketamin 0.1 mg / ml, iksilazin 1 mg / ml, Buprenorfin 10 ug / ml) (İP) enjeksiyon.
    1. * Intravital görüntüleme sırasında bakım için, sürekli kesintisiz ip enjeksiyonu ile anestezi çözeltisi I yönetmek (Ketamin 0.1 mg / ml, iksilazin 0.5 mg / ml, Fentanil 5 ug / ml), 0.2 ml / st bir akış oranında bir şırınga pompası cihazı kullanılarak enhalasyon izofluran 0.5% Vol kombinasyonu (hac / hac).
    2. , Trakeotomi için cildi dezenfekte, 5 dakika (forseps ile örneğin tutam ayak pedi) sonra refleksleri kontrol fare cerrahi hoşgörülü anestezi durumunda ise hazırlık başlar.
    3. (Şekil 1B) kurumasını önlemek için göz kornea koruyucu krem (örneğin, Dekspantenol 50 mg / g) uygulayın.
  3. Ekstremitelerde için yapışkan bant kullanılarak ventral tarafı açığa hazırlık masaya fareyi sabitleşmek; yavaşça, bu pozisyonda sabitleşmek örneğin., boyun daraltabilir, bir lastik bant kullanarak t bağladımkesici dişler o.
    1. Bir pamuklu çubukla dezenfektan uygulayarak, povidon iyot solüsyonu kullanarak cilt ve kürk dezenfekte edin.
  4. Doğrudan çene altına ilk cilt kesme (0.5-1 cm uzunluğunda) gerçekleştirin (Şekil 1C)
    1. Dikkatle, tükürük bezlerinin (Şekil 1D) arasındaki bağ dokusunu incelemek.
    2. Dikkatlice açın kas tüp çevreleyen trakea (Şekil 1E, F) gözyaşı.
  5. Daha sonra havalandırma tüpü sabitleme (Şekil 1G) için trakea altında cerrahi iplik yerleştirin.
    1. T-şekilli kesi performans kıkırdak halkaları arasındaki mikro-makas ile Açık trakea (Şekil 1 H)
  6. Insizyon (~ 0.5 cm) ile trakea içine havalandırma tüpü yerleştirin. Ileri tüp itin küçük anatomik forseps ile kaudal ucunu yakala ve yavaşça trakea içine tüp ilerletmek için (Şekil 1I)
  7. Cerrahi iplik ile tüp sabitleşmek (örn (Şekil 1J, K) önlemek için cildin borunun ikinci kranial tespiti yapmak.
  8. Doku yapıştırıcısı (örneğin, n-bütil-2-Cyanoacrylat) (Şekil 1 L) ile sızdırmaz bir kesim.
  9. Yapışkan bant kullanılarak başında tüp sabitleşmek.

3. laparotomi (15-20 dk)

  1. Hipotermi önlemek için ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirin. Karın Tıraş, dikkatle deriden saç kaldırmak. Povidon iyot çözeltisi ile traş cilt ve kürk dezenfekte edin.
  2. Cerrahi makas (Şekil 2A) kullanarak sternum altında kesilmiş küçük bir cilt gerçekleştirin. Kanamayı önlemek için tüm görünür kan damarları dağlama, yanal her iki tarafa da kaburga altında kesim uzatın.
  3. Dikkatle periton (Şekil 2B) açılış, sternum altında linea alba küçük bir kesim gerçekleştirmek. Cauteriz kullanarak her iki taraf için kesim uzatıntirme (Şekil 2C, D) kanamayı önlemek için.
  4. Agaroz sahne çanak (Şekil 2E) içine fare yerleştirin. Fare (genellikle 12-14 kapak slipleri) (Şekil 2F) her iki tarafına da, uygun yükseklikte yığınları yerleştirin.
  5. Solunum ile mikroskop eşitlemek için sırtın üst solunum altında tetik sensörü yerleştirin. Tetik ünitesi (Şekil 2G) etkinleştirin.
  6. Kaburga (Şekil 2I) geri çekilmesi için sternum ile cerrahi iplik (5-0) yerleştirin.
  7. Dikkatle kavisli cerrahi makas kullanarak karaciğer ve diyafram (falsiform ligament) bağlayan bağ yanı sıra karaciğer ve gastrointestinal sistem kesti. Aorta (Şekil 2J) aşağı falsiform ligament kesin.

4. Numune Kur (10-15 dk)

  1. Büyük karaciğer lobunda kolay erişim için 45 ° 'lik bir açı ile sağ tarafta fare yerleştirin.
  2. Karın kapsayan, kaburga altında evreleme köprü eklekavite. Keskin kenarları (Şekil 2K) kapsayacak şekilde yapışkan bant kaplama standart bir kapak kayma kullanarak bir köprü imalatı.
  3. Sahnede büyük karaciğer lobu yerleştirin. Dikkatle çift bilyeli kalem probu veya karaciğer altında yastıklı spatula kayma ve ıslak pamuklu bir bez veya ıslak mendil kullanarak organın üst tutun. Slayt üzerine lob kaldırın ve nazik sürükle uygulayın. Lob bükülmüş ya da katlanabilir. Karaciğer (Şekil 2L) sadece nazik manipülasyon için ekstra bakım sağlayın.
  4. Örneğin, küçük bir kapak fişleri (20 mm x 20 mm), yanındaki karaciğer lobunun yaklaşık aynı yükseklikte yığınları kapak kayma desteklemek için yanal destek hisselerini, yerleştirin.
  5. Karaciğer lobda büyük kapak kayma (24 mm x 50 mm) yerleştirin. Bu kapak kayma olun mümkün (Şekil 2M) olarak yatay olarak aydınlatmaktadır.
    NOT: kapak kayma sıkarak olmadan doku ile temas halinde olmalıdır. Engelli kan akımı (beyaz doku) gözle görülür kontrol edin. Microcirc Eğerulation bozulur, daha kazık destek ekleyin.
  6. * Uzun süreli anestezi ve G-5 uygulama için yer iki bağımsız periton kateterler (Şekil 2N). Bir sonraki arka bacaklarda düşük karın yanal kateter takın.
    NOT: periton kateterler self-made esnek silikon tüp (Şekil 3) ile 27 G iğne bağlayarak olabilir.
  7. * Cilde 5-0 cerrahi iplik bir döngü ile sabitleşmek iğne yanlışlıkla değiştirmesini önlemek için.
  8. * Ben 1 katatere anestezi çözümü ile şırınga pompası takın, 0.2 ml / saat ayarlanmış akış hızı; 0.1 ml / saat kateter 2, G-5, şırınga pompası, sabit akış hızı ekleyin.

5. Fare İzleme

  1. * Yeri EKG ön içine elektrotlar ve arka ekstremite (Şekil 4A).
  2. * 2 seviye sensörü CO son tüp takın.
  3. (Şekil 4C ısı yastığı bağlı harici sıcaklık sensörü ekle).

6. gömülmesi ve Doku Sabitleme (5-10 dk)

  1. 3,% 1 X PBS içinde (ağırlık / hacim) agaroz 100 ml hazırlayın. Sıcaklık 5 ml'lik bir şırınga ve bir 18 G iğne (Şekil 5A) ile 41 ° C 'de iken karaciğer gömer.
  2. Lamel ve fare (Şekil 5B, C) ​​etrafında kalan agaroz dökün. Agaroz tamamen Jelatinize kadar bekleyin.
  3. Hazırlanan karaciğer lobu (Şekil 5D, E) taramak için yeterli bir viewfield büyük hazırlanması, Heidemann spatula ile fazla agaroz çıkarın.

7. Görüntüleme

  1. Mikroskop iklim odasına fare aktarın.
  2. 1x PBS 50-100 ml ekleyin (37 ° C ısıtılmış).
  3. Buharlaşma (Şekil 5F) önlemek için numune çanak örtün.
  4. * 0.5 hacmin% enhalasyon izofluran azaltın (hac / hac).
  5. * Izleme yazılımı EKG, kalp hızı ve ekspiratuar CO 2 kaydetmeye başlayın.
  6. Görüntüleme başlatın: la açmakser panjurlar, ilgi alanlarını belirlemek görünüm Z-yığınları için üst ve alt sınırını tanımlamak, ve zaman atlamalı kayıt başlar. Z-sürüklenme düzeltmek için gerekirse (Z-yığınlarının yeniden ayarlayın, örneğin. Sebebiyle kan basıncı ya da sıcaklık dalgalanması, Şekil (5G) değişikliklere.
    NOT: Hayvanların dolaşımı veya anestezi görüntüleme dönemi veya eğer tamamlanması kararsız hale geldikten sonra, (anestezi uyanış olmadan), boyunları kırılarak fareler kurban.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bizim Intravital TPLSM yaklaşımı doğrulamak için, biz intravital TPLSM görüntüleme CXCR6 GFP / + fareler tabi. Fareler, ya temel kontrol olarak tedavi edilmeden bırakıldı ve akut karaciğer hasarı 20 uyarılması için karbon tetraklorür, tek bir intraperitoneal enjeksiyon (CCl4) tabi tutuldu.

Nedeniyle yeşil floresan Video dizileri 2-5 saatlik bir süre boyunca alındı ​​ve hücreler, zaman içinde takip edildi. Genel hücresel hareketliliğini göstermek için, prosedür sırasında tespit edilen tüm parçaları üst üste görüntü (Şekil 6A) olarak çizildi. Bazal koşullar altında hücrelerin santral ven doğru karaciğer sinüsoidlerinden boyunca uzun mesafe göç gösterirken, 18 saat CCI 4 tedaviden sonra CXCR6 + / GFP hücreleri zaten kısmen bozulmuş hareket kalıplarını gösterdi. Bazı hızlı hareket eden hücreler hala karaciğer sinüsoidlerinden mevcut olmasına rağmen, birçok odak alanı hücreleri ile görünür olduğunuyaralanma bölgesinde hücreleri işe bir kemotaktik yanıtı gösteren, yerel tarama rastgele göç değişmişti. etkisi daha da hemen hemen hiç aktif göç CXCR6 + hücrelerinin hemen hemen tam bir yakalanmasını gösteren, 36 saat sonra, daha belirgindir. Bazal koşullar altında en göç hücreleri rastgele yön değişiklikleri ile değişken göç hızları varken, CCI 4 tedavi edilen hayvanlar, bazı serbestçe hareketli hücreler 18 saat değil 36 saat sonra sonra sinüzoidlerde devriye sadece yavaş yavaş yanı sıra tarama edildi hücreler gösterdi. Renk kodlu göç parça kullanarak, hücre hızı CCI 4 tedavinin etkisini değerlendirmek için doğrudan görüntülendi olabilir. 36 saat sonra hiç bir hareketli hücreler, herhangi bir tespit edilebilir iken, bozulmuş göç, 18 saat CCl4 sonra uzun mesafe miktarı da ortalama hat uzunluğu önemli ölçüde azaltılmış gibi parçaları gösteren, aynı zamanda normalize parça şeması (Şekil 6B) görülüyordu daha. W doğrultusundaBu bulgular i serbest damar devriye gezen bir hücrenin yeteneğini tarif hücre yer değiştirmesi, 36 saat hepatoselüler hasar (Şekil 6C) yerinde CCl4 tedaviden sonra bir hücre hapsini gösteren zamanla azalmıştır.

Daha ayrıntılı karaciğerde CXCR6 + / GFP hücrelerinin göç davranışlarını takip etmek, temsili bireysel hücrelerin göç hızı zamanla hareketlilik düzeylerini görselleştirmek için çizilmiştir. Biz ve diğerleri önce CXCR6 + / GFP hücrelerinin birkaç farklı hareket desenleri açıklanan: Aktif rastgele taramasını bir yapışma hücresel motilite ve zamansal sakin devletlerin aşamalarını gösteren, desen haddeleme ile; Aktif taranmasına yeteneğine hala ilgi alanı değil taranması hücrelerle hücresel işe yönettiği; bağışıklık hücre aktivasyonu 18,20 eşliğinde toplam hücresel tutuklama. Tedavi olmadan fareler ağırlıklı olan hücreler gösterirken serbestçe Motile olan hızları 15 mm / sn kadar, CCl4 ile tedavi edilen farelerde CXCR6 + / GFP hücreleri belirgin 36 saat (Şekil 7A) sonra hücre göçü hız ve kısmi tutuklama zaten sonra 18 saat ve tam göçmen tutuklama azaltılmış görüntülenen. Tek hücre analizi doğrultusunda, bir dizi içindeki tüm hücrelerin istatistiki verileri maksimum göç hızları da ortalama parça hızları (Şekil 7C) tarafından andıran edildi CCI 4 tedavisi (Şekil 7B), sonra genel göç hızı azalan ve takip saptandı (Şekil 7D), yaklaşım karaciğer hastalıklarına yakalanma hücre göçü ve konumlandırma farklılıkları tanımlamak için uygun olduğunu gösterdi.

Şekil 1,
Şekil 1:. Hazırlanması için kullanılan fare Trakeotomi (A) Cerrahi ekipmanlar. 1x standart pıtırtın forseps, 1x Semken forseps, 1x Dumont No.7 forseps, Graefe forseps (4 yönlü (künt)), çift bilyalı kalem probu Heidemann (örneğin, amalgam burnisher 3PL), 2x Blair Ekartörleri (düz / 1x kavisli tırtıklı 2x) spatula HD2, iğne tutucu (Mathieu veya Halsey), 1x küçük cerrahi makas (keskin / künt, 1xcurved, 1x düz), mikro-makas (örneğin, Vannas Bahar Makas), 1x küçük hayvan Cauter, pamuklu çubuk, göz koruyucu merhem, cerrahi iplik, n-Butil-2-Cyanoacrylatglue. (B) gözler göz koruyucu merhem kullanılarak korunur. (C) trakea hazırlanması için başlangıç ​​cilt kesim. Alt çene tükürük bezleri arasındaki bağ dokusu (D) sınıflandırılması. Trakea (E) Sergi. Trakea çevreleyen kas dokusu (F) sınıflandırılması. Tüpün tespiti için trakea altında cerrahi iplik (G) Yerleştirme. (H), trakeÜst kıkırdak halkaları arasında microscissors kullanarak al kesi. Trakea içine vantilasyon borusunun (I) 'e yerleştirilmesi. Kranial cerrahi iplik (J) Yerleştirme cilde tüp düzeltmek için. (K) tüp Çift tespit. (I) n-Butil-2-Cyanoacrylat kullanarak cerrahi kesi Sızdırmazlık. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2:. Laparotomi ve karaciğer hazırlanması (A) İlk cilt kesisi, kan damarları aşırı kanamayı önlemek için koterize edildi. Sternum altında periton (B) Açılış. Koter ünitesi kullanılarak periton kesim (C) Uzatma. Epigastrik damarların (D) Sızdırmazlık. ( g> E) kaburga altında periton kesi daha da uzatma. Agaroz sahne çanak içine hayvanın (F) Yerleştirme. Destek yığınlarının (F) Yerleştirme. Solunum tetikli sensörünün (G) yerleştirme. (H) solunum senkronize görüntüleme için tetikleyici eşiği Kur. (I) Sternum tespit cerrahi iplik kullanarak kaburga geri çekmek için. Falsiform ligament diyafram ve diseksiyonu safra kesesi (J) Ayırma. Kapak kayma evreleme (K) Yerleştirme. (L) sahnede karaciğer lobunun Yerleştirme. Karaciğer lobda lamel (M) Yerleştirme. (N) Yerleştirme uzun vadeli anestezi için ip kateterin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3 "src =" / files / ftp_upload / 52.607 / 52607fig3.jpg "/>
Şekil 3:. Esnek silikon tüp ile bağlantılı intraperitoneal kateter 27 G iğne.

Şekil 4,
Şekil 4: fare izlenmesi. (A) Yerleştirme EKG elektrotları (yeşil, kırmızı, mavi kablolar) olarak. Gösterildiği gibi EKG tespiti için iğneler deri altına yerleştirilir. EKG (kırmızı) (B) İzleme, uzun süreli ilerlemesini (solda) ve gerçek ölçüm (sağda) gösteren, ekspiratuar CO 2 (mavi) ve kalp hızı (kırmızı). (C) Sıcaklık ısı yastığı kontrolü için güç ünitesi kontrol. Sıcaklık 36 ° C'ye ayarlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Her zaman ">:" tutmak-together.within-sayfa = fo "ve_content Şekil 5,
Şekil 5: Karaciğer gömme ve görüntüleme. Karaciğer lobun (A) katıştırma. PBS içinde% 3 agaroz, bir 18G iğne ile 2 ml'lik bir şırınga kullanılarak kapak kayma altında 41 ° C de enjekte edilmektedir. (B), karaciğer lobu, tam hareket etkilerini en aza indirmek için agaroz gömülür. Dehidratasyonu önlemek için agaroz kalan periton (C) Sızdırmazlık. Tam jelatinleşme sonra görüş agaroz kaplama mikroskop alanının (D) Kaldırma. Viewfield (E) hazırlanması. Z-düzeyi ve ışık mikroskobu kullanarak örnek kan akımının değerlendirilmesi F Ayarı. (D), kapak çanak aşırı buharlaşmasının engellenmesi için. Kapak kurulumu göstermek için resimde kaldırdı. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.

Şekil 6,
Şekil 6:. CCI 4 enjeksiyondan sonra kronik karaciğer hasarına CXCR6 GFP / + hücrelerinin Takip Fareler ile ip enjekte edildi 0.6 ml / kg ayçiçeği yağı 18 saat veya görüntüleme önce 36 saat içinde çözünmüş CCl4. Tarif edildiği gibi Deney gününde, fareler intravital TPLSM tabi tutuldu. (A) Yine hücre izleme görüntüleri. Tüm zaman noktalarında şarkılar hücresel motilite ve deplasman göstermek için üst üste edildi. Görüntüler tek bir ışın Titan Saphire Lazer 840 nm ve bir TPLSM mikroskop kullanılarak alınmıştır. Alanlar tarama döngüsü başına yaklaşık 30 saniyelik bir örnekleme hızı ile ila 70um bir penetrasyon derinliği ile 3-5 Z-yığınları alarak taranan edildi. (:; Mor yavaş hareket veya sesil hücreler: hareketli hücreler açık mavi) Parçalar göç hızı göstermek için renk kodlu idi. Ölçek çubukları: 100 μM. (B) iz yönlülük ve parça uzunluğu (um) gösteren kökenlerine için normalize yolları XY-diyagramları. Onların kökenli hücrelerin (C) Toplam deplasman. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil 7:., Baz ve CCl4 ile tedavi edilmiş farelerde hücreler karaciğer devriye göç hızı bakımından analiz edilmiştir karaciğer dokusunda intravital TPLSM ardından CXCR6 GFP / + hücrelerinin göç istatistikleri. Tek tek hücrelerin (A) Örnek hızı zaman içinde takip etti. Hız, her bir zaman noktasında ölçülmüş ve her bir çerçeve için çizilmiştir. Hatlar tek tek hücrelerin temsil eder. Y eksenleri maksimum göç hızına göre ölçeklenir. (B) Sttüm hücrelerin A. Çerçeve belirli hızlarda atistical analizi gruplandırılmış ve bazal analiz ve CCI 4 fare tedavi edildi. (C) Ortalama parça hızı tüm parçaları gelen parça ve veri başına hesaplanmıştır analiz için gruplandırıldı. Her parçanın (D) Maksimum hız çizilen ve analiz edilmiştir. Bütün deneyler, 3 hayvanlık gruplar halinde yapıldı ve sonuçlar, iki bağımsız deneyin doğrulanmıştır. *** P <0.001 (eşleşmemiş Student t-testi, iki kuyruklu). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmanın amacı, karaciğer intravital TPLSM görüntüleme için yüksek ölçüde standardize edilmiş stabil ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmektir. Genel Intravital görüntüleme hedeflemesi ve geliştirme, homeostasis ve hastalığın farklı lökosit popülasyonlarının etkileşimi aşağıdaki gerçek hayat koşullarında hücresel davranış içine değerli anlayışlar verdi. Ancak, doğrudan diğer katı organlara kıyasla karaciğer yanı sıra yüksek kırılganlık aktarılır hangi nedeniyle solunum ve bağırsak peristaltik hareketi için karaciğer biraz zor anatomik pozisyon, istikrarlı uzun vadeli intravital görüntüleme için çeşitli zorluklar getirmiştir. Son yıllarda, farelerde birçok deneysel çalışmalar ikamet veya monositler / makrofajlar 30-32, nötrofiller 33 veya çeşitli lenfosit alt grupları 34,35 girmesini büyük katkılarıyla, yaralı karaciğer 28. bağışıklık hücre infiltrasyonu son derece dinamik doğasını ortaya koymuştur. Bununla birlikte, m,Bu verilerin ost uç noktası analizleri (örneğin, çok renkli hayvanları kurban ettikten sonra akış sitometrisi) elde edilmiştir. Şimdiye kadar sadece birkaç çalışma renkli intravital görüntüleme kullanılarak karaciğer iltihabı sırasında hücresel trafik dinamiklerini açıklayan bulunmamakta. Ters mikroskopları kullanarak nedeniyle cam 24 alt doku firma yapışma tespit ve karaciğer nemlendirici gerekliliğini circumvents. Birçok multiphoton mikroskoplar dik görüntüleme sistemleri olarak inşa edilmiş olduğundan Ancak, daha ayrıntılı hazırlık ve tespit yöntemleri görüntüleme süre için doku stabilize etmek gereklidir. Genellikle, özel yapılmış evreleme sistemleri, doku tespiti 6, 36,37 için tarif edilmiştir, ancak bunlarla bu doku üzerinde bile minimum basınç hastalıklı karaciğer 38 daha ağır etkileri olan sinüs kan akışını etkileyen beri, karaciğer mikrodolaşımı doğrulamak için çok önemlidir .

Bu nedenle, aşağıdaki noktaları reklam vardıin vivo TPLSM görüntüleme ile elde edilen sonuçları optimize etmek için bu yöntemin kurulum giymiş: mikrodolaşımın minimize örnek pertürbasyon ve bozulma ile hazırlık kalitesini arttırmak nedeniyle konuların ele alınmasına ve hayvan yaşam arttı; Yoğun bakım izleme ve örneğin anestezi, solunum ve dolaşım daha da geliştirilmiş hayvan hayatta istikrar ve minimize fizyolojik eserler, sonraki adaptasyon, kan pH dengesizlikler nedeniyle. Tetiklenen görüntüleme ile birlikte Kontrollü solunum solunum döngüleri ile mikroskop senkronizasyon nedeniyle hareket eserler ortadan kaldırmak için gerekli oldu. fizyolojik tuz konsantrasyonlarını içeren agaroz organın gömme yavaşça başka mekanik manipülasyon olmadan hazırlandıktan sonra organın sabitleşmek yararlı oldu ve ayrıca örnek dehidratasyon engelledi. Karaciğer mikroskopi için kullanılan çoğu protokolleri sta için sadece yetersiz yöntemler sağlar ble, uzun vadeli anestezi. Bununla birlikte, hayvan sağkalım izleme burada kombinasyon halinde verilen anestezi protokolü ile 8 saat için hayatta kalma ana kadar bunu garanti etmek için yeterli olan bir hale gelebilir. Alternatif metotlar, nötrofil istilası 39, genel olarak en fazla 3 saate kadar bir süre içinde, işlemleri görselleştirmek için uygun olan, ancak daha uzun bir görüntü için, monosit veya lenfosit istilası 22 ya da hücre proliferasyonu 6 gibi kalıcı işlemleri imkanı yoksundur. Akut ve kronik karaciğer iltihabı sırasında işe, sızma ve hücresel etkileşim dinamikleri anlamak karaciğer hastalığının gelişimi ve ilerlemesinde içine daha detaylı fikir sağlayabilir. İmmünopatolojiye bu gelişmiş anlayışı ile bu ilgi hedef hücrelerini ele ziyade, örneğin, seçici olmayan bağışıklık yaklaşımlar kullanılarak açısından çok daha rafine tedavileri tasarlamak mümkün olacaktır.

lökosit konumlandırma, transmigrasyonun ve etkileşimi ele almak için> "ove_content, yüksek kaliteli görüntüler karaciğer damar ve karaciğer dokusu 18,20,40 içindeki hücrelerin doğru 4D takibi için gereklidir.

Burada sağlayan yöntem hem kolay işlemek için yapım ve numune minimal pertürbasyon verimli maliyet, ortak laboratuvar reaktifler ve ekipman kullanılarak uygulanabilir. Mümkün olduğunca uzun için fare fizyolojik koşulları sağlamak için, oksijenasyon ve kan CO 2 düzeylerini kontrol etmek solunum hacmi ve sıklığı ince ayarlamak gerekir. Nedeniyle periton içine sıvıların sürekli infüzyon olmasına rağmen en azından sadece dolaşım stabilizasyonu ile ilgili kısmi denetime izin dolaşım, EKG ve kalp frekans ölçümleri stabilize etmek için geçici bir kaynağı vardır. Doğrudan kan basıncı kontrolü ve santral venöz sıvı uygulama uygulayarak bu muhtemel olduğunu hayati parametrikers stabilite ve hayatta kalma daha da ileri giden, daha da stabilize edilebilir.

Hatta son derece kontrollü şartlar altında, yaygın böyle asetaminofen bağlı karaciğer hasarı gibi farelerde kullanılan karaciğer hasarı modellerinde maruz kalmış hayvanların görüntüleme, CCI 4 kaynaklı karaciğer hasarı veya diyet kaynaklı yağlı karaciğer hastalığı zorlu kalır. Nedeniyle metabolik devlet kontrolünde karaciğer ve dolaşımda merkezi konumu temel fonksiyonu, karaciğer işlevi veya mikrosirkülasyon hayvanların doğrudan etkiler uzun süreli sağkalım, bu nedenle olasılığını sınırlayıcı değişiklikler ağır uzun TPLSM video dizileri elde etmek Şiddetli kanamalar veya tahrip mikrovasküler ile örneğin hasarlı organlar. Aynı zamanda, geniş bir nekroz modellerde olduğu gibi ciddi karaciğer değiştirilmiş mikroanatomisinin olarak, bu, hücre-hücre-etkileşimleri ve inflamatuar hücre agregatlarının yerel bölümlere ayrılmasını çalışma güçtür herhangi stan için(örneğin geleneksel mikroskopi veya imünofloresansta DAPI boyama hematoksilen-boyama gibi) anatomik yapılar için dardized "karşı-boyama" daha görüntüleme işlemi ile elde edilen verilerin Intravital TPLSM.The kalitesi için kullanılabilir hücre etiketleme yoğunluğuna bağlıdır ve mikroskopik kurulum.

Birkaç yaklaşımlar karaciğer GFP + hücreleri görselleştirmek için var. Çok düşük eşiğe en yüksek floresan 900 ve 920 nm eksitasyon dalga boyu arasındaki elde edilir. Karaciğer eşiğe neredeyse tamamen kaybı gibi Dextran'ın veya lektin gibi ek damar izci değilken, karaciğer içindeki hücrelerin konumlandırma soruşturma izin vermez. Bu nedenle, GFP sinyali ve çok parlak ayrıntılı ancak karaciğer eşiğe arasındaki en iyi oran veren, 840 nm'lik bir dalga boyunda bir görüntü göç lökositlerin verdi.

Birlikte ele alındığında, geçişsizBu çalışmada belirtilen cansız TPLSM görüntüleme sistemi karaciğere özgü İntra vital mikroskopik soru bir çok farklı çeşitte uygulanabilir. Bu yaklaşımla, böbrek, karaciğer, mesane, bağırsak veya pankreas gibi diğer katı organlarda TPLSM görüntüleme nedenle hücrelerin uzun süreli göç süreçleri araştırmak için son derece esnek bir yaklaşım sağlayarak, cerrahi işlemler ve doku evreleme sadece küçük değişikliklerle mümkündür vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25 ml Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2 ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50 mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0.5 ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117, (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10, (11), 955 (1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82, (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24, (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75, (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280, (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45, (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50, (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99, (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172, (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75, (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62, (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91, (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23, (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3, (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180, (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190, (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43, (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28, (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40, (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, (3), e1000805 (2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89, (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14, (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352, (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50, (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55, (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60, (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59, (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61, (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205, (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34, (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24, (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17, (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4, (3), e4693 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics