Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

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Immunology and Infection

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Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

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Abstract

Inflamación del hígado como respuesta a una lesión es un proceso altamente dinámico que implica la infiltración de distintos subtipos de leucocitos incluyendo monocitos, neutrófilos, subconjuntos de células T, células B, células asesinas naturales (NK) y las células NKT. Microscopía intravital del hígado para el seguimiento de la migración de células inmunes es particularmente difícil debido a los altos requisitos relativos a la preparación de muestras y fijación, la resolución óptica y la supervivencia de los animales a largo plazo. Sin embargo, la dinámica de los procesos inflamatorios, así como estudios de interacción celulares podrían proporcionar información crítica para comprender mejor la iniciación, progresión y regresión de la enfermedad inflamatoria del hígado. Por lo tanto, se estableció un método altamente sensible y fiable para estudiar la migración y célula-célula-interacciones de las diferentes células inmunes en el hígado del ratón durante períodos largos (alrededor de 6 hr) por intravital de dos fotones microscopía de escaneo láser (TPLSM) en combinación con cuidados intensivos monitoreo.

ent "> El método proporcionado incluye una preparación suave y una fijación estable del hígado con perturbación mínima del órgano; intravital de imágenes a largo plazo usando microscopía multifotónica multicolor con prácticamente ninguna photobleaching o efectos fototóxicos durante un período de tiempo de hasta 6 horas, lo que permite el seguimiento de subconjuntos de leucocitos específicos, y las condiciones de imagen estable debido a un seguimiento exhaustivo de los parámetros vitales del ratón y la estabilización de la circulación, la temperatura y el intercambio de gases.

Para investigar la migración de linfocitos en la inflamación del hígado CXCR6.gfp ronda en ratones fueron sometidos a formación de imágenes del hígado intravital en condiciones basales y después de daño hepático agudo y crónico inducida por la inyección intraperitoneal (s) de tetracloruro de carbono (CCl 4).

CXCR6 es un receptor de quimioquinas expresado en los linfocitos, principalmente en células T asesinas naturales (NKT) -, asesinas naturales (NK) - y subconjuntos de linfocitos T, como las células T CD4, sino también associ mucosasATED invariante células (MAIT) T 1. Siguiendo el patrón migratorio y el posicionamiento de las células inmunes CXCR6.gfp + permitido una visión detallada de su comportamiento alterado en la lesión hepática y por lo tanto su potencial implicación en la progresión de la enfermedad.

Introduction

La visualización de las células y las funciones celulares en órganos enteros o incluso organismos enteros ha sido de gran interés durante más de 50 años, incluyendo prácticamente todas las partes del cuerpo 2. Por lo tanto, algunos de los primeros estudios que ya emplean intravital de imágenes del hígado 3,4. Sin embargo, existen varias limitaciones al día en cuanto a imágenes de alta resolución estable a largo plazo del tejido hepático.

Debido a la posición anatómica del hígado en estrecho contacto con el diafragma y el tracto gastrointestinal 5, el problema más común para formación de imágenes intravital microscópico es el movimiento debido a la respiración y, en menor medida, peristáltica del tracto intestinal 6. En comparación con otros órganos sólidos, la cirugía del hígado es particularmente difícil. Debido a la estructura microvascular densa, la manipulación quirúrgica puede conducir a lesiones hemorrágicas masivas, alteración de la microcirculación 7 y también la activación de residente immune células tales como las células de Kupffer 8. Por lo tanto, la fijación mecánica del tejido que se publica en otra parte 6,9 es probable que interfiera con la formación de imágenes de microscopía intravital.

En un hígado sano, el 10-15% del volumen total de sangre reside dentro de la vasculatura del hígado, y el órgano recibe alrededor de 25% del gasto cardíaco en general 10, haciendo que el órgano altamente susceptibles a cambios en la circulación (por ejemplo, fluctuaciones de la presión arterial ). Por lo tanto, las interrupciones en el flujo sanguíneo hepático debido a, por ejemplo, la tensión de cizallamiento, el desplazamiento, la lesión por la manipulación excesiva de los tejidos o la circulación centralizada dará lugar a alteraciones artificiales en el comportamiento migratorio de leucocitos, alteración de la oxigenación del hígado y, por tanto, un mayor daño del hígado, que afecta a la respuesta inmune del hígado, así como la preservación de órganos y el tiempo de vida general del animal.

Los primeros estudios microscópicos se basaron en mi epifluorescencia intravitalesmicroscopia, pero varias limitaciones técnicas tales como blanqueo foto y poca profundidad de penetración limitan el uso de esta técnica para obtener imágenes del hígado a largo plazo 4,11,12. Con el desarrollo de la microscopía multifotónica en la década de 1990, las limitaciones de blanqueo foto o profundidad de penetración se resolvieron principalmente, ya que este nuevo método es técnicamente capaz de realizar estudios de imagen en prácticamente todos los órganos en virtud de situaciones de la vida real 13-15. Sin embargo, los principales desafíos pendientes con respecto a las imágenes del hígado fueron: los movimientos de la respiración, la autofluorescencia del tejido hepático, que aseguran el flujo de sangre sin alteraciones en los sinusoides hepáticos, y proyección de imagen especialmente estables durante periodos de varias horas 16 más.

Aunque varios estudios abordaron la función y la migración de diversos leucocitos en el hígado 17, por ejemplo, la NKT-18-20 células, células T 21,22, los macrófagos del hígado 23,24 o neutrófilos 25, a largo plazo multifotónica mimágenes icroscopy aún no se había establecido con éxito, una tarea aún más difícil en los animales con enfermedad hepática aguda o crónica debido a los daños existentes y, por tanto, una mayor susceptibilidad a daños mayores 26. Sin embargo, el monitoreo del comportamiento migratorio y la función celular de los leucocitos en el hígado en tiempo real permite a los nuevos conocimientos en su papel particular en la homeostasis del hígado y la enfermedad 27.

El CXCR6 receptor de quimioquinas se expresa en varios subgrupos de linfocitos, incluyendo las células asesinas naturales (NK), las células NKT y algunas poblaciones de células T 18,28. Estudios previos en ratones han indicado que CXCR6 y su CXCL16 ligando afín pueden controlar el patrullaje de las células NKT en sinusoides hepáticos durante la homeostasis. En consecuencia, el uso de ratones CXCR6.gfp (que lleva un knock-in de la proteína fluorescente verde [GFP] en el locus CXCR6) se ha descrito para investigar la migración de linfocitos en diversos órganos tales como el cerebro 29y también el hígado 18,20, mostrando aumento de la infiltración de células CXCR6.gfp sobre la inflamación.

Con el método proporcionado en este estudio era posible seguir estos procesos durante un largo período de tiempo en condiciones estabilizadas. El procedimiento basado multifotónica intravital permitió imagen que era altamente reproducible con perturbación mínima del animal y el órgano; optimizado para la supervivencia de los animales a largo plazo por una extensa evaluación que sigue un estricto control de la respiración y la circulación; y altamente flexible y fácil de adoptar también a otros órganos parenquimatosos como el riñón o el bazo.

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Protocol

NOTA: Los experimentos se realizaron de acuerdo con la legislación alemana sobre los estudios en animales después de la 'Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio "(publicación del NIH, 8ª edición, 2011) y la Directiva 2010/63 / UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (Diario Oficial de la Unión Europea, 2010). Permiso oficial fue concedida desde el cuidado de los animales y la oficina gubernamental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemania).

NOTA: Los pasos que pueden ser omitidos para la imagen a corto plazo (por ejemplo, tiros rápidos, pilas 3-D o también corta duración time-lapse microscopía) están marcados con asteriscos (*) para reducir el tiempo de preparación y simplificar el protocolo quirúrgico. Imaging también se puede realizar sin un amplio control de supervisión y la circulación si es necesario, sin embargo, el tiempo de supervivencia se redujo notablemente.

1. Configuración Microscopio y Pre-cirugía Preparación (5.10 millasn)

  1. Sistema Encienda (microscopio, Laboratorio de poder, láser, almohadilla eléctrica, cámara climática, web cam, dispositivo de bomba de jeringa, respirador).
  2. Conecte oferta de O 2 a isoflurano Vapor y establecer el nivel de isoflurano al 1,5% en volumen (v / v), se conecta a un respirador de pequeños animales.
    1. Para imágenes corto plazo, mantener la anestesia utilizando isoflurano sólo después de la inducción de la anestesia inicial ip (véase el paso 2.2). A continuación, utilice 2 Vol% (v / v) isoflurano, y mantener el tiempo de formación de imágenes por debajo de 2 horas para garantizar la microcirculación hepática estable.
  3. Establecer la respiración a 120-140 ciclos respiratorios / min con un volumen de 150-200 l.
  4. Configure etapa agarosa ratón. Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarosa, vertiéndola en un plato (aproximadamente 10 cm x 15 cm base) en un ángulo de 40 °.
  5. Establecer área de trabajo quirúrgico recoger la instrumentación requerida. Para prevenir la infección microbiana, desinfectar instrumentos utilizando una solución al 1% de Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% w / v, formaldehído durante 5 min antes del experimento (Figura 1A).
  6. Obtener restantes componentes: desinfectante de la piel (por ejemplo, solución de povidona yodada al 10%), la etapa hepática (pilas y puente), solución de agarosa (3% (w / v) en PBS), bomba de jeringa con 5% (w / v) de solución de glucosa (G-5), la bomba de jeringa con solución anestésica I (ketamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, Fentanilo 5 g / ml), hisopos de algodón, n-butil-2-Cyanoacrylat, y 1x PBS. Ponga plato etapa de agarosa en la cámara de incubación para el precalentamiento.

2. La traqueotomía (10-15 min)

  1. Utilice C57BL / 6 ratones de la casa en reproductoras de 25-28 g. La Casa de los ratones bajo condiciones específicas libres de patógenos, de conformidad con las directrices de FELASA, en un ambiente de temperatura y humedad controladas con 12 horas de luz / 12 h oscuridad ciclo. Permitir animales libre acceso a la dieta estándar de ratones (Sniff Dieta de roedores estándar) y agua ad libitum.
  2. Anestesiar el ratón por initial intraperitoneal (ip) la inyección de 250 l de solución de anestésico ketamina II (0,1 mg / ml, xilazina 1 mg / ml, buprenorfina 10 g / ml).
    1. * Para el mantenimiento durante intravital de imágenes, administrar continuamente solución anestésica I por inyección ip continua (ketamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, Fentanilo 5 g / ml) utilizando un dispositivo de bomba de jeringa con un caudal de 0,2 ml / hr en combinación con inhalación de isoflurano 0,5 Vol% (v / v).
    2. Compruebe reflejos después de 5 minutos (por ejemplo, pata pellizco con fórceps), desinfectar la piel para traqueotomía, iniciar la preparación en caso ratón está en estado de anestesia quirúrgica tolerante.
    3. Aplicar crema de protección para los ojos (por ejemplo, Dexpantenol 50 mg / g) para evitar que la córnea se seque (Figura 1B).
  3. Fijar ratón en la mesa de preparación exponer parte ventral con cinta adhesiva para las extremidades; estirar demasiado suavemente cuello, fijar en esta posición, por ejemplo., mediante el uso de una banda de goma enganchado to los incisivos.
    1. Desinfectar la piel y de la piel usando una solución de yodo povidona, mediante la aplicación de desinfectante con un hisopo de algodón.
  4. Realizar corte inicial en la piel (0,5-1 cm de longitud) directamente debajo de la barbilla (Figura 1C)
    1. Diseccionar cuidadosamente tejido conectivo entre las glándulas salivales (Figura 1D).
    2. Corte con cuidado abierto musculoso tubo que rodea la tráquea (Figura 1 E, F).
  5. Coloque hilo quirúrgico debajo de la tráquea para más tarde fijación tubo de ventilación (Figura 1G).
    1. Tráquea abierta con micro-tijeras entre anillos cartilaginosos que realizan una incisión en forma de T (Figura 1H)
  6. Coloque el tubo de ventilación en la tráquea a través de la incisión (~ 0,5 cm). Para empujar el tubo hacia adelante, agarrar extremo caudal con pequeñas pinzas anatómicas y suavemente avanzar el tubo en la tráquea (Figura 1I)
  7. Fijar tubo con hilo quirúrgico (por ejemplo, (Figura 1J, K).
  8. Seal corte con pegamento de tejido (por ejemplo, n-butil-2-Cyanoacrylat) (Figura 1L).
  9. Fijar el tubo en la cabeza con cinta adhesiva.

3. laparotomía (15-20 min)

  1. Coloque el ratón en el cojín de calefacción para evitar la hipotermia. Afeitado abdomen, retire con cuidado el pelo de la piel. Desinfectar la piel afeitada y piel mediante el uso de una solución de yodo povidona.
  2. Realizar una pequeña piel cortada debajo del esternón utilizando tijeras quirúrgicas (Figura 2A). Extienda el corte lateralmente debajo de las costillas a ambos lados, la cauterización de todos los vasos sanguíneos visibles para prevenir el sangrado.
  3. Realizar con cuidado un pequeño corte en la línea alba debajo del esternón, abre el peritoneo (Figura 2B). Extienda el corte a ambos lados con cauterización para prevenir el sangrado (Figura 2 C, D).
  4. Coloque el ratón en el plato etapa de agarosa (Figura 2E). Coloque pilas de altura adecuada en ambos lados del ratón (generalmente 12-14 cubreobjetos) (Figura 2F).
  5. Coloque sensor de disparo respiratoria debajo espalda superior para sincronizar el microscopio con la respiración. Activar unidad de disparo (Figura 2G).
  6. Coloque hilo quirúrgico (5-0) a través del esternón para retraer costillas (Figura 2I).
  7. Cortar cuidadosamente ligamento que conecta el hígado y el diafragma (ligamento falciforme), así como el tracto gastrointestinal y el hígado utilizando tijeras quirúrgicas curvas. Cortar el ligamento falciforme hasta la aorta (Figura 2J).

4. Configuración de la muestra (10-15 min)

  1. Coloque ratón en el lado derecho con un ángulo de 45 ° para facilitar el acceso a lóbulo hepático grande.
  2. Añadir puente puesta en escena debajo de las costillas, que cubre el abdomencavidad. Fabricación de un puente mediante el uso de una hoja de cubierta estándar con recubrimiento de cinta adhesiva para cubrir los bordes afilados (Figura 2K).
  3. Coloque lóbulo hepático grande en el escenario. Deslizar con cuidado la sonda lápiz doble bola o una espátula acolchado debajo del hígado y mantenga la parte superior del órgano con un bastoncillo de algodón húmedo o toallitas húmedas. Levante lóbulo sobre el portaobjetos y aplique fricción suave. Lóbulo se puede doblar o plegar. Proporcionar un cuidado especial para sólo una manipulación suave del hígado (Figura 2 l).
  4. Coloca estacas lateral de apoyo, por ejemplo, pilas de pequeñas cubreobjetos (20 mm x 20 mm), de aproximadamente la misma altura del lóbulo hepático junto a él para apoyar la hoja de la cubierta.
  5. Coloque gran hoja de la cubierta (24 mm x 50 mm) en el lóbulo hepático. Asegúrese de que cubreobjetos se orienta más horizontal posible (Figura 2 M).
    NOTA: La hoja de la cubierta debe estar en contacto con el tejido sin apretar. Compruebe si hay signos visibles de deterioro del flujo sanguíneo (tejido blanco). Si microcirculación se interrumpe, agregar más el apoyo a las estacas.
  6. * Coloque dos catéteres intraperitoneal independientes (Figura 2N) para la anestesia de largo plazo y el G-5 aplicación. Instale catéteres lateralmente en la parte inferior del abdomen junto a las patas traseras.
    NOTA: Los catéteres intraperitoneal puede ser hecho a sí mismo mediante la conexión de 27 agujas G con tubo de silicona flexible (Figura 3).
  7. * Aguja Fixate con un bucle de hilo quirúrgico 5-0 a la piel para evitar el desplazamiento accidental.
  8. * Adjuntar bomba de jeringa con solución anestesia I catéter 1, ajuste el caudal de 0,2 ml / h; adjuntar bomba de jeringa con G-5 a 2 de catéter, la tasa de flujo se establece en 0,1 ml / hr.

5. Monitoreo Ratón

  1. * Electrodos de ECG Place en la parte delantera y las extremidades traseras (Figura 4A).
  2. * Fije el tubo de caducidad a CO 2 sensor de nivel.
  3. Añadir sensor de temperatura externo conectado a la almohadilla de calor (Figura 4C).

6. Inclusión y fijación tisular (5-10 min)

  1. Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarosa en 1X PBS. Incrustar hígado cuando la temperatura es a 41 ° C usando una jeringa de 5 ml y una aguja de 18 G (Figura 5A).
  2. Verter restante de agarosa en cubreobjetos y alrededor del ratón (Figura 5B, C). Espere hasta agarosa está totalmente gelatinizado.
  3. Retire el exceso de agarosa utilizando la espátula Heidemann, preparar una lo suficientemente grande viewfield para escanear el lóbulo hepático preparado (Figura 5D, E).

7. Imaging

  1. Transferir el ratón en cámara climática microscopio.
  2. Añadir 50-100 ml de PBS 1x (precalentado en 37 ° C).
  3. Cubrir el plato de la muestra para evitar la evaporación (Figura 5F).
  4. * Disminuir isoflurano por inhalación a 0,5 Vol% (v / v).
  5. * Iniciar el software de control, registro ECG, frecuencia cardiaca y CO 2 espiratorio.
  6. Comience imagen: abrir lapersianas SER, identificar campos de vista de su interés, definir límites superior e inferior para Z-pilas y comenzar la grabación de lapso de tiempo. Reajuste Z-pilas si es necesario para corregir la deriva de Z (por ejemplo., Debido a cambios en la presión arterial o fluctuación de la temperatura, la Figura (5G).
    NOTA: Después de la terminación del período de formación de imágenes o si la circulación o anestesia de los animales se vuelve inestable, sacrificar los ratones por dislocación cervical (sin el despertar de la anestesia).

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Representative Results

Para validar nuestro enfoque TPLSM intravital, sometimos GFP / + ratones CXCR6 a imágenes TPLSM intravital. Los ratones se dejaron sin tratar como controles de línea de base o sometidos a una única inyección intraperitoneal de tetracloruro de carbono (CCl 4) para inducir daño hepático agudo 20.

Las secuencias de vídeo fueron tomadas durante un período de tiempo de 2-5 horas, y las células fueron rastreadas con el tiempo debido a su fluorescencia verde. Para mostrar la motilidad celular en general, todas las pistas que fueron detectados durante el procedimiento se representaron como una imagen superpuesta (Figura 6A). Mientras que las células en condiciones basales mostraron migración de larga distancia a lo largo de los sinusoides hepáticos hacia la vena central, 18 horas después de la CCL 4 tratamiento las células + / GFP CXCR6 mostraron patrones de movimiento ya parcialmente deteriorados. Aunque algunas células de movimiento rápido todavía estaban presentes en los sinusoides hepáticos, varias áreas focales fueron visibles con células quehabía cambiado de migración al azar de digitalización local, lo que indica una respuesta quimiotáctica el reclutamiento de las células a la zona de la lesión. El efecto fue aún más pronunciado después de 36 horas, mostrando una detención casi completa de células CXCR6 + prácticamente sin migración activa. Mientras que en condiciones basales mayoría de las células migratorias tenían velocidades de migración variables con cambios de dirección al azar, CCl 4 animales tratados mostraron células que estaban subiendo muy lentamente, así como algunas células libremente móviles patrullando las sinusoides después de 18 horas pero no después de 36 horas. El uso de pistas de migración con código de color, la velocidad de células puede ser visualizado directamente para evaluar el efecto del tratamiento CCl 4. La migración alterada también fue visible en el diagrama de la pista normalizada (Figura 6B), mostrando que 18 horas después de CCl 4 la cantidad de pistas de larga distancia, así como la longitud media de la pista se redujo notablemente, mientras que después de 36 hr no hay células móviles fueron detectables cualquier más. En línea wITH estos hallazgos, el desplazamiento celular, que describe la capacidad de una célula para patrullar libremente la vasculatura, disminuyó con el tiempo, indicando un atrapamiento de las células 36 horas después de la CCL 4 tratamiento en el sitio de daño hepatocelular (Figura 6C).

Para seguir el comportamiento migratorio de las células CXCR6 + / GFP en el hígado en más detalle, la velocidad de migración de las células individuales representativos se representó para visualizar su nivel de la motilidad en el tiempo. Nosotros y otros descrito previamente varios patrones distintos de movimiento de las células + / GFP CXCR6: rastreo aleatorio activa con un patrón de fricción de rodadura, que muestra las fases de la motilidad celular y estados de reposo temporal; dirigido el reclutamiento celular con células de escaneo un área de interés, pero todavía capaz de rastreo activo; arresto celular total acompañada por la activación de células inmunes 18,20. Mientras que los ratones sin tratamiento mostraron principalmente las células que eran libremente motile con velocidades de hasta 15 m / seg, células CXCR6 + / GFP en ratones tratados con CCl4 mostraron una reducción notable velocidad de migración celular y la detención parcial ya después de 18 horas y la detención migratoria completa después de 36 horas (Figura 7A). De acuerdo con el análisis de células individuales, los datos estadísticos de todas las células dentro de una secuencia revelaron disminuir la velocidad de migración global después de la CCL 4 tratamiento (Figura 7B), que también se asemejaba por velocidades medias de pista (Figura 7C) y realizar un seguimiento de las velocidades máximas de migración (Figura 7D), lo que demuestra que el enfoque era adecuado para describir las diferencias en la migración celular y posicionamiento en el desarrollo de la enfermedad hepática.

Figura 1
Figura 1:. Traqueotomía del ratón (A) Equipo quirúrgico utilizado para la preparación. Golpeteo 1x estándarn fórceps, pinzas, fórceps Semken 1x 1x Dumont No.7, fórceps Graefe (serrado, 2x recta / 1x curvas), retractores 2x Blair (4 puntas (romo)), sonda lápiz de doble bola (por ejemplo, Amalgama bruñidor 3PL), Heidemann espátula HD2, soporte de la aguja (Mathieu o Halsey), pequeñas tijeras quirúrgicas 1x (aguda / roma, 1xcurved, 1x rectas), micro-tijeras (por ejemplo, Vannas Spring Tijeras), 1x pequeña Cauter animal, hisopos de algodón, salve protección para los ojos, cirugía hilo, n-butil-2-Cyanoacrylatglue. (B) los ojos se protegen usando un ungüento de protección ocular. (C) Corte de piel inicial para la preparación de la tráquea. (D) La disección de tejido conectivo entre las glándulas salivales submaxilares. (E) Exposición de la tráquea. (F) La disección de los tejidos musculares que rodean la tráquea. (G) La colocación del hilo quirúrgico debajo de la tráquea para la fijación del tubo. (H) Tracheal incisión utilizando microtijeras entre anillos de cartílago superiores. (I) La inserción de tubos de ventilación en la tráquea. (J) La colocación de hilo quirúrgico craneal para fijar el tubo a la piel. (K) Doble fijación del tubo. (I) Sellado incisión quirúrgica utilizando n-butil-2-Cyanoacrylat. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Laparotomía y el hígado de preparación (A) de la incisión inicial de la piel, los vasos sanguíneos se cauteriza para prevenir el sangrado excesivo. (B) Apertura del peritoneo por debajo del esternón. (C) Extensión del corte peritoneal mediante unidad de cauterización. (D) El sellado de los vasos epigástricos. ( g> E) Es necesaria una ampliación de la incisión peritoneal por debajo de las costillas. (F) La colocación del animal en el plato etapa de agarosa. (F) La colocación de las pilas de apoyo. (G) La colocación del sensor de disparo respiratorio. (H) Ajuste del umbral de disparo para imágenes respiración sincronizada. (I) la fijación de esternón se retraiga costillas utilizando hilo quirúrgico. (J) Desconexión de la vesícula biliar desde el diafragma y la disección del ligamento falciforme. (K) La colocación de puesta en escena hoja de la cubierta. (L) Colocación de lóbulo hepático en el escenario. (M) La colocación de cubreobjetos en lóbulo hepático. (N) La colocación de catéter ip para la anestesia a largo plazo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3:. Catéter intraperitoneal 27 agujas G conectados con tubos de silicona flexible.

Figura 4
Figura 4: Monitoreo del ratón. (A) Colocación de los electrodos de ECG (verdes, azules, cables rojos). Agujas para detección ECG se colocan por vía subcutánea como se muestra. (B) Monitoreo de ECG (rojo), espiración de CO 2 (azul) y la frecuencia cardíaca (rojo) que muestra la progresión a largo plazo (izquierda) y la medida real (a la derecha). (C) de temperatura controlada unidad de potencia para el control de la almohadilla de calor. La temperatura se ajusta a 36 ° C. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 5
Figura 5: incrustación de hígado y de imagen. (A) incorporación de lóbulo hepático. 3% de agarosa en PBS se inyecta en 41 ° C por debajo de la hoja de la cubierta usando una jeringa de 2 ml con una aguja de 18G. (B) lóbulo del hígado está plenamente integrada en agarosa para minimizar los artefactos de movimiento. (C) El sellado de peritoneo con el resto de agarosa para prevenir la deshidratación. (D) La eliminación de agarosa campo microscópico cubierta de vista después de la plena gelatinización. (E) Preparación de viewfield. Ajuste F de nivel Z y evaluación de la muestra el flujo de sangre usando microscopía de luz. (D) plato de la cubierta para evitar la evaporación excesiva. Cubierta se levanta en la imagen para mostrar la configuración. Por favor, haga clic aquí para ver una mayorversión de esta figura.

Figura 6
Figura 6:. Seguimiento de GFP / + células CXCR6 en daño hepático crónico después de la CCL 4 inyección los ratones fueron inyectados ip con 0,6 ml / kg CCl4 disuelto en aceite de girasol 18 horas o 36 horas antes de exponer. En el día del experimento, los ratones fueron sometidos a TPLSM intravital como se ha descrito. (A) Las imágenes fijas de seguimiento de la célula. Las pistas de todos los puntos de tiempo se superponen para mostrar la motilidad celular y el desplazamiento. Las imágenes fueron tomadas con un solo haz Titan Saphire láser a 840 nm y un microscopio TPLSM. Áreas fueron escaneados tomando 3-5 Z-pilas con una profundidad de penetración de 70μm con una frecuencia de muestreo de aproximadamente 30 segundos por ciclo. Las pistas fueron codificados por colores para mostrar la velocidad de migración (azul claro: movimiento lento o células sésiles; púrpura: células móviles). Las barras de escala: 100 μ; M. XY-diagramas de rutas normalizadas por su origen mostrando pista direccionalidad y longitud de la pista (m) (B). (C) el desplazamiento total de las células de su origen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7: Estadísticas de migración de células GFP CXCR6 / + seguido de TPLSM intravital en el tejido hepático en la línea de base y la CCL 4 ratones tratados células fueron analizadas por su velocidad de migración patrullar el hígado.. (A) Velocidad de Representante de células individuales siguió con el tiempo. Velocidad se midió en cada punto de tiempo y se representó para cada fotograma individual. Las líneas representan las células individuales. Ejes Y se ajustan en función de la velocidad máxima de la migración. (B) Stanálisis atistical de A. Marco velocidades específicas de todas las células se agruparon y se analizaron en la línea de base y la CCL 4 ratones tratados. (C) La velocidad media se calcula pista por pista y los datos de todas las pistas fueron agrupados para su análisis. (D) Velocidad máxima de cada pista se trazó y analizada. Todos los experimentos se realizaron en grupos de 3 animales y los resultados se confirmaron en dos experimentos independientes. *** P <0,001 (dos colas t de Student no pareada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El objetivo de nuestro estudio fue desarrollar un método altamente estandarizada, estable y reproducible para la imagen TPLSM intravital del hígado. Intravital de imágenes en general ha dado información valiosa sobre el comportamiento celular en condiciones reales siguientes vivienda y la interacción de las diferentes poblaciones de leucocitos en el desarrollo, la homeostasis y la enfermedad. Sin embargo, la posición anatómica algo difícil del hígado, debido a que las vías respiratorias y el movimiento intestinal peristáltica se transmiten directamente al hígado, así como su alta fragilidad en comparación con otros órganos sólidos impuso varios desafíos para la formación de imágenes intravital estable a largo plazo. En los últimos años, muchos estudios experimentales en ratones han revelado la naturaleza altamente dinámica de infiltración de células inmunes en el hígado lesionado de 28 años, con importantes contribuciones de residente o la infiltración de monocitos / macrófagos, neutrófilos 30-32 33 o varios subgrupos de linfocitos 34,35. Sin embargo, ma mayoría de estos datos se obtuvieron a partir de análisis de punto final (por ejemplo, multicolor citometría de flujo después de sacrificar a los animales). Hasta ahora sólo existen pocos estudios que describe la dinámica de tráfico celular durante la inflamación del hígado utilizando imágenes intravital multicolor. Usando microscopios invertidos elude la necesidad de fijación e hidratación del hígado debido a la firme adhesión de los tejidos a la copa inferior 24. Sin embargo, ya que muchos microscopios multifotónica se construyen como sistemas de imagen en posición vertical, se necesitan métodos de preparación y fijación más elaborados para estabilizar el tejido para el momento de la formación de imágenes. Comúnmente, los sistemas de estadificación por encargo se han descrito para la fijación del tejido 6, 36,37, sin embargo, con estos es crucial para validar la microcirculación hígado, ya que la presión incluso mínima en el tejido afecta el flujo sanguíneo sinusoidal con efectos aún más graves en hígado enfermo 38 .

Por lo tanto, los siguientes puntos eran advestido con la configuración de este método para optimizar los resultados obtenidos por en vivo de imágenes TPLSM: Mejorar la calidad de la preparación por minimizar la perturbación de la muestra y la alteración de la microcirculación debido al manejo de temas y una mayor supervivencia de los animales; monitoreo de cuidados intensivos y la posterior adaptación de la anestesia, la respiración y la estabilización de la circulación mejorado aún más supervivencia de los animales y los artefactos fisiológicos minimizadas, por ejemplo, causados ​​por desequilibrios en el pH de la sangre. Respiración controlada en combinación con imágenes disparada era esencial para eliminar los artefactos de movimiento debido a la sincronización del microscopio con los ciclos respiratorios. La incrustación del órgano en agarosa que contienen concentraciones fisiológicas de sal era beneficioso para fijar suavemente el órgano después de su preparación sin ningún tipo de manipulación mecánica más allá y también impide la deshidratación de la muestra. La mayoría de los protocolos utilizados para la microscopía de hígado proporcionan métodos sólo son insuficientes para sta ble, la anestesia largo plazo. Sin embargo, la supervivencia de los animales se podría mejorar significativamente con el protocolo de anestesia proporcionado aquí, y en combinación con el control fue suficiente para garantizar la supervivencia de hasta 8 hr. Los métodos alternativos son generalmente adecuados para visualizar procesos dentro de un período de tiempo de hasta 3 horas, tales como la invasión de neutrófilos 39, pero carecen de la posibilidad de imagen ya procesos duraderos tales como monocitos o linfocitos invasión 22 o incluso la proliferación celular 6. La comprensión de la dinámica de la contratación, la infiltración y la interacción celular durante la inflamación hepática aguda y crónica puede dar una idea más detallada en el desarrollo y progresión de la enfermedad hepática. Mediante el uso de esta mayor comprensión de la inmunopatología será posible diseñar terapias mucho más refinado en términos de abordar las células diana de interés en lugar de utilizar enfoques inmunosupresores por ejemplo, no selectivos.

ove_content "> Para abordar el posicionamiento, la transmigración y la interacción de los leucocitos, se necesitan imágenes de alta calidad para el seguimiento 4D precisa de las células dentro de la vasculatura del hígado y el hígado tejido 18,20,40.

El método que ofrecemos aquí se puede aplicar usando reactivos de laboratorio comunes y equipo, por lo que es a la vez fácil de manejar y rentable con perturbación mínima de la muestra. Para mantener las condiciones fisiológicas del ratón durante tanto tiempo como sea posible, es necesario un ajuste preciso del volumen respiratorio y la frecuencia para controlar la oxigenación de la sangre y los niveles de CO2. Aunque debido a la infusión continua de líquidos en el peritoneo hay al menos un suministro provisional para estabilizar las mediciones de circulación, ECG y la frecuencia cardíaca sólo permiten un control parcial con respecto a la estabilización de la circulación. Mediante la implementación de control de la presión arterial directa y de aplicación de líquido venoso central es probable que el PARAMET vitalesERS se pueden estabilizar aún más, dando lugar a una mejora adicional de la estabilidad y la supervivencia.

Incluso bajo condiciones muy controladas, las imágenes de los animales que han sido sometidos a los modelos de daño hepático comúnmente utilizados en ratones como daño hepático inducido por acetaminofeno, CCl 4 daño hepático inducido o enfermedad de hígado graso inducido por la dieta sigue siendo un reto. Debido a la función esencial del hígado en el control del estado metabólico y su posición central en la circulación, las alteraciones de la funcionalidad hepática o la microcirculación directamente impactos supervivencia a largo plazo de los animales, por lo tanto, limitar la posibilidad de obtener largas TPLSM video-secuencias de fuertemente órganos dañados, por ejemplo, con hemorragias graves o microvasculatura destruido. También, en microanatomía hígado severamente alterado como en modelos con extensas necrosis, sigue siendo difícil de estudiar célula-célula-interacciones y compartimentación locales de agregados de células inflamatorias, debido a que no stanestandarizadas "contra-tinción" para las estructuras anatómicas (como hematoxilina-tinción en microscopía convencional o DAPI en inmunofluorescencia) está disponible para intravital calidad TPLSM.The de los datos obtenidos por el proceso de formación de imágenes depende de la intensidad de etiquetado de las células y la configuración microscópica.

Existen varios enfoques para visualizar las células GFP + en el hígado. La fluorescencia más alto con muy baja fluorescencia de fondo se obtiene entre 900 y 920 nm de longitud de onda de excitación. La pérdida casi completa de la fluorescencia de fondo de hígado no permite investigar el posicionamiento de las células en el hígado, cuando no se utiliza rastreadores de los vasos adicionales, tales como dextrano o lectina. Por lo tanto, decidimos imagen los leucocitos migran a una longitud de onda de 840 nm, dando la mejor relación entre la señal de las buenas prácticas agrarias y el fondo hígado detallada pero no demasiado brillante fluorescencia.

En conjunto, la intrsistema de imágenes avital TPLSM introducido en este estudio se puede aplicar a una amplia variedad de preguntas microscopía intravital específicos del hígado. Con este enfoque, TPLSM de formación de imágenes en otros órganos sólidos tales como el riñón, el hígado, la vejiga, el intestino o el páncreas es factible con sólo pequeñas modificaciones de los procedimientos quirúrgicos y puesta en escena de tejido, proporcionando por lo tanto un enfoque altamente flexible para investigar los procesos migratorios a largo plazo de células en vivo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25 ml Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2 ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50 mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0.5 ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

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References

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