3D organotypiske Co-kultur Modell Støtte Medullary Thymus- epitelcelleproliferasjon, Differensiering og Promiscuous Gene Expression

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Intra-thymic T-celle utvikling krever en intrikat tredimensjonale meshwork sammensatt av ulike stromaceller, dvs. ikke-T-celler. Thymocyttene traversere dette stillaset i en svært samordnet tidsmessig og romlig orden mens sekvensielt bestått obligatoriske sjekkpunktene, dvs. T-celle avstamning engasjement, etterfulgt av T-celle reseptor repertoar generasjon og valg før deres eksport til periferien. De to store bosatt celletyper danner dette stillaset er kortikale (cTECs) og marg tymiske epitelceller (mTECs). Et viktig trekk ved mTECs er den såkalte promiskuøse uttrykk for mange vev-restricted antigener. Disse vev-restricted antigener blir presentert for umodne tymocytter direkte eller indirekte av mTECs eller thymic dendrittiske celler, henholdsvis resulterer i selv toleranse.

Egnede in vitro modeller som emulerer de utviklingsveier og funksjoner av cTECs og mTECs er for tiden lackonge. Denne mangelen på tilstrekkelige eksperimentelle modeller har for eksempel hemmet analyse av promiskuøse genuttrykk, som fortsatt er dårlig forstått på cellulært og molekylært nivå. Vi tilpasset en 3D organotypiske co-kultur modell til kultur ex vivo isolerte mTECs. Denne modellen ble opprinnelig utviklet for å dyrke keratinocytter på en slik måte at det genereres et tilsvarende hud in vitro. 3D-modellen bevart viktige funksjonelle egenskaper av Mtec biologi: (i) spredning og terminal differensiering av CD80 lo, Aire-negative til CD80 hi, Aire-positive mTECs, (ii) respons til RANKL, og (iii) vedvarende uttrykk for FoxN1, Aire og vev-begrenset gener i CD80- hi mTECs.

Introduction

Utviklings thymocytter utgjør omtrent 98% av thymus, mens de resterende 2% består av en rekke celler som kollektivt komponere thymisk stroma (dvs. epitelceller, dendrittiske celler, makrofager, B-celler, fibroblaster, endotelceller). De ytre kortikale epitelceller (cTECs) anskaffe innvandring av pro-T-celler fra benmargen, T-celle avstamning induksjon i multipotente pre-T-celler og positiv utvelgelse av selv MHC begrenset umodne thymocyttene. De indre medullære tymiske epitel-celler (mTECs) er involvert i induksjon av toleranse disse thymocyttene med en høy affinitet for TCR selv-peptid / MHC-komplekser ved enten å indusere negativ seleksjon eller deres avvik i T-celle regulatoriske avstamning. I forbindelse med sentraltoleranseinduksjon, mTECs er unike ved at de uttrykker et bredt spekter av vev-begrenset selvantigener (tras) således speiler den perifere selv. Dette fenomenet kalles promiskuøse genuttrykk (PGE)1,2.

De fleste aktuelle studier på denne fascinerende celletype er avhengige av ex vivo isolerte celler, som ulike kortsiktige 2D kultursystemer alltid resulterte i tap av PGE og nøkkel regulator molekyler som MHC klasse II, FoxN1 og Aire løpet av de første to dagene 3-6 . Det forble imidlertid uklart, hvilke spesielle komponenter og funksjoner intakt 3D meshwork av thymus manglet i 2D-modeller. Den re-aggregering tymisk organkultur (RTOC) har vært så langt det eneste 3D-system som tillater studiet av T-celle utviklingen, på den ene side, og stromal cellebiologi, på den annen side, i et intakt thymus mikromiljø 7. Likevel, RTOCs har visse begrensninger, det vil si, at de allerede inneholder en kompleks blanding av celler, innebærer bruk av føtale stromale celler og tåle en maksimal dyrkningsperiode på 5 til 10 dager.

Mangelen på reductionist in vitro kultursystemer har hemmet studiet avflere aspekter av T-celle utvikling og thymic organogenesen ikke minst den molekylære regulering av PGE og dets forhold til utviklingsbiologi hos mTECs.

På grunn av den nære relatert av strukturert organisering av epitelceller i huden og thymus, vi har valgt en 3D organotypic kultur (OTC) system som hadde blitt opprinnelig utviklet for å etterligne differensiering av keratinocytter in vitro og dermed skape en dermal tilsvarende. OTC-systemet består av en inert matriks stillas belagt med dermale fibroblaster som er fanget i en fibringel, hvorpå keratinocytter utsåes 8,9. Her, erstattet vi keratinocytter med rensede mTECs. Samtidig som de grunnleggende funksjonene i denne modellen, vi optimalisert visse parametre.

I vedtatt OTC modell mTECs proliferated, gikk terminal differensiering og vedlikeholdes Mtec identitet og PGE, og dermed tett etterligne in vivo mTECs utvikling

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien er godkjent av etikkomiteen av Regierungspräsidium Karlsruhe. Alle dyrene ble holdt under patogenfrie forholdene på den tyske Cancer Research Center (DKFZ). For alle kultur eksperimenter museunger som strekker seg fra 1 til 7 dager gamle ble brukt.

1. Isolering av mTECs fra Thymus

MERK: Følgende fordøyelsen tiltak ble utført som tidligere beskrevet en under sterile forhold med noen endringer som følger.

  1. Halshogge museunger og fjerne thymus. Plasser ble thymus på is i en Petri-plate inneholdende RPMI 1640 medium (inneholdende 5% FCS).
  2. Skjær ble thymus i fine, små stykker og plasser i en rundbunnet rør med ~ 5 til 30 ml RPMI-medium og rør forsiktig ved hjelp av en magnet i 10 minutter ved RT
  3. Deretter, dekanter supernatanten inneholdende hovedsakelig thymocytter og fordøye den gjenværende vevet i rekkefølge med en runde av collagenaSE type IV (0,2 mg / ml og 57 U / ml endelig concentartion) i 15 minutter hver ved 37 ° C, etterfulgt av collagenase / dispase (0,2 mg / ml og 1,2 U / ml sluttkonsentrasjon) i 25 minutter hver ved 37 ° C i et vannbad under magnetisk omrøring inntil thymus blir fullstendig spaltet. Bruk en ml enzym per 02:58 thymus.
  4. Agitere vevet gang hvert 7-10 min med en Pasteur pipette Pool kollagenase / dispase fraksjoner og filtrere gjennom en 70 mikrometer gasbind.
  5. Berike mTECs av magnetisk cellesortering (MACS). Utføre rensingen av mTECs ved magnetisk cellesortering som tidligere beskrevet 11 og vist i figur 1.
    MERK: For magnetisk sortering av mTECs brukte vi følgende antistoffer: anti-CD80-PE (16-10A1, bruk på 1: 100 fortynning) og anti-EpCAM-bio (G8.8, bruk på 1: 100 fortynning) 12. Umodne og modne mTECs bruker MACS ble definert som: CD45 - EpCAM + CD80 - og CD45 - CD80 + respectivEly.
  6. Etter MACS rensing (renhet umodne mTECs = 83,1 ± 6,3% og modne mTECs = 79,23 ± 3,42%), frø de mTECs på de organotypiske kulturer som beskrevet nedenfor (punkt 2.3).
  7. Alternativt kan sortere mTECs ved hjelp av FACS (ved hjelp av 100 pm dyse) etter MACS CD45 uttømming ved hjelp av følgende antistoffer: anti-CD45-PerCP (30-F11, bruk ved 1: 100 fortynning), anti-Ly51-FITC (6C3, bruk ved en : 100 fortynning), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, bruk ved 1: 500 fortynning) og anti-CD80-PE (16-10A1, bruk ved 1: 100 fortynning). Utelukke døde celler ved hjelp propidiumjodid (1: 5000) (Dag 4). Umodne og modne mTECs bruker FACS ble definert som: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - og PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, henholdsvis.

2. 3D organotypiske Co-kulturer (OTC)

MERK: 3D-dermal konstruksjoner for organotypiske dyrking av keratinocytes ble fremstilt som tidligere beskrevet 9,13. På alle trinn cellene ble inkubert ved 37 ° C og 5% CO2. De OTCs bruker mTECs var forberedt med små modifikasjoner som følger.

  1. Utarbeidelse av humane fibroblaster
    MERK: De menneskelige dermale fibroblaster ble hentet fra eksplantering kulturer av de-epidermised dermis som tidligere beskrevet ni.
    1. I korte trekk, kuttet strimler av menneskelig hud (~ 5 cm lengde), og behandle med termolysin (0,5 mg / ml i saltvann med 10 mM Hepes pH 7,4), O / N ved 4 ° C.
    2. Deretter skille epidermis fra dermis ved hjelp av pinsett.
    3. Fint kuttet dermis i små biter, legg i en 10 cm Petri plate og la det tørke i 1-2 timer under en steril luftstrøm. Supplere explants regelmessig med DMEM inneholder 20% FBS.
    4. Dele ut voksende fibroblaster når konfluent (vanligvis rundt tre uker) med 0,1% trypsin å sørge for at eksplantater fortsette å følge platen for videre consuksessiv runder med utvekst.
    5. Utvid fibroblaster fra samme eksplantater for opptil tre ganger i DMEM med 10% FBS og cryo-bevare dem 14. Bruk samme batch av fibroblaster for hver forsøksserie.
      MERK: fibroblaster ble ikke bestrålt for oppsett av dermal ekvivalenter.
  2. Utarbeidelse av stillaset
    1. Skjær 0,4-0,6 mm tykt viskose, vevet fibermateriale (produktdetaljer i støtte excel ark) i godt avgrensede sirkler med en skarp 11 mm diameter metall puncher til akkurat passe inn 12 godt filterinnsatser. Deretter plasserer den i 12- godt filterinnsats (polyester kapillær pore membran, tre mikrometer pore størrelse) som et stillas. Plasser komplett filteroppsettet i en steril 12-brønns plate.
    2. Klargjør fibrin under anvendelse av et fibrin-lim-kit for operasjon som består av en blanding av fibrinogen og trombin. Pre-fortynne fibrinogen- samt trombin-komponenten av settet til 8 mg / ml og 10enheter / ml, henholdsvis. For en enkelt brønn i en 12-brønns plate gjør som følger.
      1. Fortynn 100 ul fibrinogen (8 mg / ml) med 100 ul fosfatbufret saltvann (PBS) uten Ca + 2 og Mg + 2, pH 7,0. Fortynne 100 mL trombin (10 enheter / ml) med 100 ul FCS inneholder 270.000 fibroblaster.
      2. Dispenser 200 ul av trombin som inneholdt fibroblaster celle-blanding på stillaset, til hvilken tilsettes 200 ul fibrinogen (1: 1) blanding, noe som resulterer i en endelig konsentrasjon av fibrinogen på 2 mg / ml og av trombin på 2,5 enheter / ml. Bland godt og fordele jevnt over hele området av stillaset ved forsiktig pipettering (dag 1).
        MERK: Etter 30 minutter ved 37 ° C en blodpropp omslutter fibroblaster vil ha dannet, fylles helt de indre områder av stillaset, og danner en glatt øvre overflate.
  3. Co-kultur med mTECs
    1. For pre-kultur, submerse organkulturer iDMEM med 10% FBS, 50 ug / ml L-askorbinsyre og 1 ng / ml TGF-β1 med en utskiftning av medium hver annen dag i 4-5 dager.
    2. På dagen for Mtec seeding, erstatte mediet med rFAD medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) med 10% FBS, 10 -10 M koleratoksin, 0,4 mg / ml hydrokortison, 50 mikrogram / ​​ml L-askorbinsyre, Rank-ligand (0,1 ug / ml) og 500 enheter / ml Aprotinin, og dermed hindre tidlig utviklet fibrinolyse av serinproteaser utskilt av fibroblaster.
    3. 7-8 timer senere, satt opp co-kulturer ved seeding 250.000 mTECs (enten komplett mTECs eller CD80 lo og CD80- hi undergrupper), i et volum på 100 ul per brønn på toppen av fibroblast stillaset. Tell cellene ved bruk av et Neubauer kammer (dag 4).
      MERK: Til alle tider de thymus 3D organotypiske kulturer er nedsenket i media i motsetning hud OTC som er luft-løftet.
    4. Etter 24 timers inkubasjon forsyne kulturer med medium (total medium exchange) som er nevnt ovenfor (trinn 2.3.2) nå containing reduserte mengder aprotinin, 250 enheter / ml (dag 5).
    5. For å kunne vurdere den proliferative aktiviteten mTECs, legge Edu (6,7 mikrometer / ml, dvs. 10 mm / brønn) til OTC i 4 timer før avslutning av kulturer. Utføre farging av OTC kryo-seksjoner som beskrevet i Edu bildebehandlingssett kombinert med co-farging av keratin 14. Bestem proliferative indekser av mTECs, enten ved å telle K14 + Edu + celler i to seksjoner av hver kultur prøve eller av flyt cytometri (EDU flowcytometri, punkt 1.7, men i stedet for Ly51-FITC bruke CDR1-PB 15 på en 1: 100 fortynning og 2.3.6.4).
    6. Etter 4-7 dager med co-kultur, avslutte OTCs og prosess for RNA isolering, cryo-seksjonering eller FACS analyse (dag 8-11).
      1. Avslutte kulturene ved hjelp av en pinsett, separering av stillaset / dermal ekvivalent fra filteret av brønnen innsatsen.
      2. For cryo-seksjonering, bygge inn hele OTC i oktober sammensatte og fryse i liquid nitrogen damp før cryo-seksjonering. Forbered 5-7 mikrometer tykke OTC delene med en cryostat og oppbevares ved -20 ° C inntil bruk. For immun histokjemi av kryo-seksjonert OTC bruke anti-keratin 14 (AF64, bruk på 1: 1000 fortynning), og anti-vimentin (GP53, bruk på 1: 100 fortynning) antistoffer. Utfør indirekte immun histokjemi flekker bruker respektive sekundære antistoffer.
      3. For RNA isolering, tilsett 1 ml denaturering løsning (som inneholder fenol og guanidiniumtiocyanat) i en skrukork av en 2 ml RNase fritt tube. Skjær hele OTC i stykker med en skalpell og legge inn i røret som inneholder denaturering løsning. Mekanisk strimle opp OTC med FastPrep instrument to ganger i 30 sekunder med en hastighet på 6,0, plasseres i mellom på is i 2 min (prøven kan oppbevares ved -80 ° C etter dette punkt). Hvis frosset ved -80 ° C, tines på is. Sentrifuger rørene på 11,500-13,000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et nytt rør, inkuber i 5 minutter ved romtemperatur og følge RNA isolering protokoller ved hjelp av syre guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-ekstraksjon som er beskrevet av produsenten.
      4. For FACS analyse, fjerne stillaset og skille membranen fra fibrin / fibroblast / Mtec gel. Fint kuttet gelen med en skalpell og fordøye det i en FACS rør for ~ 20 min eller inntil fullstendig spaltet med 2 ml collagenase / dispase ved 37 ° C i et vannbad under magnetisk omrøring. Omrør den enzymoppløsning med en Pasteur pipette hver gang i 5 min. Etter fullstendig spaltning, filtrere cellesuspensjonen gjennom et 70 um filter; flekker på enkel cellesuspensjon ved bruk av antistoffer som beskrevet i 1.7 og analysere ved flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tatt i bruk en 3D organotypiske ko-kulturmodell (3D OTC) som var blitt opprinnelig utviklet for in vitro langvarig dyrking av keratinocytter 9. MACS-beriket mTECs (se MACS berikelse ordningen figur 1) ble sådd ut på et stillas som består av en fibringel og innesperrede fibroblaster. Fibroblastene gi vesentlig ekstracellulære matriks (ECM) som understøtter mTECs in vitro. MTECs ble dyrket i OTC i 4-14 dager i nærvær av RANKL i neddykkede kulturer i motsetning til keratinocytter, som er lufteksponerte likne deres in vivo miljø (se OTC set-up ordning figur 2).

Begge Mtec undergrupper som analyseres her (dvs. CD80 og CD80 lo hi mTECs) overlevde i løpet av hele dyrkningsperioden på opptil 14 dager. MTECs ble identifisert ved keratin 14 ekspresjon, og var lett å skille fra vimentin-positive fibroblaster (figur 3B). Interessant, umodne og modne mTECs vokste i ulike mønstre i kultur. CD80 lo mTECs typisk dannet bi-lag (i nær kontakt med fibroblaster), mens CD80- hi mTECs tendens til å danne kompakte celleaggregater avgrenset av fibroblaster. Disse mønstrene var reproduserbar.

De Mtec undergrupper ikke bare overlevd, men også proliferated henhold 3D OTC forhold som vurderes av Edu innlemmelse (figur 3C, 3D). Interessant, CD80 lo mTECs proliferated på en høyere rente i nærvær av RANKL, mens det motsatte var tilfelle for CD80- hi mTECs 10.

I tillegg CD80 lo mTECs differensiert i CD80- hi mTECs i nærvær av RANKL innen 4 dagers dyrking, som indikert av den sterke oppregulering av CD80. De differensierte mTECs også opprettholdt uttrykk for Aire, FoxN1 (genet og protein) samt promiskuøst uttrykt Aire uavhengig og -avhengig Tras 10.

Figur 1
Figur 1. MACS berikelse av TECS. Etter filtrering ble mTECs anriket fra thymus enkelt cellesuspensjon ved bruk av magnetisk cellesortering (MACS). Først ble de blodkreft celle linjene utarmet bruker anti-CD45 Microbeads. CD45 - celler ble deretter inkubert med anti-CD80-PE-antistoff, etterfulgt av anti-PE Microbeads. Eluatet inneholdende CD80 + -mature mTECs var dyrket direkte på OTC, mens gjennomstrømningsinneholdt CD80 - umodne mTECs og andre stromale celler. MTECs ble ytterligere beriket hjelp av anti-EpCAM-bio-antistoff og streptavidin Microbeads. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjema for trinnvis oppsett av 3D OTC. Et stillas matrise ble plassert i en 12-brønns filterinnsats. Den dermale fibroblaster fra eksplanterte huden (270 000 celler / OTC brønn) ble inokulert i en fibringel (bestående av 1: 1 forhold av fibrinogen og trombin). Disse dermal ekvivalenter vedvarte i 4-5 dager med DMEM + næringsstoffer til mTECs (250.000 celler / OTC vel) ble sådd på toppen og kultivert med medium beriket med ulike næringsstoff (rFAD + næringsstoffer).

Figur 3
Figur 3. Vekst mønstre og spredning av mTECs innen OTC. Den anrikede CD80 lo mTECs tendens til å vokse som et bi-lag i nær kontakt med fibroblaster (A), wh ereas de differensierte CD80- hi mTECs vokse som celle tilslag eller tette klynger (B). OTC ble merket på dag 4 av kultur med anti-keratin 14 (rød) og anti-vimentin antistoffer (grønne) sammen med kjernefysiske farging (Hoechst, blå). Å vurdere spredning av mTECs ble OTCs pulset med Edu (6,7 mikrometer / ml, dvs. 10 mm / brønn) i 4 timer før avslutning av kulturer. OTC kryo-delene ble deretter farget med anti-keratin 14 (grønn), og Edu-Click-iT reaksjonsblandingen (magenta) sammen med kjernefysiske farging (Hoechst, blå). Representative bilder som viser voksende Edu + CD80 lo mTECs (C) og Edu + CD80 hi mTECs (D) vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Cellspacing =" 0 "> Reaggregering tymiske organkulturer (RTOC) Organotypiske co-kulturer (OTC) Nyttig system for å studere cellulære interaksjoner som lett kan overvåkes og manipulert ved hjelp av en stort sett intakt 3D thymic arkitektur; utvikler seg til en skikkelig organisert struktur ved poding. Nyttig system for å studere utvikling og differensiering av anrikede / rensede tymiske epitel-celler i et kunstig 3D nettvaren som genereres av humane hudfibroblaster innesluttet i et fibrin stillaset. Godt etablert for å studere utviklingen av tymiske epitel-celler og thymocytter ved hjelp av inhibitorer eller modifiseringsmidler, som trenger inn i kapselen. Mottagelig for å manipulere thymus epitel utvikling eller for å studere thymocytt utvikling i co-kultur med TECS. Siden systemeter luft løftes, er størrelsen membranen pore (0,8 um) avgjørende faktorer ved å tilføre til den RTOC: Større molekyler kan ikke trenge gjennom membranen og / eller kapsel. Kultur er nedsenket i media, noe som letter opptaket av stoffer / faktorer (vellykket testet ved hjelp morfolino oligoer). Voksen og post-natal TECS eller tymocytter kan tilsatt i foster RTOCs. Barsel TECS vokse bedre enn voksne TECS; føtale TECS ennå ikke testet. Krev embryonale E14-14.5 thymus (optimal) for å tillate reaggregering og integrering av den ekstra ønsket befolkningen; vanskelig å styre fetal thymisk (akseptor) celleblanding; RTOCs krever celler fra enten fluorescensmerkede eller congenic mus som donor eller akseptor celler. Mulig å studere enkeltceller / kloner; bare "forurensninger" er menneskelige hudfibroblaster kreves for å gi ECM å støtte TECS. Imaging limited til penetrasjon dybde av levende to-foton mikroskopi; mottagelig for FACS analyse eller sortering; genuttrykkstudier krever FACS sortering av det ønskede celletype etter kultur. Fullt tilgjengelig for bildebehandling; egnet for FACS analyse, immun-histokjemi, og genuttrykkstudier.

Tabell 1. Sammenligning mellom to 3D thymic kultursystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved siden RTOCs, har 3D OTC vært langt overlegne når det gjelder TEC differensiering og PGE vedlikehold / induksjon (tabell 1) i forhold til andre (i) 'forenklede 3D ​​kulturer' med - fibroblaster alene uten stillas; (Ii) ved bruk av 2D-systemer - fibroblaster / feeder-celler ko-dyrket med TECS 10, (iii) 3T3-J2-celler, karakterisert ved at TEC-kloner som utvikles, men PGE er tapt, (iv) Matrigel eller (v) ECM komponenter (upubliserte data). PGE ble opprettholdt for opptil 7 dager i 3D OTC, fire dager blir det optimale tidspunktet punktet etterpå, begynner PGE å avta. Andre morfologiske TEC funksjoner ble opprettholdt i opp til 14 dager. Forbløffende nok den OTCs støttet sluttstadiet av Mtec differensiering sett av tidvis dannet Hassall-lignende strukturer 10.

Ble thymus brukt for OTC ble avledet fra unge postnatale mus som de har en større tilbøyelighet til å overleve i kultur sammenlignet med voksen thymus. TECS avledet from embryonale thymus har ennå ikke blitt testet på OTC. Mer så, etter den lange fordøyelsen periode (ikke bruker trypsin skyldes spalting av visse epitoper) cellene dukket opp mer levedyktig hjelp MACS fremfor FACS sortering celler. Ved hjelp av en to-trinns positive berikelse protokollen på MACS-kolonner (anti-PE perler) av CD80 + mTECs ytterligere forbedret TEC renhet.

For OTC oppsettet er det viktig å sørge for at viskose, er vevet fibermateriale skåret i skarpe, godt avgrensede sirkler uten løse fragmenter eller taggete ender som nevnt ovenfor at akkurat passe inn 12 godt kulturinnsatser. Alternativt kan stillaser som BEMCOT- viskose svaber M-3 (http://www.bemliese.com) også anvendes. Brønnen størrelse for OTC er også kritisk og bør testes, hvis andre enn seks-brønners og 12-brønners format plateformater bør brukes.

Den fibringel bør være forberedt slik at fibrinogen og trombin komponentene ikke kommer inn kontaktett med hverandre før de blir satt ut på OTC, sørg for å utveksle pipettespissen. Bland de to komponentene grundig i platen over hele stillaset til å danne en glatt øvre overflate. Fremstille alltid en test gel sammen i en brønn uten stillas for å sjekke for riktig dannelse av blodpropper, og for å ha et godt estimat av den tid som er nødvendig for koagulering. Kontroller at fibrin gel i OTC har helt levret før forsyne kulturer med media.

Ved opphør av kulturer seeded mTECs lett kan hentes ved enzymatisk fordøyelse (collage / dispase) av fibrin gel, som kan brukes for å karakterisere kultur mTECs f.eks ved flowcytometri eller PCR

3D OTC beskrevet heri har potensial for å studere eller manipulere flere TEC parametere, nemlig: 1) for å studere og / eller manipulere (via siRNA, morfolino oligoer) utviklingsveier og funksjoner av mTECs; 2) for å studere rollen til mTECs i T-celle utviklingment; 3) til kultur cTECs; 4) for å teste potensialet for progenitor tymiske stamceller; 5) å dyrke humane TECS og stamceller; 6) for å utføre enkle TEC klonale analyser. 3D OTCs representerer en forseggjort kultur teknikk emulere en del av in vivo thymus mikromiljøet. Det bør understrekes at eventuelle ytterligere analyser brukt på TECS i dagens OTC oppsettet må være grundig testet og optimalisert for seg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen økonomisk eller kommersiell interessekonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats