Login processing...

Journal / Developmental Biology /

JoVE Journal
Developmental Biology

This content is Open Access.

JoVE Journal Developmental Biology

Hemogenic omprogrammering av Human fibroblaster av tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Journal (Developmental Biology)

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Journal (Developmental Biology)

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Click here for the English version

Hemogenic omprogrammering av Human fibroblaster av tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer

Article DOI: 10.3791/60112-v • 11:42 min

November 4th, 2019 •

Rita Silvério-Alves^1,2,3, Andreia M. Gomes³, Ilia Kurochkin⁴, Kateri A. Moore^5,6, Carlos-Filipe Pereira^1,2,3

¹Molecular Medicine and Gene Therapy, Lund Stem Cell Center, Lund University, ²Wallenberg Center for Molecular, Lund University, ³Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, ⁴Skolkovo Institute of Science and Technology, ⁵Department of Cell, Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ⁶Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

November 4th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne protokollen demonstrerer induksjon av et hemogenic program i menneskelig dermal fibroblaster ved tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer GATA2, GFI1B og FOS å generere blodkreft stilk og stamceller.

Transcript

Denne metoden bidrar til å overvinne begrensninger i å studere menneskelig hematopoetisk utvikling ved å gi en enkel og tractable in vitro plattform basert på direkte celle omprogrammering. Visuell demonstrasjon av denne metoden vil gi ideell veiledning i grunnleggende trinn for å generere menneskelige hemogenic celler nemlig under lentiviral produksjon, fibroblast transduksjon og cellekultur. Ved å konvertere hudfibroblaster til hemogenic forløpere, håper vi å generere pasientspesifikke hematopoetiske stamceller og stamceller i tilstrekkelig antall for stamcelletransplantasjon.

Begynn med å dyrke HEK293T-celler i en 100 millimeter vevskultur behandlet tallerken med 10 milliliter komplett DMEM ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid til samløpet. Dagen før transfection, etter aspirering av mediet, vask parabolen forsiktig med fem milliliter PBS og løsne cellene med 1,5 milliliter dissosiasjonsløsning. Etter inkubering i fem til 10 minutter ved 37 grader Celsius, inaktiver løsningen med tre milliliter med komplett DMEM og overfør cellesuspensjonen til et konisk rør på 15 milliliter.

Vask fatet med 5 milliliter komplett DMEM for å fjerne eventuelle gjenværende vedlagte celler og trekk vasken med celleoppløsningen. Samle cellene ved sentrifugering, aspirere supernatant og resuspend pellet i seks milliliter av komplett DMEM. Deretter deler du suspensjonen jevnt mellom seks 100 millimeter vevskultur behandlet retter i et endelig volum på 10 milliliter komplett DMEM per tallerken.

Neste dag, legge til 10 mikrogram total masse av de tre overføre plasmids sammen til en ny 15 milliliter konisk rør. Deretter legger du til 10 mikrogram av andre generasjon psPAX2-emballasjevektorkoding av gag-, pol-, tat- og revgenene etterfulgt av tillegg av fem mikrogram pMD2. G konvolutt vektor koding VSV-G genet til røret.

Til slutt legger du til vann for å bringe det endelige volumet til 500 mikroliter. I to nye koniske rør på 15 milliliter legger du til 10 mikrogram FUW-M2rtTA plasmid, 10 mikrogram emballasjevektor og fem mikrogram av konvoluttvektoren til hvert rør. Deretter legger du vann opp til et endelig volum på 500 mikroliter til hvert rør.

Deretter legger du til 62,5 mikroliter med to molarkalsiumklorid til hvert av de tre rørene og bruker en pipettekontroller utstyrt med en Pasteur Pipette for å frigjøre bobler i hver blanding. Mens boblene dannes, tilsett 500 mikroliter BES bufret saltvannsdråpe mot Pasteur pipetten og på blandingen. Inkuber rørene ved romtemperatur i minst 15 minutter til blandingene ser litt overskyet ut.

Under inkubasjon, forsiktig erstatte supernatant av HEK293T cellekulturer med 10 milliliter av komplett DMEM uten antibiotika. Fordel DNA-kompleksene på individuelle HEK293T cellekulturretter og inkuber i 24 timer. Neste dag, erstatt supernativa med fire milliliter komplett DMEM per kultur og returnerer oppvasken til en 37 grader Celsius 5% karbondioksid celle kultur inkubator over natten.

Neste morgen, samle supernatantene i en 50 milliliter tube per tallerken og tilsett fire milliliter friskt medium til hver tallerken. Etter åtte timer med kultur, basseng supernatant i hver tallerken med tidligere høstet supernatant og legge til fire milliliter av friskt medium. Returner oppvasken til cellekulturinkubatoren over natten og samle supernativa en siste gang.

Når alt viruset er samlet inn, filtrerer du hver lentiviral supernatant gjennom et 0,45 mikrometer lavt proteinbindingsfilter i individuelle rør og legger til maksimalt 15 milliliter filtrert supernatant til individuelle sentrifugalfilterenheter for sentrifugering. Kast strømmen gjennom. Et viskøs lentivirus som inneholder væske, forblir i filterenheten.

Når alle lentiviral supernatant har blitt filtrert aliquot 50 til 200 mikroliter av konsentrerte lentivirus for kald lagring. Før du begynner omprogrammeringsprosedyren, kode en seks brønnvevskultur behandlet plate med 500 mikroliter på 0,1% gelatin per brønn og inkuber platen i 20 minutter ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, aspirere den gjenværende gelatinoppløsningen.

Plate menneskelige dermal fibroblaster med en tetthet på 1,5 ganger ti til femte celler per plate i to milliliter med komplett DMEM per brønn og inkubere over natten. Neste morgen, erstatte mediet i hver brønn med to milliliter av komplett DMEM supplert med åtte mikrogram per milliliter polybrene og legge til en en til en blanding av bassenget produsert transkripsjon faktor lentiviruses og M2rtTA i en ny mikrocentrifuge tube. Deretter transduserer fibroblasten med et optimalt volum av lentiviralblandingen, mellom 10 til 100 mikroliter per brønn.

Etter 16 timers inkubasjon, erstatt supernativa med fullstendig DMEM og returnerer cellene til cellekulturinkubatoren i seks til åtte timer. Etter utvinningen, erstatte supernatanter med to milliliter av komplett DMEM supplert med polybryne og utføre en andre transduksjon som nettopp demonstrert. På slutten av den andre transduksjon inkubasjon, erstatte supernativa med komplett DMEM supplert med ett mikrogram per milliliter doxycycline og returnere platen til cellekultur inkubatoren i 48 timer.

På slutten av inkubasjonen, del hver brønn på en ett til to ratio og plateceller i to milliliter per brønn av hematopoetisk medium supplert med doxycyklin i en ny gelatin belagt seks brønnplate. For å oppnå et tilstrekkelig antall celler for kromatin immunoprecipitation sekvensering analyse, plate tre ganger 10 til den femte fibroblaster i en gelatin belagt seks brønnplate og inkubere over natten. På slutten av inkubasjonen transduserer celler to ganger i to påfølgende dager med 10 til 20 mikroliter lentivirus som inneholder de individuelle faktorene av interesse eller en pool av de tre faktorene pluss FUW-M2rtTA med ett til ett forhold.

16 timer etter den andre transduksjonen, fjern viruset som inneholder supernatant og inkubere cellene i fullstendig DMEM i 24 timer. På slutten av inkubasjonen, plate innholdet i hver brønn i individuell gelatin belagt 100 millimeter vev kultur behandlet retter med komplett DMEM til et endelig volum på 10 milliliter medium per tallerken, og returnere cellene til cellekultur inkubator. Etter seks dager, erstatte supernatant med komplett DMEM supplert med doxycycline.

Returner kulturene til inkubatoren i ytterligere to dager. Som disse representative cytometriplottene demonstrerer, uttrykker omtrent 17% av omprogrammerte celler både CD49f og CD9 etter 25 dager med omprogrammering. Flertallet av doble positive celler uttrykker CD143 og en liten befolkning uttrykker CD34, noe som tyder på en dynamisk hemogenic skjebne induksjon.

Disse markørene aktiveres ikke i M2rtTA transduserte menneskelige dermal fibroblaster dyrket i 25 dager. Immunofluorescence imaging bekrefter uttrykket av CD9 og CD143 i tilhenger og runde celler som er morfologisk forskjellig fra fibroblaster, som er negative for disse markørene. Brightfeild imaging utføres for å visualisere cellekonfluens, morfologi og kolonidannelse gjennom omprogrammeringsprosessen.

Encellede RNA sekvensering analyse av omprogrammerte celler avslører en trinnvis økning i CD49f, CD9, og CD143 uttrykk fra dag to til 25. Etter kromatin immunforeføring sekvensering, Genome Browser profiler viser GATA2 binding til genomiske regulatoriske regioner av ITGA6 og ACE når fibroblaster er cotransduced med de tre faktorene eller GATA2 individuelt. Volumet av antivirale partikler som legges til kulturen bør optimaliseres for vellykket omprogrammering uten å gå på akkord med celle levedyktigheten.

Denne plattformen kan sammenkondes med farmakologisk hemming og genom-skala screening teknologier, som CRISPR-Cas9, for å definere nye regulatorer av menneskelig definitiv hematopoiesis. Denne direkte omprogrammeringsmeto tilnærmingen vil tillate forskere å utforske nye spørsmål innen menneskelig utviklingshematose og å tyde mekanismer som ligger til grunn for spesifikasjonen av menneskelige hematopoetiske stamceller. Det er viktig å utføre antivirale samlinger og transduksjoner i en laminær strømningshette dedikert til lentiviralarbeid og å kaste viralt forurenset avfall i en passende beholder.

X

Simple Hit Counter