3D Органотипической Совместное культивирование Модель поддержки Медуллярный тимуса эпителиальных клеток пролиферации, дифференцировки и Promiscuous экспрессии генов

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Развитие внутриотраслевой тимуса Т-клеток требует сложной трехмерной сетчатой ​​структуры, состоящей из различных стромальных клеток, то есть, не-Т-клеток. Тимоциты пройти этот эшафот в хорошо скоординированным временной и пространственной того в то время как последовательно проходя обязательные контрольные точки, т.е. Т-клеток коммитирование, а затем поколения репертуара Т-клеточного рецептора и отбора до их экспорта в периферии. Два основных типа клеток, образующих житель этого эшафот являются корковых (cTECs) и мозгового тимуса эпителиальные клетки (mTECs). Ключевой особенностью является mTECs так называемый беспорядочный выражение многочисленных тканевых антигенов ограничено. Эти ткани ограниченным антигены представлены незрелых тимоцитов, прямо или косвенно, mTECs или дендритных клеток тимуса, соответственно в результате аутотолерантности.

Подходящие модели в пробирке эмуляции пути развития и функции cTECs и mTECs настоящее время лаковыекороль. Это отсутствие адекватных экспериментальных моделей, например мешает анализ разнородной экспрессии генов, которая до сих пор мало изучены на клеточном и молекулярном уровне. Мы адаптировали 3D органотипической модель совместного культуры к культуре экс естественных условиях изолированных mTECs. Эта модель была первоначально разработана для выращивания кератиноцитов таким образом, чтобы генерировать эквивалента кожи в пробирке. 3D-модель сохраняется ключевые функциональные особенности Mtec биологии: (I) пролиферации и терминальной дифференцировки CD80 вот, Aire-отрицательной в CD80 привет, Aire-положительных mTECs, (II) отзывчивость к RANKL, и (III) устойчивого выражения FoxN1, Aire и тканей ограниченным гены в CD80 привет mTECs.

Introduction

Разработка тимоцитов составляют около 98% от тимуса, а остальные 2% состоит из множества клеток, которые в совокупности составить в строму тимуса (т.е. эпителиальные клетки, дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки). Наружные корковые клетки эпителия (cTECs) обеспечить эмиграцию про-Т-клеток из костного мозга, Т индукции клеточных клонов в мультипотентных предварительно Т-клеток и позитивной селекции самостоятельной MHC ограничено тимоцитов. Внутренние мозговые тимуса эпителиальные клетки (mTECs) участвуют в индукции толерантности этих тимоцитов с высоким сродством ТКР для самостоятельной пептид / МНС комплексов по обе вызывающего негативного отбора или их отклонения в Т нормативно клеток линии. В контексте индукции центральной толерантности, mTECs уникальны тем, что они выражают широкий спектр тканей ограниченным аутоантигены (très), таким образом, зеркальное периферической себя. Это явление называется выражение беспорядочную ген (PGE)1,2.

Большинство современных исследований на эту увлекательную типа клеток зависят от бывших естественных изолированных клеток, а различные краткосрочные 2D культура системы неизменно привели к потере PGE и ключевых молекул регулятора, как MHC класса II, FoxN1 и Aire в течение первых 2 дней 3-6 , Оставалось неясным, однако, какие именно компоненты и особенности неповрежденной 3D сетчатая тимуса в 2D моделей пропали без вести. Повторное объединение тимуса органной культуре (РИПЦ) было до сих пор единственным 3D система, которая позволяет исследовать развитие Т-клеток, с одной стороны, и стромальных клеток биологии, с другой стороны, в здоровом тимуса микросреды 7. Тем не менее, RTOCs имеют определенные ограничения, то есть они уже содержат сложную смесь клеток, требует ввода плода стромальных клеток и выдержать максимальный период культуры 5 до 10 дней.

Отсутствие редукционистская в культурах клеток препятствует изучениенекоторые аспекты развития Т клеток и тимуса органогенеза не менее молекулярная регулирование PGE и его отношения к биологии развития mTECs.

Вследствие тесной связанности-структурированной организации эпителиальных клеток кожи и тимуса, мы выбрали 3D Органотипической культура (OTC) системы, которые были разработаны изначально для эмуляции дифференцировку кератиноцитов в пробирке и, таким образом, создать кожный эквивалент. Внебиржевой системе состоит из инертного лесов матрицы с наложением кожных фибробластов, которые попали в фибрин геля, на который кератиноциты высевают 8,9. Здесь мы заменили кератиноцитов с очищенными mTECs. Сохраняя основные черты этой модели, мы оптимизировали некоторые параметры.

В принятой модели внебиржевом mTECs распространение, прошли терминальную дифференцировку и поддерживается идентичность Mtec и PGE, таким образом, тесно подражая в развитии естественных mTECs

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Это исследование было одобрено Комитетом по этике Regierungspräsidium Карлсруэ. Все животные были размещены под конкретного патогена условий на Германский онкологический центр (DKFZ). Для всех щенков культура эксперименты мыши от 1 до 7 дней в возрасте были использованы.

1. Выделение из тимуса mTECs

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги пищеварения проводили, как описано ранее 1 в стерильных условиях с некоторыми изменениями следующим образом.

  1. Обезглавьте щенков мыши и удалить тимус. Поместите thymi на льду в чашку Петри, содержащую RPMI 1640 (содержащей 5% FCS).
  2. Вырезать thymi в мелких, маленьких кусочков и место в круглым дном трубки с ~ 5-30 мл RPMI СМИ и осторожно перемешать с помощью магнита в течение 10 мин при комнатной температуре.
  3. После этого слейте супернатант, содержащий в основном тимоцитов и переварить оставшиеся ткани последовательно один раунд collagenaSE Тип IV (0,2 мг / мл и 57 Ед / мл конечного concentartion) в течение 15 мин каждый при 37 ° С с последующим коллагеназы / диспаза (0,2 мг / мл и 1,2 ед / мл конечной концентрации) в течение 25 мин каждый при 37 ° С в водяной бане с магнитной мешалкой, пока thymi полностью переваривается. Используйте 1 мл фермента на 2:58 thymi.
  4. Перемешивают ткани раз в 7-10 мин с помощью пипетки Пастера. Бассейн коллагеназы / диспазу фракции и фильтруют через 70 мкм марли.
  5. Обогащайте mTECs магнитным сортировки ячейки (MACS). Выполните очистку mTECs магнитным сортировки клеток, как описано выше 11, а показано на рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для магнитной сортировки mTECs мы использовали следующие антитела: анти-CD80-PE (16-10A1, использование в разведении 1: 100) и анти-EpCAM-био (G8.8, использование в разведении 1: 100) 12. Незрелые и зрелые mTECs использованием MACS были определены как: CD45 - CD80 + EpCAM - и CD45 - CD80 + respectivЭли.
  6. После очистки MACS (чистота незрелых mTECs = 83,1 ± 6,3% и зрелых mTECs = 79.23 ± 3.42%), семена в mTECs на органотипической культур, как описано ниже (раздел 2.3).
  7. Кроме того, сортировки mTECs по FACS (с использованием мкм сопла 100) после истощения CD45 MACS, используя следующие антитела: анти-CD45-PerCP (30-F11, использование при разведении 1: 100), анти-Ly51-FITC (6C3, использовать на 1 : 100 разведение), анти-ЕрСАМ-Alexa647 (G8.8, использование в масштабе 1: 500 разбавления) и анти-CD80-PE (16-10A1, использование при разведении 1: 100). Исключить мертвые клетки, используя пропидий йодид (1: 5000) (день 4). Незрелые и зрелые mTECs помощью FACS были определены как: PI - CD45 - Ly51 - ЕрСАМ + CD80 - и CD45 PI - - - Ly51 ЕрСАМ + CD80 +, соответственно.

2. 3D Органотипической Co-культуры (ОДКБ)

ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-кожный конструкции для органотипической выращивания keratinocytES были получены, как описано выше 9,13. На всех этапах клетки инкубировали при 37 ° С и 5% СО 2. В OTCs использованием mTECs были подготовлены с незначительными изменениями в следующем.

  1. Подготовка фибробластов человека
    ПРИМЕЧАНИЕ: кожные фибробласты человека были получены из эксплантов культур де-epidermised дермы, как описано ранее 9.
    1. Вкратце, вырезать полоски кожи человека (~ 5 см длины) и обработать термолизина (0,5 мг / мл в физиологическом растворе с 10 мМ Hepes рН 7,4) O / N при 4 ° С.
    2. После этого отделить эпидермис от дермы с помощью щипцов.
    3. Мелко нарезанный дермы на мелкие кусочки, место в пластине 10 см Петри и дать высохнуть в течение 1-2 часов в стерильной воздушного потока. Дополнение эксплантов регулярно DMEM, содержащей 20% FBS.
    4. Сплит вне растет фибробласты, когда сливной (обычно около 3 недель), используя 0,1% трипсин, убедившись, что экспланты продолжать придерживаться пластины для дальнейшего конПоследовательные раунды вырост.
    5. Развернуть фибробласты из тех же эксплантов до 3 раз в DMEM с 10% FBS и крио-сохранение им 14. Используйте ту же партию фибробластов для каждой экспериментальной серии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: фибробласты не были облучены для наладки кожных эквивалентов.
  2. Подготовка строительные леса
    1. Отрежьте 0,4-0,6 мм толщиной вискоза, нетканый волокнистый материал (Детали продуктов в поддержку Excel лист) в хорошо разграниченные кругов, используя острый 11 мм диаметр металла перфоратор точно вписываются в 12 и фильтра вставками. Затем поместите его в 12 и фильтрующего (полиэстер капиллярной мембраны пор, 3 мкм пор по размерам), как эшафот. Поместите полную установку фильтра в стерильный пластины 12-а.
    2. Подготовка фибрина геля с использованием фибринового клея-набор для операции, состоящей из комбинации фибриногена и тромбина. Предварительно разбавить fibrinogen- а также тромбина компонента комплекта 8 мг / мл и 10ед / мл, соответственно. Для одного лунку 12-луночного планшета в действовать следующим образом.
      1. Развести 100 мкл фибриногена (8 мг / мл) с 100 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) без Ca 2+ и Mg 2+, рН 7,0. Развести 100 мкл тромбина (10 единиц / мл) с 100 мкл FCS, содержащие 270000 фибробласты.
      2. Разливают 200 мкл тромбина, содержащего фибробласты клеток смешивают на помост, к которым добавляют 200 мкл фибриногена (смесь 1: 1), в результате чего в конечной концентрации фибриногена 2 мг / мл тромбина и 2,5 ед / мл. Все хорошо перемешать и равномерно распределить по всей площади эшафот, осторожно пипеткой (День 1).
        Примечание: Через 30 мин при 37 ° С сгусток ограждающих фибробласты будут сформированы, заполняя полностью внутренние пространства каркасом и формирования гладкую верхнюю поверхность.
  3. Совместное культивирование с mTECs
    1. Для предварительной культуры, погружаться культур органDMEM с 10% FBS, 50 мкг / мл L-аскорбиновой кислоты и 1 нг / мл TGF-β1 с среднего изменения через день в течение 4-5 дней.
    2. В день посева Mtec, замените носитель по rFAD среды (1: 1 DMEM + DMEM / F12) с 10% FBS, 10 -10 М холерного токсина, 0,4 мг / мл гидрокортизона, 50 мкг / мл L-аскорбиновой кислоты, RANK-лиганда (0,1 мкг / мл) и 500 единиц / мл апротинина, таким образом предотвращая преждевременное фибринолиз путем сериновых протеаз, секретируемых фибробластами.
    3. 7-8 ч позже, настройки со-культуры путем посева 250000 mTECs (либо полные mTECs или CD80 и CD80 вот привет подмножества), в объеме 100 мкл на лунку сверху фибробластов эшафот. Граф клеток с использованием камеры Нейбауера (День 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во все времена тимуса 3D органотипической культуры погружается в СМИ в отличие от ОДКБ кожи, которые воздуха поднимается.
    4. После 24 ч инкубации, поставить культур со средней (общая среда обмена), а упомянутые выше (шаг 2.3.2) Теперь containiнг уменьшается количество апротинина, 250 ед / мл (день 5).
    5. Для оценки пролиферативной активности mTECs, добавить Эду (6,7 мкм / мл, т.е. 10 мкм / лунку) в OTCs в течение 4 часов до прекращения культур. Выполните окрашивание OTC крио-секций, как описано в пакете ОБР изображений в сочетании с совместным окрашиванием кератина 14. Определение пролиферативные показатели mTECs, либо путем подсчета К14 + ОБР + клеток в двух секциях каждого образца культуры или потоком цитометрии (ОБР проточной цитометрии, раздел 1.7, но вместо Ly51-FITC использовать CDR1-PB 15 на разведение 1: 100 и 2.3.6.4).
    6. После 4-7 дней совместного культивирования, прекратить ОДКБ и процесс выделения РНК, крио-срезов или FACS-анализа (день 8-11).
      1. Прекратить культур с помощью щипцов, отделяя эшафот / кожный эквивалент от фильтра вставки также.
      2. Для крио-срезов, вставлять весь OTC в октябре соединения и заморозить в Liуслуга паров азота, прежде чем крио-срезов. Подготовьте 5-7 мкм OTC секции, использу криостат и хранят при -20 ° С до использования. Для иммуно-гистохимии крио-срезы ОДКБ использовать анти-кератина 14 (AF64, использование в масштабе 1: 1000 разбавления), и анти-виментин (gp53, использование в разведении 1: 100) антител. Выполните косвенный иммуно-окрашивание, используя гистохимии соответствующие вторичные антитела.
      3. Для выделения РНК, добавить 1 мл денатурирующих решение (содержащий фенол и гуанидина тиоцианата) в винтовой колпачок 2 мл РНКазы свободной трубки. Вырезать весь OTC на куски с скальпелем и добавить в пробирку, содержащую раствор денатурирующего. Механически малейших OTCs с FastPrep инструмента в два раза в течение 30 сек при скорости 6,0, в промежутке между на льду в течение 2 мин (образец можно хранить при -80 ° С, после этого момента). Если в замороженном виде при -80 ° С, оттаивают на льду. Центрифуга трубки на 11,500-13,000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° С. Передача супернатант в новую пробирку, инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре и Follow протоколы выделения РНК с использованием кислоты гуанидина извлечение тиоцианата-фенол-хлороформ, как описано производителем.
      4. Для анализа FACS, удалить и отделить каркас мембраны из фибрина / фибробластов / Mtec геля. Мелко нарезанный гель скальпелем и переварить в FACS трубы для ~ 20 мин или до тех пор, пока полностью переваривают с 2 мл коллагеназы / диспаза при 37 ° С на водяной бане с магнитной мешалкой. Перемешивают раствор фермента с помощью пастеровской пипетки каждые 5 мин. После полного переваривания, фильтровать клеточной суспензии через 70 мкм фильтр; окрасить суспензии отдельных клеток с использованием антител, как описано в 1.7, и анализируют методом проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы приняли 3D органотипической сокультуры модель (3D OTC), который был первоначально разработан для в пробирке долгосрочной культуры кератиноцитов 9. MACS-обогащенные mTECs (см MACS обогащению схема Рисунок 1) высевали на эшафот, состоящей из фибрина гель и захваченных фибробластов. Фибробласты обеспечивают существенную внеклеточный матрикс (ECM) с поддержкой mTECs в пробирке. MTECs культивировали в ОДКБ для 4-14 дней в присутствии RANKL в затопленных культур в отличие от кератиноцитов, которые воздуха подвергаются имитации их среды в естественных условиях (см OTC наладки схемы Рисунок 2).

Оба Mtec подмножества проанализированы здесь (т.е. CD80 и CD80 вот привет mTECs) сохранились в течение всего периода культивирования до 14 дней. MTECs были определены кератина 14 выражения и были легко отличимы от виментина-положительных фибробластов (Рисунок 3B). Интересно, что незрелые и зрелые mTECs выросли в разных моделей в культуре. CD80 вот mTECs обычно образуются би-слои (в тесном контакте с фибробластами), в то время как CD80 привет mTECs тенденцию формировать компактные агрегаты клеток с разделителями фибробластами. Эти модели были очень воспроизводимые.

Подмножества Mtec не только выжил, но и распространение в 3D внебиржевых условиях, оценивается EDU включения (рис 3C, 3D). Интересно, что CD80 ло mTECs распространение с более высокой скоростью в присутствии RANKL, в то время как обратное верно для CD80 хай mTECs 10.

Кроме того, CD80 ло mTECs дифференцированы в CD80 хай mTECs в присутствии RANKL в течение 4 дней в культуре, как указано в сильной положительную регуляцию CD80. Дифференцированные mTECs также поддерживается выражение Aire, FoxN1 (ген и рrotein), а также беспорядочно выразил Aire-независимым и -зависимой très 10.

Фигура 1
Рисунок 1. MACS обогащение ТИК. После фильтрации, mTECs были обогащены из вилочковой одной клеточной суспензии с помощью магнитного сортировки клеток (MACS). Во-первых, тем, что кроветворные клоны клеток были истощены с использованием анти-CD45 микрошарики. В CD45 - клетки затем инкубировали с анти-CD80 антителом PE, после чего анти-PE микрошариков. Элюат, содержащий CD80 + -mature mTECs был непосредственно культивируют на ОДКБ, а проточный содержится CD80 - незрелые mTECs и другие стромальных клеток. MTECs дополнительно обогащается с помощью антител и стрептавидином Microbeads анти-EpCam-био. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема для ступенчатого настройки 3D-ОДКБ. Каркас матрицы, помещали в фильтрующим элементом 12-луночного. В дермальные фибробласты кожи от эксплантированной (270000 клеток / ОТС лунку) засевали в фибринового геля, состоящей из (1: 1 отношение фибриногена и тромбина). Эти кожные эквиваленты не были поддержаны в течение 4-5 дней с DMEM + питательных веществ до mTECs (250000 клеток / OTC хорошо) высевали на вершине и культивировали со средой, обогащенной питательными веществами различной (rFAD + питательных веществ).

Рисунок 3
Рисунок 3. узоры роста и пролиферации mTECs внутри ОДКБ. Обогащенный CD80 вот mTECs как правило, растут, как би-слоя в тесном контакте с фибробластами (А), WH ereas дифференцированные CD80 привет mTECs расти как клеточных агрегатов или плотных скоплений (B). OTCs были помечены на 4-й день культуры с анти-кератин 14 (красный) и анти-виментина антител (зеленый) вместе с ядерной окрашивания (Hoechst, синий). Для оценки распространения mTECs, что OTCs импульсно Эду (6.7 мкм / мл, т.е. 10 мкМ / лунку) в течение 4 ч до прекращения культур. Внебиржевой крио-срезы затем окрашивали анти-кератина 14 (зеленый), и Edu-Click-It реакционную смесь (пурпурный), наряду с ядерной окрашивания (Hoechst, синий). Типичные изображения, изображающие пролиферирующих EDU + CD80 ло mTECs (C) и Edu + CD80 привет mTECs (D) показаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

"CELLSPACING =" 0 "> Реагрегация тимуса культуры органов (РИПЦ) Органотипической сокультурах (OTC) Полезная система для изучения клеточных взаимодействий, которые могут быть легко контролируются и управляются с помощью в основном нетронутыми 3D тимуса архитектуры; развивается в правильно организованной структуры при прививке. Полезная система для изучения развития и дифференциации обогащенных / очищенных тимуса эпителиальных клеток в искусственной 3D сетчатая генерируемого фибробластов кожи человека, увлеченного в фибрин эшафот. Хорошо установлено при изучении развития эпителиальных клеток тимуса и тимоцитов с использованием ингибиторов или модификаторы, которые проникают в капсулу. Поддается манипулировать развитие вилочковой эпителиальных или изучать развитие тимоцитов в совместной культуре с ТИК. Поскольку системаоборудован поднимается, размер пор мембраны (0,8 мкм) имеет решающее значение при подаче факторы РИПЦ: крупные молекулы не могут проникать через мембрану и / или капсулы. Культура погружен в СМИ, что облегчает поглощение веществ / факторов (успешно протестирован с помощью морфолино олигонуклеотидов). Взрослый и послеродовой ТИК или тимоциты можно шипами в эмбриональных RTOCs. Послеродовой ТИК расти лучше, чем взрослых ТИК; плода ТИК пока не тестировалась. Требовать эмбриональных E14-14.5 thymi (оптимальное), чтобы позволить реагрегация и интеграции добавленной требуемой населения; трудно контролировать плода тимуса (акцептор) клеточный состав; RTOCs требуют клетки либо от флуоресцентно меченных или конгенных мышей в качестве донора или акцептора клеток. Возможно изучение отдельных клеток / клонов; только "загрязнители" человеческие фибробласты кожи, необходимые для обеспечения ECM для поддержки ТИК. Изображений Limited, чтобы глубина проникновения живой двух фотонов микроскопии; поддается анализу FACS или сортировки; исследования экспрессии генов требует FACS сортировку нужного типа клеток после культуры. Полностью доступны для визуализации; подходит для FACS анализа, иммуно-гистохимии и исследований экспрессии генов.

Таблица 1. Сравнение между двумя 3D тимуса систем культуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наряду RTOCs, 3D OTCs было намного превосходит по TEC дифференциации и PGE обслуживания / индукции (таблица 1) по сравнению с другими (I) 'упрощенные 3D культуры' с помощью - фибробласты один, без строительных лесов; (II) 2D системах с помощью - фибробласты / фидерные клетки культивируют совместно с ТЕМ 10, (III) 3T3-J2-клетки, где TEC клонов разработки, но PGE теряется, (IV) или Матригель (V) компоненты ECM (неопубликованные данные). PGE поддерживали в течение 7 дней в 3D ОДКБ, 4 дней были оптимальное время точку после, PGE начинает снижаться. Другие морфологические особенности TEC поддерживали в течение до 14 дней. Интересно, OTCs поддержал конечный этап Mtec дифференциации видел по времени сформированных Гассаля-структур 10.

Thymi для ОДКБ были получены из молодых послеродовых мышей, поскольку они имеют более высокую склонность к выжить в культуре по сравнению с взрослой thymi. ТИК получены сюдам эмбриональных thymi еще не был протестирован в ОДКБ. Более того, после длительного периода пищеварения (не используя трипсин-за расщепления определенных эпитопов) клетки оказались более жизнеспособными с помощью MACS, а не FACS сортировки клеток. Использование двухэтапного протокола положительное обогащение на Маках столбцов (анти-PE бисер) в CD80 + mTECs чистоты дополнительно улучшена TEC.

Для установки внебиржевом важно, чтобы убедиться, что вискоза, нетканый волокнистый материал разрезают на острые, хорошо разграниченных кругов без свободных фрагментов или зубчатые концы, как указано выше, что именно вписываются в 12 хорошо культуре вставками. Альтернативно, каркасы, такие как вискоза BEMCOT- стеклоочистителя М-3 (http://www.bemliese.com) также могут быть использованы. Размер также для OTC также имеет важное значение и должны быть проверены, если необходимо использовать форматы пластин, кроме форматов 6-а и 12-а.

Фибрина гель должен быть подготовлен таким образом, что фибриногена и тромбина компоненты не вступают в контакторовт друг с другом, прежде чем установить на OTC, убедитесь, что обмен пипетки. Смешайте два компонента тщательно в пластине над каркасом, чтобы сформировать гладкую верхнюю поверхность. Всегда подготовить тест гель наряду в скважине без эшафот, чтобы проверить правильность формирования сгустка и иметь хорошую оценку времени, необходимого для свертывания. Убедитесь, что фибрин гель в OTC полностью свернулась перед подачей культур со средствами массовой информации.

По окончании культур затравочный mTECs может быть легко полученных ферментативным расщеплением (коллагеназа / диспаза) фибринового геля, который может быть использован для определения характеристик культивируемых mTECs например, с помощью проточной цитометрии или ПЦР.

3D-OTCs, описанные здесь, имеет потенциал, чтобы учиться или манипулировать несколько параметров TEC а именно: 1) для изучения и / или манипулировать (с помощью миРНК, морфолиновые олигонуклеотидов) путей развития и функций mTECs; 2) изучить роль mTECs в Т-клетки развиваютсяния; 3) культуры cTECs; 4) проверить потенциал предшественников тимуса стволовых клеток; 5) культура человека ТИК и стволовых клеток; 6) выполнять отдельные ТИК клоновых анализов. 3D OTCs представляют собой сложную технику культуры эмуляции часть в естественных условиях вилочковой микросреды. Следует подчеркнуть, что любые дополнительные анализы, применяемые к ТИК в текущей установке ОТС должны быть тщательно проверены и оптимизированы отдельно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют никакого финансового или коммерческого конфликта интересов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats