Cateterizzazione cardiaca nei topi per misurare il rapporto pressione del volume: Indagare l'effetto Bowditch

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Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect. J. Vis. Exp. (100), e52618, doi:10.3791/52618 (2015).

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Abstract

I modelli animali che imitano i disturbi cardiaci umani sono stati creati per testare potenziali strategie terapeutiche. Un componente chiave per valutare queste strategie è quello di esaminare i loro effetti sulla funzione cardiaca. Ci sono diverse tecniche per misurare in vivo meccanica cardiaca (ad esempio, ecocardiografia, le relazioni di pressione / volume, ecc.) Rispetto a ecocardiogramma, ventricolare in tempo reale a sinistra (LV) pressione / analisi del volume tramite cateterismo è più precisa e penetranti nel valutare la funzione ventricolare sinistra. Inoltre, l'analisi LV pressione / volume di fornisce la capacità di registrare istantaneamente variazioni durante le manipolazioni di contrattilità (ad esempio, la stimolazione β-adrenergico) e insulti patologici (ad esempio, ischemia / riperfusione). Oltre al massimo (+ dP / dt) e minimo (-dP / dt) tasso di variazione di pressione nella LV, una valutazione accurata della funzione ventricolare sinistra attraverso diversi indici indipendenti dal carico (ad esempio, pressione finale sistolicapossono essere raggiunti rapporto volume e precarico lavoro ictus recruitable). La frequenza cardiaca ha un effetto significativo sulla LV contrattilità tale che un aumento della frequenza cardiaca è il meccanismo principale per aumentare la gittata cardiaca (cioè, effetto Bowditch). Così, quando si confrontano emodinamica tra i gruppi sperimentali, è necessario avere frequenze cardiache simili. Inoltre, una caratteristica di molti modelli cardiomiopatia è una diminuzione della riserva contrattile (cioè, diminuzione effetto Bowditch). Di conseguenza, le informazioni vitali può essere ottenuta tramite determinare gli effetti di aumentare la frequenza cardiaca sulla contrattilità. I nostri e altri dati hanno dimostrato che il neuronale ossido nitrico sintasi (NOS1) topo knockout è diminuita contrattilità. Qui si descrive la procedura di misurazione della pressione LV / volume con l'aumento della frequenza cardiaca utilizzando il modello di topo knockout NOS1.

Introduction

Lo scopo del cuore è di pompare sangue attraverso il corpo per soddisfare le richieste metaboliche dell'organismo. Poiché queste richieste sono costantemente fluttuanti (ad esempio, durante l'esercizio), il cuore deve adattarsi (cioè, aumentare la gittata cardiaca). Il cuore ha messo a punto numerosi sentieri per compiere questa impresa. La maniera privilegiata nel cuore raggiunge questo è tramite un aumento della frequenza cardiaca (ad esempio, effetto Bowditch) 1. Cioè, come uno di frequenza cardiaca aumenta, ciò si traduce in un aumento della contrattilità e un aumento della gittata cardiaca. Pertanto, la funzione del cuore è estremamente dipendente della frequenza cardiaca. Sfortunatamente, malattie cardiache (ad es, infarto miocardico, ipertrofia, etc.) determina funzione povero cuore in cui il cuore pertanto non sarà in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del corpo. Le malattie cardiache sono la principale causa di morbilità e mortalità nella società occidentale. Modelli animali che ricapitolano molti cardiomy umanoopathies vengono utilizzati per indagare i meccanismi molecolari e per testare potenziali terapie. Discernere questi meccanismi e di determinare se una terapia sia valida, gli investigatori devono valutare la funzione cardiaca in vivo.

Ci sono diversi modi per valutare la funzione cardiaca in vivo (ad esempio, l'ecocardiografia, risonanza magnetica, ecc), che abitualmente misurano frazione di eiezione, accorciamento frazionale, la gittata cardiaca, ecc, tuttavia, questi parametri sono altamente dipendenti post-carico, precarico, e la frequenza cardiaca oltre alla contrattilità 2. Contrattilità misurazione è indispensabile per comprendere le proprietà intrinseche del cuore nel suo ambiente nativo. Il (dP / dt max) tasso massimo di sviluppo pressione ci porta un passo più vicino alla comprensione contrattilità. Purtroppo, dP / dt dipende anche la frequenza cardiaca e caricamento condizioni 3. Pertanto tecniche sono state sviluppate per misurare il carico (e la frequenza cardiaca, vedere below) indici indipendenti di contrattilità miocardica (cioè fine sistolica rapporto del volume di pressione (ESPVR) e precarico recruitable lavoro ictus (PRSW)) 4-6. ESPVR descrive la pressione massima che può essere sviluppata dal ventricolo in un dato volume di LV. La pendenza della ESPVR rappresenta l'elastanza telesistolico (Ees). PRSW è la regressione lineare di lavoro ictus (area racchiusa dal ciclo PV) con il volume telediastolico. Queste procedure sono una misurazione più accurata e precisa della contrattilità rispetto ai parametri emodinamici come frazione di eiezione, gittata cardiaca e la gittata sistolica. ESPVR e PRSW possono essere ottenuti tramite il blocco temporaneo della vena cava inferiore (IVC). Bloccando la IVC può essere eseguita con una cassa chiusa per evitare l'effetto di cambiare la pressione intrapleurica sulla funzione cardiaca.

L'aumento della frequenza cardiaca aumenta anche contrazione e rilassamento 1. Così, quando si confrontano la funzione cardiaca tra experimentagruppi l (ad esempio, ± dP / dt), frequenze cardiache devono essere simili. Tuttavia, le frequenze cardiache simile di solito non si verificano in ogni animale a causa di varie condizioni (malattia, intervento di ricerca, etc.). Va notato che l'anestesia (iniettabili e inalatori) abbassa la frequenza cardiaca. Poiché la frequenza cardiaca è un fattore determinante della contrattilità, anestesia interesserà notevolmente contrattilità. Per questo motivo, stiamo descrivendo la nostra procedura. Inoltre, una caratteristica di molti cardiomiopatie è una riserva contrattile ridotta (ad esempio, un effetto Bowditch diminuita). Pertanto, la funzione cardiaca dovrebbe essere misurata su una gamma di frequenze cardiache. Qui si descrive come utilizzare uno stimolatore (con una cassa chiusa) per ottenere questi effetti.

Oltre alla frequenza cardiaca, ossido nitrico (NO) è un importante modulatore della contrattilità 7. NO è prodotto tramite enzimi chiamati NO sintetasi (NOS). Noi e altri abbiamo dimostrato che i topi con knockout di neuronale NOS (NOS1 in vivo emodinamica cardiaca 8,9. Questo mouse viene utilizzato per dimostrare la misura della contrattilità del ventricolo sinistro attraverso la procedura di analisi di pressione LV / Volume eseguita a varie frequenze cardiache.

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Protocol

NOTA: Questo protocollo animale è stato approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso la Ohio State University. Questa procedura può essere utilizzato su qualsiasi topo in cui il diametro interno della carotide è grande abbastanza per inserire il catetere. Utilizzare i topi che sono al di sopra di 16 g (~ 2 mesi più vecchi).

1. Preparazione del mouse per Catheterization

  1. Sigillare tutti gli strumenti chirurgici e le forniture in un sacchetto di sterilizzazione. Sterilizzare il sacchetto in una macchina autoclave. Mantenere un campo sterile tutta la procedura e indossare guanti sterili.
  2. Anestetizzare topi con ketamina (55 mg / kg) più xilazina (15 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale.
    NOTA: L'intera procedura di misurazione sia della pressione / volume a diverse frequenze cardiache e ESPRV richiede meno di 20 minuti. Se è necessario ulteriore tempo (cioè, più di 30 min), dare un ulteriore ¼ dose di anestesia ogni 30 min.
  3. Rimuovere i capelli nel r anterioriEgion di collo e al torace con la rimozione dei capelli lozione (ad esempio, Nair) e TAPE gli arti del mouse sulla piattaforma schiuma. Confermare uno stato di anestesia profonda da un pizzico piedi.
  4. Inserire una sonda rettale per controllare la temperatura corporea (37 ± 1 ° C), e mantenere con un tampone di riscaldamento termoregolato (situato tra il telo chirurgico e la piattaforma).
  5. Preparare una lunghezza di 4-0 sutura (circa 10 cm). Loop sutura intorno incisivi superiori e nastro per la piattaforma. Ciò manterrà il diritto collo.
  6. Sterilizzare l'area chirurgica tamponando la zona con Betadine e il 75% di alcol tre volte.

2. Catheterization

  1. Preparare il catetere dal presoaking la punta in soluzione salina o acqua distillata (37 ° C) per almeno 30 minuti prima dell'uso (secondo le istruzioni del produttore) per acclimatare membrana del sensore di pressione per l'ambiente biologico bagnato e da evitare la dispersione segnale di pressione e negativa registrazioni di pressione.
  2. Fare un longitudinale 0,8 centimetri un'incisione tra la mascella inferiore e lo sterno nella regione anteriore del collo. Con le belle forbici, separare il tessuto connettivo della pelle-muscolare per esporre la trachea si trova sotto il muscolo stemohyoideus.
  3. Separare il grasso e tessuto muscolare sul lato destro della trachea con pinze curve per esporre la carotide destra.
    NOTA: L'arteria carotidea è la più grande arteria della regione anteriore del collo, contiene sangue rosso vivo, ed è pulsatile. Da non confondere con la vena giugulare che corre parallela alla carotide. La vena giugulare è rosso scuro e non pulsatile. Inoltre, durante l'isolamento della carotide, l'utente deve essere consapevole di non danneggiare il nervo pneumogastrico.
  4. Rimuovere il grasso dalla carotide destra con le pinze curve. Se esiste ramificazione della nave, che impedirà questa tecnica operativa, tagliarli con un bisturi Bovie di dissociare la carotide.Separare la maggior quantità di tessuto il più possibile sotto l'arteria carotidea con pinze curve.
  5. Tagliate due cinque centimetri 6-0 fili di seta. Passare ogni filo di seta sotto la carotide destra.
  6. Posizionare un filo vicino alla parte prossimale e l'altro vicino alla parte distale dell'arteria. Fare un nodo stretto sul filo nella parte distale, e fare un nodo sciolto sul filo nella parte prossimale.
  7. Bloccare il flusso di sangue fissando la parte prossimale dell'arteria utilizzando un morsetto vascolare piccola emostatica (posizionare la pinza sotto al filetto prossimale). La regione sigillato dell'arteria sarà riempito con fare il sangue è facile eseguire il passaggio 2.8.
  8. Perforare un piccolo foro nel giusto carotide tra i due fili (ma più vicino al filo distale) con un ago 26 G. Inserire il catetere nell'arteria carotide. Serrare leggermente il nodo sciolto nella parte prossimale della carotide sul catetere per tenere a posto.
    NOTA: Utilizzando la puntura è preferito rispettoalle forbici incisione. Facendo un nodo stretto nella parte distale dell'arteria prima, e poi la parte di bloccaggio prossimale, l'arteria sarà completamente riempita di sangue. Questo rende molto facile da colpire attraverso il vaso sanguigno. Inoltre, la dimensione dell'ago (26 G) perfora l'arteria con un foro che si adatta bene le dimensioni del catetere. Quando si utilizza il metodo di incisione forbici, era più difficile controllare la dimensione della incisione. Tuttavia, il metodo scelto dovrebbe dipendere da quale il chirurgo si sente più confortevole con.
  9. Iniziare la registrazione segnali di pressione come al punto 3.
  10. Allentare la pinza emostatica e continuare l'inserimento del catetere in avanti nel ventricolo sinistro. Se una certa resistenza si sperimenta quando avanzare il catetere, tirare delicatamente indietro e provare di nuovo che avanza. Per un mouse peso ~ 18-25 g, la lunghezza stimata del catetere che viene inserito è di 18 mm.
    NOTA: Il segnale di pressione arteriosa fluttuerà da 70 a 120 mm Hg. Una volta tsi catetere è nel ventricolo sinistro forma di cambiamento del segnale di pressione e la pressione fluttuerà da 0 a 120 mm Hg (Figura 1). Funzione cardiaca si stabilizzerà entro 2-3 minuti dopo l'inserimento del catetere.
  11. Monitorare costantemente la temperatura corporea, livello di anestesia, e il tasso di respirazione.

3. Acquisizione Dati

  1. Utilizzare il software LabChartPro 7 (o software simile). Utilizzare l'opzione WorkFlow del LabChart modulo fotovoltaico Loop. Utilizzando questo modulo, selezionare l'impostazione di default della pressione e Loop Volume.
  2. Set-up tre canali: un canale per la pressione, un canale per il volume, e un canale per la frequenza cardiaca. Campi scala insieme di parametri di cui sopra, come 0-150 mm Hg, 0-100 ml e 0-800 beat / min, rispettivamente.
  3. Premere il tasto start per registrare.

4. Bowditch Effetto

  1. Fare un 1 centimetro incisione nella zona precordio parallela al manubrio. Tagliare lo strato di muscolo e expose spazio intercostale con le forbici.
  2. Utilizzando uno stimolatore impulso piazza, impostare i seguenti parametri: Tensione di 2 V, la durata di 2 ms, e attivare la modalità di ripetizione.
  3. Tenere l'elettrodo negativo con una pinza e inserirlo attraverso il quarto spazio intercostale alla regione apicale del cuore. Tenere l'elettrodo positivo con una pinza e inserirlo attraverso il secondo spazio intercostale alla regione dell'atrio destro del cuore.
  4. Accendere lo stimolatore e cambiare la frequenza di stimolare il cuore da 4 Hz (240 battiti / min) fino a 10 Hz (600 battiti / min). Ad ogni nuova frequenza cardiaca, stimolare il cuore per 1 minuto prima della raccolta dei dati.

5. Generare il ESPVR e PRSW

  1. Tagliare il tessuto cutaneo e muscolare perpendicolare al manubrio nella zona addominale con le forbici. Aprire il enterocoelia ed esporre il fegato.
  2. Trascinare il costarum Arcus verso la testa con trazione metallico.
  3. Spingere delicatamente il fegato verso il basso conun tampone di cotone. Fare attenzione a non spingere troppo per influenzare la cavità toracica. Questo cambierà la funzione del cuore.
  4. Tagliare il legamento falciforme del fegato con le forbici per esporre la sovraepatica vena cava inferiore (IVC).
  5. Utilizzare pinze curve di spremere rapidamente la IVC per 5 secondi per bloccare il ritorno del sangue nell'atrio destro. La pressione del ventricolo sinistro e il volume cadrà a causa del ridotto afflusso di cuore. Nel generare questi valori, non usare loop inferiori ai 60 mm Hg. Il 60 mm Hg è in riferimento alla pressione sistolica.
    NOTA: questo valore è fissato a 60 mm Hg, perché questo causerà un calo significativo della pressione di perfusione a diminuire considerevolmente perfusione coronarica e influenzare la contrattilità.

6. Volume calibrazione

  1. Eparinizzare il mouse con 0,1 ml di 1: 5.000 soluzione di eparina (diluito con soluzione salina normale) mediante iniezione intraperitoneale.
  2. Rimuovere il catetere dalla carotide. Quando il catetere viene estratta from carotide, sangue eparinizzato penetri dal foro in cui è stato inserito il catetere.
  3. Raccogliere questo sangue per la calibratura del volume con una siringa da 1 ml. Riempire ogni bene in provetta di calibrazione.
  4. Rimuovere cuore di eutanasia il mouse via dissanguamento.
  5. Posizionare il catetere in ogni bene e ottenere un valore stabile unità di volume relativo (RVU). Generare una curva standard utilizzando i vari volumi standard e valori RVU da ogni pozzetto.
  6. Convertire il RVU registrato microlitri.

7. Data Processing

  1. Per esaminare l'effetto Bowditch, selezionate allo steady-state pressione / volume tracce di ogni battito cardiaco. Clicca l'analisi di base per ottenere i dati.
  2. Per i dati ESPVR e PRSW, selezionare la prima ~ 15 pressione / volume tracce, fare clic su analisi dell'occlusione nel software per generare il ESPVR (pendenza della pressione sviluppata dal LV a telediastolico volume) e PRSW (regressione lineare di lavoro ictus con la telediastolicovolume) da sci.
  3. Dare attenzione alla forma delle anse. Assicurarsi che il ciclo è chiuso senza punti angolari o torsioni. Questo è un segno di posizionamento del catetere improprio o rumori eccessivi. Controllare periodicamente cicli durante l'esperimento per assicurare vengono generati i dati corretti di pressione e di volume.

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Representative Results

Il corretto inserimento del catetere nel ventricolo sinistro è un passo importante per raggiungere valori di pressione e volume appropriato. Mostrato in figura 1, utilizzando LabChart Pro 7, è il cambiamento della forma d'onda di pressione (forma e valori) come il catetere va dalla arteria nel ventricolo.

Dopo corretto inserimento del catetere nel ventricolo sinistro, la pressione (P) ed il volume (V) i valori ottenuti saranno poi utilizzati per generare i loop PV (mostrati nella Figura 2).

L'utilizzo di questi valori di pressione, i meccanismi che alterano la contrattilità possono essere studiate. In figura 3 è un esempio di come la pressione e volume cambia con l'aumentare della frequenza cardiaca. In questo esempio, l'aumento della frequenza cardiaca da 300 a 600 battiti / min, la pressione LV passata dall'80 a 100 mm Hg, mentre i volumi diastolica e sistolica LV diminuiti. Mostrato in figura 4 rappresenta la frequenza cardiaca dipendenza delle aliquote massime e minime di sviluppo di pressione (dP / dt). Con l'aumento della frequenza cardiaca, così fa i tassi massimi e minimi di sviluppi della pressione. Questo tipo di analisi dei dati può anche essere usato per studiare regolatori di contrattilità. I nostri dati dimostrano che NOS1 - / - mice sono diminuite le tariffe massime e minime di sviluppo pressione rispetto al tipo selvatico (WT) topi (figura 4). Quindi, a eliminazione diretta della NOS1 si traduce in un effetto di Bowditch diminuito.

Utilizzando i valori di pressione e di volume ottenuti durante IVC occlusione, possiamo ottenere una misura della contrattilità indipendente dal carico. Mostrato in figura 5, sono calcolati Ees e valori PRSW (misurato a 420 battiti / min) per WT e NOS1 - / - mice. Questi dati suggeriscono che NOS1 - / - topi sono diminuiti contrattilità rispetto ai topi WT.

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Figura 1:. I segnali di pressione e di volume come rilevato con la LabChart modulo PV Loop Le variazioni del segnale di pressione quando il catetere è posizionato nel LV. Il segnale di pressione arteriosa (superiore) oscillato da 80 a 120 mm Hg. Una volta che il catetere è stato inserito nel ventricolo sinistro, la forma del cambiamento del segnale di pressione e la pressione hanno fluttuato 0-120 mm Hg. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Generazione di PV loop utilizzando il LabChart modulo fotovoltaico Loop. LEFT) i dati rappresentativi di pressione (in alto), il volume (al centro) e la frequenza cardiaca (in basso). Questi valori di pressione LV / volume sono utilizzati per generate il ciclo PV tracciando pressione (P) contro il volume (V). (Diritto) Illustrazione di loop generati dai dati a sinistra. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:.. Effetto della frequenza cardiaca sulla pressione LV e volume di dati rappresentativi che dimostrano cambiamenti di pressione LV e di volume con l'aumento della frequenza cardiaca utilizzando il LabChart LCM PV Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: knockout NOS1 (NOS1 - / -). Topi sono diminuiti nel funzionamento del cuore e contrattile riserva vivo Rispetto al tipo selvatico (WT) topi, NOS1 - / - mice hanno massima significativamente inferiore (dP / dt max) e minimo (dP / dt min) tasso di pressione sviluppo con l'aumento della frequenza cardiaca. I dati sono presentati come media ± SD. * P <0.05 vs WT via ANOVA, n = 5 topi / gruppo.

Figura 5
Figura 5: eliminazione diretta NOS1 (NOS1 - / -) topo sono diminuiti contrattilità. SINISTRA) pressione rappresentante / cicli di volume ottenuti nel corso della vena cava inferiore occlusione. Si noti la forma corretta di ogni ciclo. Le linee spesse sono la fine sistolica rapporto volume di pressione (ESPVR). RIGHT) Rispetto al tipo selvatico (WT) topi, NOS1 - / - mice avere un elastanza sistolica fine diminuito (Ees) e precarico lavoro ictus recruitable (PRSW). I dati sono presentati come media ± SD. * P <0.05 vs WT via spaiato t-test, n = 5 topi / gruppo.

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Discussion

Un punto critico per questa tecnica per ottenere una misura affidabile della contrattilità è corretto posizionamento del catetere nel LV. Se il catetere non è posizionato correttamente, quando contrae la LV le pareti possono contattare il catetere a valori molto elevati, e non fisiologici, pressione causando irregolare loop PV sagomati. Se necessario, il catetere può essere ruotato per ottenere il corretto posizionamento. Un altro passo fondamentale per questa tecnica è quello di assicurarsi il mouse ricevuto anestesia corretta. Se il mouse si trova sopra anestetizzato, questo diminuisce notevolmente la funzione cardiaca. Un mouse con una frequenza cardiaca inferiore a ~ 250 battiti / minuto può essere considerata su anestetizzato. Inoltre, il volume di sangue che il cuore pompa mouse è piccola rendendo difficile ottenere volumi precisi. È importante calibrare il volume per ogni mouse. Per la calibrazione del volume, abbiamo descritto la tecnica di calibrazione cuvetta. Ci sono altri metodi che vengono utilizzati anche per calibrare i volumi (ad esempio,calcolo del volume ictus utilizzando una sonda di flusso in dell'aorta toracica discendente) 10.

Ci sono molte limitazioni di questo metodo nel topo; tutto a causa delle sue piccole dimensioni del corpo. Ad esempio, questa tecnica richiede abilità microchirurgica accurate. Inoltre, questa tecnica comporta una certa perdita di sangue, che potrebbe potenzialmente modificare la funzione del cuore. Perdita di sangue massiccia può essere evitata facendo avanzare il catetere attraverso il sistema vascolare rispetto ad altri metodi (per esempio, perforando il ventricolo sinistro). Qui, descriviamo l'intera procedura in dettaglio con dettagli critici per evitare questi problemi.

Analisi pressione / volume è un approccio importante per indagare in contrattilità vivo. L'esecuzione di questa tecnica sui topi è significativo dal momento che ci sono molti vantaggi rispetto ad altre specie (di costo, la manipolazione genetica, etc.). Dal momento che la frequenza cardiaca è un importante determinante della funzione cardiaca 1 e influenzata da Anesthesia, abbiamo presentato ulteriori passi per accertare che le frequenze cardiache comparabili sono raggiunti per consentire un valido raffronto tra i gruppi. Inoltre, utilizzando questa tecnica ciclo PV modificato, un investigatore è in grado di testare direttamente l'effetto Bowditch. Per queste ragioni, si descrive come eseguire questa tecnica nel topo per ottenere misure accurate di in vivo contrattilità a frequenze cardiache diverse.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xlyzine 100 mg/ml Ana Sed 4821
Katamin 50 mg/ml Ketalar 310006
Heparin APP Pharmaceuticals 6003922
4-0 silk thread Surgical specialties SP102
6-0 silk thread Surgical specialties MBKF270
Forceps Fine Science Tools 11251-10
Curve forceps Fine Science Tools 11274-20
Scissors Fine Science Tools 14090-09
Vascular clamp Fine Science Tools 18555-03
Microscope World precision instruments PZM-3
Pressure catheter Millar instruments SPR-839
Pressure and volume system Millar instruments MPVS-300
PowerLab4/35 AD instruments N12128
LabchartPro 7 AD instruments
Temperature controller CWE TC-1000
Stimulator Grass SD-5
Sterile glove Micro-Touch 1305018821
Hair remover lotion Nair
Betadine surgical scrub Veterinary NDC 6761815401
Alcohol Decon Laboratories 2801
Bovie cautery Bovie AA29
1 ml Syringe (26 G needle) BD 8017299

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References

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