Generazione di linfocitica microparticelle e rilevamento del loro effetto pro-apoptotico su cellule delle vie aeree epiteliali

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

Microparticelle di membrana-capannone cellule (MPS) sono vescicole biologici attivi che possono essere isolate e loro effetti fisiopatologici esaminato in vari modelli. Qui si descrive un metodo per la generazione di parlamentari provenienti dai linfociti T (LMPS) e per dimostrare il loro effetto pro-apoptotico sulle cellule epiteliali delle vie aeree.

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Yang, C., Xiong, W., Qiu, Q., Tahiri, H., Gagnon, C., Liu, G., Hardy, P. Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (96), e52651, doi:10.3791/52651 (2015).

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Abstract

L'interesse per i ruoli biologici delle cellule vescicole membrana derivata nella comunicazione cellula-cellula è aumentato negli ultimi anni. Microparticelle (MPS) sono un tale tipo di vescicole, che vanno a diametro da 0,1 micron a 1 micron, e tipicamente capannone dalla membrana plasmatica delle cellule eucariotiche in fase di attivazione o apoptosi. Qui si descrive la generazione di linfociti T di derivazione microparticelle (LMPS) da apoptosi delle cellule T CEM stimolate con actinomicina D. LMPS sono isolati attraverso un processo di centrifugazione differenziale più gradi e caratterizzate con citometria a flusso. Questo protocollo presenta anche un metodo di rilevamento morte cellulare in situ per dimostrare l'effetto della proapoptotico LMPS sulle cellule epiteliali bronchiali derivate da topi primari espianti tissutali bronchiali respiratorie. Metodi qui descritti forniscono una procedura riproducibile per isolare quantità abbondanti di LMPS da linfociti apoptotici in vitro. LMPS derivatoin questo modo può essere utilizzato per valutare le caratteristiche dei vari modelli di malattia, e farmacologia e test tossicologici. Dato che l'epitelio delle vie aeree offre una barriera fisica e funzionale protettivo tra l'ambiente esterno e del tessuto sottostante, uso di espianti tissutali bronchiali piuttosto che linee cellulari epiteliali immortalizzate fornisce un modello efficace per le indagini richiedono tessuti delle vie aeree.

Protocol

NOTA: Maschio C57BL / 6 topi (5-7 settimane) sono da Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada.) E manipolati secondo protocolli approvati dalla Sainte-Justine Comitato Animal Care CHU. Espianti di tessuto bronchiale mouse forniscono una buona fonte di cellule epiteliali bronchiali primarie per lo studio degli effetti proapoptotici di LMPS sulle cellule epiteliali. Questo protocollo descrive la generazione in vitro di LMPS, nonché un metodo per la rilevazione di cellule epiteliali apoptotiche su espianti tissutali bronchiali LMPS trattati. Questo protocollo è costituito da 3 sezioni.

1. LMPS produzione e caratterizzazione

NOTA: Per prevenire la contaminazione, in modo che tutti i materiali usati in questo esperimento sono sterili o in autoclave. Eseguire tutti i passaggi a RT in una cappa di sicurezza biologica in condizioni sterili, se non diversamente indicato.

1.1) La stimolazione e Collezione dei deputati9

  1. Scongelare una aliquota di 10 milioni di cellule T CEM in un bagno di 37 ° C dell'acqua. Diluire in 10 ml preriscaldata medio ematopoietiche come X-VIVO, in 15 ml provetta sterile e centrifugare a 200 gx 5 min senza siero. Aspirare le cellule surnatante e risospendere in 5 ml di media pre-riscaldato.
  2. Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissutale T75 (per cellule in sospensione) con 15 ml di media ematopoietiche pre-riscaldato come X-VIVO e incubare per 4 giorni in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2.
  3. Dopo 4 giorni, trasferire tutto il terreno di coltura e le cellule in un pallone di coltura tissutale T175 contenente 100 ml di mezzo fresco. Continuare incubando le cellule per circa 72 ore nelle stesse condizioni sono cresciuti fino ad una densità di 2 milioni di cellule / ml.
  4. Uniformemente dividere le celle tra quattro beute T175 ciascuna contenente 150 ml di mezzo fresco e continuano coltura cellulare fino cellule sono cresciute (circa 48 ore di incubazione) ad una densità di 2 milioni / ml.
  5. 6 cellule in un pallone nuovo T175 contenente 150 ml di mezzo fresco, per mantenere il 2 milioni / ml densità cellulare.
  6. Aggiungere actinomicina D (disciolto in DMSO a 2 mg / ml) al mezzo ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml e incubare per 24 ore.
  7. Trasferire tutto il terreno di coltura in 50 ml provette coniche e centrifugare le cellule a 750 xg per 5 min. Trasferire il surnatante in 50 ml provette coniche e centrifugare a 1500 xg per 15 minuti per rimuovere frammenti di cellule di grandi dimensioni.
  8. Trasferire il surnatante in una bottiglia da 250 ml e ultracentrifuga a 12.000 g per 50 min. Eliminare il surnatante e raccogliere pellet.
  9. Pellets Wash LMPS-arricchito con 40 ml di PBS sterile in un tubo da 50 ml per centrifugazione a 12.000 xg per 50 min. Ripetere questa operazione due volte.
  10. Raccogliere l'ultima surnatante lavaggio; sarà usato come controllo del veicolo. Sospendere il pellet LMPS a 1ml di PBS e trasferire in un 1,5 ml provetta sterile. Aliquota e conservare isolati LMPS a -80 ° C (per evitare più cicli senza disgelo).

1.2) Caratterizzazione dei parlamentari su Analisi FACS 4

  1. Preparare 2 campioni di tampone annexin, 1 con e altre senza CaCl 2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mm, più o meno 5 mM CaCl 2.
  2. Filtro tampone annessina e FACS liquido guaina flusso utilizzando un filtro 0,22 micron per rimuovere le particelle.
  3. Diluire 1 ml di LMPS in 44 ml di tampone annexin con 5 mM CaCl 2 in un tubo FACS. Preparare un altro tubo di 1 ml di LMPS in 44 ml di tampone annexin senza CaCl 2 (controllo negativo).
  4. Aggiungere 5 ml di annexinV-Cy5 in ciascuna provetta e mescolare bene. Incubare per 15 minuti a RT al buio. Arrestare la reazione diluendo la miscela con 400 ml di FACS liquido guaina flusso in ciascun tubo.
  5. Aggiungere 10 ml (200.000 perle) di bea conteggio 7 micronsospensione ds come standard interno in ciascuna provetta per ottenere un conteggio assoluto.
  6. Stabilire porte di dimensioni relative (FSC-H, PMT E00, log di scala) e relativo granularità (SSC-H, PMT 325, scala logaritmica) trama puntino sul citofluorimetro utilizzando perline fluorescenti dimensioni-calibrato di 1 micron (gate 1) e contando perline cancello 7 micron (gate 2).
  7. Analizzare il campione LMPS on FSC-H / SSC-H plot utilizzando le porte consolidate e FL-4 canali per annexin (PMT 765, scala logaritmica) diagramma bidimensionale, con l'acquisizione di un segnale fino a 20.000 conteggio sfere sono raggiungibili in porta 2.
  8. Determinare gli eventi annexinV positivi di LMPS in tampone annexin contenente CaCl 2, e quindi sottrarre gli eventi di LMPS nel buffer annexin senza CaCl 2 (controllo negativo).
  9. Calcolare il numero assoluto di MP basati sulla seguente equazione:
    Equazione 1

1.3) Determinazione della MP Protein Concentrazione (Bradford Assay)

  1. Preparare 5 diluizioni seriali di standard proteine ​​1,25-20 ug / ml. Pipettare 800 ml di ogni soluzione standard e campione in una provetta pulita in duplice copia. Aggiungere 200 ml di Bradford reagente colorante per ogni provetta. Mescolare bene, poi incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  2. Misurare l'assorbanza a 595 nm. Determinare la concentrazione di proteine ​​della LMPS utilizzando la regressione lineare della curva standard.

2. espianti tessuto bronchiale e LMPS Trattamento

NOTA: Prestare particolare attenzione all'ambiente di lavoro sterile e asettico preparare le soluzioni ei media utilizzati in seguito esperimenti. Per preparare la completa guarigione medio, aggiungere 1 ml di tessuto di guarigione medio Supplementi con siero (scongelati su ghiaccio) a 100 ml Tissue guarigione medio e mescolare bene.

2.1) Preparazione di bronchiali espianti di tessuto

  1. Prima di coltura, graffiare 6 aree di 1 cm 2ciascuno al bordo della superficie di ogni piatto di coltura tissutale 100 mm con una lama di bisturi. Cappotto ogni graffiato 100 millimetri di tessuto piatto cultura con 2 ml di soluzione di rivestimento piatto cultura, e incubare il piatto in un umidificata CO 2 incubatore O / N a 37 ° C. Vacuum aspirare la soluzione surplus e riempire il piatto con 15 ml di tessuto di lavaggio medio.
  2. Euthanize C57BL / 6 topi (5-7 settimane) da CO 2 inalazione secondo protocolli approvati dal comitato etico per la cura degli animali.
  3. Asetticamente sezionare tessuto polmonare con bisturi, Dumont super fine pinzetta, e forbici chirurgiche. Rimuovere con attenzione i vasi sanguigni e parenchima. Mettere tessuto polmonare in ghiaccio-freddo di lavaggio del tessuto medio per il trasporto al laboratorio, se applicabile.
  4. Ulteriori sezionare bronchi sommerso nel lavaggio dei tessuti Medium e separare bronco con un diametro di 1 a 2,5 mm dal tessuto polmonare periferici. Slice tessuti bronchiali in anelli bronchiali ~ 5 millimetri di spessore con un bisturi. Utilizzare un movimento scavare con le pinze sterili microdissecting curve per raccogliere i frammenti bronchiali e metterli sulle zone graffiate dei piatti.
  5. Rimuovere il tessuto lavaggio medio, e incubare i frammenti a temperatura ambiente per ~ 5 minuti per consentire loro di aderire ai piatti.
  6. Aggiungere 10 ml di completa guarigione medio per ogni piatto e metterli in atmosfera controllata camera dell'incubatore modulare. Lavare la camera ad alta O 2 miscela di gas (70% O 2, 25% N 2 e 5% CO 2,). Posizionare la camera in un incubatore orbitale da banco e scuoterla a 37 ° C. Agitare la camera per 24 ore a 10 cicli al minuto per consentire al mezzo di fluire intermittente per i frammenti.
  7. Dopo 24 ore di incubazione, osservare le espianti di tessuto al microscopio ottico a contrasto di fase invertita. Selezionare espianti bronchiali con assoluta, il movimento capelli fini e vivace dell'epitelio bronchiale per il successivo trattamento LMPS.

2.2) LMPS Trattamento

  1. Preparare il terreno di coltura completo come segue: media integratori crescita disgelo con siero e fibroblasti inibitore sul ghiaccio. Aggiungere 1 ml di supplementi di media crescita con siero e 200 inibitore fibroblasti ml a 100 ml di terreno di coltura; mescolare accuratamente. Riscaldare il terreno di coltura completo a 37 ° C per 10 minuti prima dell'uso.
  2. Diluire LMPS isolato in una nuova provetta eppendorf sterile con PBS per preparare uno stock LMPS ad una concentrazione di 800 ug / ml.
  3. Aggiungere 0,5 ml di mezzo completo Growth a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale 12 pozzetti.
  4. Trasferire gli espianti bronchiali selezionati con le pinze microdissecting curve dal protocollo precedente (punto 2.1) in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale.
  5. Etichettare la piastra di coltura appropriato per identificare LMPS pozzi di trattamento e pozzetti di controllo. Aggiungere 25 ml LMPS magazzino in ogni trattamento LMPS bene (per una concentrazione finale di 40 mg / ml) e 25 veicoli di controllo microlitri (vedi LMP produzione s) per i pozzetti di controllo.
  6. Continuare l'incubazione in atmosfera controllata modulare camera di incubazione a 37 ° C agitando delicatamente.
  7. Dopo 24 ore, lavare espianti 3 volte con PBS e procedere al (fissaggio 4% paraformaldeide [PFA]) passo successivo.

3. Esame istopatologico

3.1) Preparare i Solutions segue prima di procedere alle prossime tappe

  1. Preparare tampone PBS 1x miscelando 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.76 mM KH 2 PO 4, pH 7.4.
  2. Per preparare 4% PFA, sciogliere 20 g di PFA in 400 ml di acqua, riscaldata a 60 ° C sotto agitazione; aggiungere qualche goccia di 10 M NaOH per cancellare la soluzione. Successivamente aggiungere PBS 1x e regolare il volume a 500 ml e il pH a 7,4. Filtro e un'aliquota; conservare a -20 ° C.
  3. Preparare i seguenti reagenti di disidratazione o di reidratazione; 100%, 90%, 70%, 50% etanolo e xilene.
e_step "> 3.2) Espianto Fixation e Sezioni di Tessuto Deparaffinizzazione

  1. Mettete ogni espianto in una provetta etichettata con 1,5 ml di 4% PFA e incubare O / N a 4 ° C. Sciacquare gli espianti due volte con 1x PBS.
  2. Disidratare espianti attraverso una serie di alcool (etanolo al 70%: 3 volte 30 minuti ciascuno; il 90% di etanolo: 2 volte 30 minuti ciascuno; 100% di etanolo: 3 volte 30 minuti ciascuno, quindi xilene: 3 volte 20 minuti ciascuno). Eseguire tutti i passaggi a RT in una cappa aspirante.
  3. Imbed espianti tissutali in paraffina a 58 ° C in un forno. Preparare 5 micron sezioni di tessuto di spessore con un microtomo rotativo.
  4. Galleggiante sezioni in un bagno di 56 ° C dell'acqua, e poi montare le sezioni su vetrini istologici etichettati. Porre i vetrini in rack di colorazione manuale e secca a 65 ° C per 1 ora. Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente.
  5. Immergere le rastrelliere in 4 piatti macchia consecutivi contenenti xilene per 10 minuti ciascuno per rimuovere la paraffina. Immergere le rastrelliere in una serie di etanolo per rimuovere xilene: 100%, quindi il 95%, then 80%, poi 70%, poi 50% di etanolo (5 min per ogni passo). Sciacquare le rastrelliere con acqua di rubinetto per 5 minuti per eliminare l'etanolo.

3.3) ematossilina e eosina (H & E) di colorazione

  1. Continuare a lavorare con le sezioni di tessuto fissate; la cremagliera in un piatto di colorazione riempito con ematossilina di Mayer per 15 min. Sciacquare il rack con acqua di rubinetto per rimuovere Hematoxylin per 20 min.
  2. Mettere in acqua distillata per 30 sec.Place in etanolo al 95% per 30 sec. Mettere in Eosina Y piatto soluzione colorante per 1 min. Disidratare attraverso 2 cambi di etanolo al 95%, 100% etanolo e xilene per 2 minuti ciascuna.
  3. Eseguire un rapido controllo al microscopio per assicurare che l'eccesso eosina viene rimosso. Mettere 2 o 3 gocce di mezzo di montaggio (Fisher SP15-100) su ogni vetrino, quindi coprire con un vetro di copertura.

3.4) In Situ cella della morte di rilevazione: TUNEL Assay

  1. Prima di iniziare, preparare proteinasi soluzione di lavoro K: 20 mg / ml aTris 10 mM / HCl, pH 7.4.
  2. Ripetere i passaggi da 1 a 5 della Sezione 3.2 (fissazione Espianto e tessuti sezione deparaffinizzazione). Sciacquare i vetrini con deionizzata H 2 O.
  3. Immergere i vetrini con 1x PBS per 10 min. Scolare l'eccesso di PBS. Incubare sezioni di tessuto per 30 minuti a RT con soluzione di lavoro proteinasi K. Sciacquare scivola due volte con 1x PBS.
  4. Eseguire il saggio TUNEL come descritto nel manuale di istruzioni del kit di rilevamento morte cellulare. Montare con mezzo di montaggio, e applicare il coprioggetto manualmente con vetrino.
  5. Analizzare i campioni al microscopio ottico. Utilizzare Image Pro 4.5 per analizzare le cellule apoptotiche in colore marrone.

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Representative Results

LMPS sono stati caratterizzati con annessina V colorazione 10 da cellule fluorescenza attivate (FACS) analisi e recintato con 1 micron perle in cui il 97% dei parlamentari (≤1 micron) erano annessina-V-Cy5 positivi (Figura 1A e 1B). In genere, circa 2,5 mg di LMPS stati ottenuti seguendo questo protocollo. Espianti tessuto bronchiale da topi C57BL / 6 sono stati sottoposti a trattamento veicolo e LMPS. Analisi istopatologica delle sezioni bronchiali rivelato l'effetto LMPS sulla integrità strutturale dell'epitelio bronchiale. In espianti di controllo, l'epitelio bronchiale è sostanzialmente intatto (Figura 2A); tuttavia, in espianti LMPS-trattati, lo strato di cellule epiteliali superficiale è stato danneggiato o perso, e c'erano diminuzioni significative di altezza cellule epiteliali e la densità (Figura 2B). Colorazione TUNEL-positivi (un marcatore di apoptosi) è stato più pronunciato nel dell'epitelio bronchiale LMPS trattato rispetto al controllo (

Figura 1
Figura 1. citometria a flusso di parlamentari provenienti da linea di cellule T CEM. (A) Determinazione del forward (FSC) e side scatter (SSC) caratteristiche con 1 micron sfere utilizzate ai parlamentari cancello. (B) Eventi in porta parlamentari sono stati ulteriormente valutati per la marcatura con annessina V-Cy5 per distinguere i veri eventi da rumore elettronico , aumentando così la specificità di rilevazione parlamentari. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. LMPS indotte bronchiale danni strato epiteliale. Istopatologici immagini rappresentative di epitheli bronchialeum di espianti trattati con il controllo (A) o (B) LMPS (40 ug / ml per 24 ore). Sezioni espianto sono state colorate con ematossilina e eosina. Frecce nere indicano lo strato epiteliale. Perdita Soleggiato degli strati cellulari superficiali e basali è evidente nelle sezioni di espianti bronchiali LMPS-trattati (B). Ingrandimento 400X, bar = 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. LMPS-indotta l'apoptosi delle cellule epiteliali bronchiali Le cellule apoptotiche nello strato epiteliale di bronchi segmentali sono stati rilevati mediante saggio TUNEL.; positivamente cellule colorate sono raffigurati in marrone. Immagini rappresentative di cellule epiteliali bronchiali in controllo (A) (B) vengono visualizzati. Frecce nere indicano lo strato epiteliale. Ingrandimento 200X (pannello superiore) e 400X (pannello inferiore), bar = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Parlamentari sono mediatori attivi intercellulare diafonia e il loro studio è promettente in molte aree della scienza. 11 Lo studio ha presentato un protocollo dettagliato per la generazione in vitro su larga scala di LMPS derivato da una linea di cellule T apoptotico. Questi parlamentari esprimono un vasto repertorio di molecole di linfociti e sono biologicamente implicati nella regolazione dell'omeostasi cellulare e tissutale. Tuttavia, LMPS provenienti da fonti diverse può essere biologicamente diversa. 4,9,12,13

LMPS visualizzare proprietà diverse a seconda degli stimoli impiegati per generarli in vitro e la cella da cui sono derivati. Come tale, estrapolazione dei dati ottenuti in vitro utilizzando LMPS derivati ​​da linee cellulari immortalizzate ai dati da LMPS generati in vivo deve essere effettuata con cautela.

Questo protocollo descrive diverse fasi di centrifugazione necessari per l'isolamento dei deputati; Pertanto, cmanipolazione areful è necessaria per minimizzare la perdita di MP durante questo processo. Si raccomanda Snap congelamento LMPS isolati a -70 ° C; abbiamo osservato che le bioattività di LMPS in queste condizioni possono essere conservati fino a 2 anni (dati non pubblicati).

Ad oggi, la citometria a flusso è considerato il "gold standard" per l'analisi parlamentari. Policromatico citometria a flusso è utilizzata per determinare sottopopolazioni di parlamentari di diversa origine cellulari. Tuttavia, gli attuali citofluorimetri disponibili in commercio sono limitati nella loro capacità di analizzare MPs popolazioni piccole dimensioni (inferiore a 300 nm) e di distinguere tra detriti cellulari e MPS. Inoltre, l'analisi FACS (analisi citofluorimetrica) può essere un metodo alternativo per saggio TUNEL per contare le cellule apoptotiche per l'analisi statistica.

Qui, dimostriamo che espianti bronchiali coltivate ex vivo in grado di fornire una buona fonte di cellule epiteliali delle vie aeree fo farmacologia e tossicologia di screening. Poiché questi espianti bronchiali assomigliano loro ambienti fisiologici originali, possono essere utili per determinare le vie di segnalazione di alcune malattie bronchiali o polmonari. Tuttavia, utilizzare solo espianti bronchiali non saranno in grado di confermare l'effetto apoptotico di LMPS sulle cellule epiteliali è il risultato di diretta o / e dal secondario all'attivazione delle cellule immunitarie residenti. Per studiare l'effetto diretto LMPS, le cellule epiteliali delle vie aeree primario sarà appropriato per questo scopo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni dal Canadian Institutes of Health Research (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec - Vision Health Network Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells  ATCC  CCL-119
X-VIVO 15 medium  Cambrex, Walkersville 04-744Q
Flask T75 Sarstedt 83.1813.502
Flask T175 Sarstedt 83.1812.502
Actinomycin D  Sigma Chemical Co. A9415-2mg
PBS Lifetechnologies 14190-144
0.22 µm filter Sarstedt 83.1826.001
Annexin-VCy5 BD Pharmagen  559933
FACS flow solution BD Bio-sciences 342003
Fluorescent microbeads (1 µm) Molecular Probes  T8880
Polysterene counting beads (7 µm) Bangs laboratories PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes Falcon 352058
1 ml pipet Fisher 13-678-11B
5 ml pipet Falcon 357543
25 ml pipet Ultident DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube Sarstedt 72.690
15 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.554.205
50 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube Nalgene 3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle Beckman 356011
Protein assay (Bradford assay) Bio-Rad Laboratories 500-0006
Protein assay standard II Bio-Rad Laboratories 500-0007
Test tube 16 x 100 VWR 47729-576
Test tube 12 x 75 Ultident 170-14100005B
Cell incubator  Mandel Heracell 150
Low speed centrifuge IEC Centra8R
High speed centrifuge Beckman Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle Beckman JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube Beckman JA30.50
Fow cytometry  BD Bio-sciences FACS Calibur
Spectrophotometer Beckman Series 600
Bronchial tissue explants and sections 
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mouse Airway PrimaCell™ System: CHI Scientific, Inc. 2-82001
 Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades Becton Dickinson AcuteCare 371310 #10
Scalpel Handle Fine Science Tools Inc.  10003-12 #7
phase-contrast inverted microscope Olympus Optical CO., LTD.    CK2
high O2 gas mixture  VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber Billups-Rothenberg Inc. MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker Barnstead Lab-Line,  SHKA4000-7
12-well tissue culture plate Becton Dickinson and Company 353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm) Sarstedt, Inc. 83.1802
Surgical scissors Fine Science Tools Inc.  14060-09 Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps Fine Science Tools Inc.  11052-10
humidified CO2 incubator Mandel Scientific Company Inc.  SVH-51023421
 Histopathological examination 
formalin formaldehyde Sigma-Aldrich, Inc.  HT5011
paraffin Fisher scientific  International, Inc. T555
ethyl alcohol Merck KGaA, Darmstadt EX0278-1
 glutaraldehyde  Sigma-Aldrich, Inc.  G6403
Cacodylate Sigma-Aldrich, Inc.  31533
microscope slides VWR Scientific Inc.  48300-025 25x75 mm
Xylene Fisher scientific  International, Inc. X5-4
Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich, Inc.  MHS16 Funnel with filter paper  
HCl  Fisher scientific  International, Inc.   A144s-500
eosin  Sigma-Aldrich, Inc.  HT110116 Funnel with filter paper  
Permount™ Mounting Medium Thermo Fisher Scientific Inc.  SP15-100
glass coverslip surgipath medical industries, Inc. 84503 24×24 #1 
TUNEL detection kit In Situ Cell Death Detection, POD 11 684 817 910
oven Despatch Industries Inc. LEB-1-20
rotary Microtome Leica Microsystems Inc. RM2145
filter paper Whatman International Ltd. 1003150 #3
Microscope Nikon Imaging Japan Inc. E800
staining dish complete Wheaton Industries, Inc. 900200 including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube Sarstedt Inc.  72.69 39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath ExpotechUSA ORS200
phosphate buffered saline   GIBCO 14190-144
fume hood Nicram RD Service 3707E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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