Automatiserad Gel Storlek Val för att förbättra kvaliteten på nästa generations sekvensering bibliotek Framställd från Miljö vattenprov

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory
Published 4/17/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Uyaguari-Diaz, M. I., Slobodan, J. R., Nesbitt, M. J., Croxen, M. A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N. A., et al. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Vatten Insamling och Filtration

  1. Samla sötvattens prover från olika platser (Figur 1). Passera prover genom en serie av filter: 1 ^ m filter, 0,2 um filter, och 30 kDa cutoff tangentiellt flödesfilter för att systematiskt separat eukaryota, bakteriella och virala stora partiklar, respektive.
    Obs: Endast rening och analys av materialet återvinns på 0.2 um filter (fritt levande bakterier) beskrivs i denna rapport, men liknande tillvägagångssätt kan användas för de andra partiklar som återvunnits från filtren.

2. Bakteriell Koncentration, DNA-extraktion och rening

  1. Ta bort 0,2 ìm membranfilter (s) från vattenfiltreringssystem (kopplingsschema, figur 2). Vik 0,2 um skivfiltret i halv och placera den i en 50 ml rör med den öppna sidan uppåt. Tillsätt 5 ml 1x fosfatbuffrad lösning (PBS) och 0,01% Tween, pH 7,4 tillröret. Om mer än ett filter används under processen använda en annan tub per filter. Butiksröret (er) med filter vid 4 ° C tills bearbetas. Annars går du vidare till steg 2.2.
  2. Ta bort 0,2 ìm membranfilter från 50 ml rör med steril pincett. Placera filtret (erna) på en petriskål (lämna PBS-buffert i röret).
    1. Med steril pincett och steril sax, skär filtret i små remsor (1 cm x 1 cm). Desinficera pincett och sax genom blötläggning i 70% isopropanol, torka med en DNA-yta sanerings och sköljning med ultrarent vatten av typ 1 mellan olika prover.
  3. Placera filter strimlat tillbaka i samma 50 ml tub. Tillsätt 10 ml 1 x PBS och 0,01% Tween, pH 7,4 till filtret så det finns totalt 15 ml buffert i 50 ml rör.
  4. Lägg 6 rena volfram pärlor (3 mm diameter) till varje 50 ml tub, täcka röret med Parafilm och skaka kraftigt i 20 minuter (använd 50 ml rör virvel adapter). Om multiple filter bearbetas från ett prov, överföring och pool hela homogenatet i en ren 50 ml tub. Centrifugera rören vid 3300 xg under 15 min vid 4 ° C.
  5. Suspendera pelleten och delprov bakterieceller (~ 1 ml delmängder) i 1,7 ml mikrorör. Notera att det kommer att finnas 5 mikrocentrifugrör per prov.
  6. Centrifugera ner de mikrocentrifugrör vid 10.000 xg under 10 minuter, och avlägsna det mesta av supernatanten ned till ~ 200 | il märke.
  7. Förvara proverna vid -80 ° C, eller vidare för att extrahera DNA från bakterier genom användning av en kommersiellt tillgänglig DNA-isoleringskit enligt tillverkarens instruktioner. Under bakteriell DNA-extraktion användning antingen PBS eller vatten som en negativ utvinning kontroll, och E. coli som en positiv utvinning kontroll.
  8. Eftersom DNA från flera rör extraheras, pool parallella under alikvoter från samma prov i en 2 ml-rör. Sedan genomföra en O / N utfällning genom användning av en lösning bestående av 0,1volymer av 3 M natriumacetat, 2 volymer av 100% etanol, och 5 pl av 5 ug / ul linjär akrylamid. Blanda väl och lagra proverna vid -80 ° C.
  9. Centrifugera vid maximal hastighet (17.000 xg) i 30 minuter vid 4 ° C. Tvätta pelleten med 1 ml iskall 70% etanol, lufttorka i en biosäkerhetsskåp för högst 5 min och återsuspendera DNA-pelleten i 34 pl av 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
    Anm: Linjär akrylamid hjälper att visualisera DNA-pelleten efter O / N-utfällning.
  10. Bestäm DNA kvantitet och kvalitet med hjälp av en hög känslighet fluorescerande nukleinsyra kvantifiering analys och en microvolume spektrofotometer, respektive, efter tillverkarens instruktioner (se tabell för material).
    Obs: Om flera prover är beredda på den tiden, kan en ultra fluorescerande nukleinsyra analys för att kvantifiera dsDNA och plattbaserad fluorometer / spektrofotometer användas istället.

3. DNA-bibliotek Framställning

  1. Enzymatiskt fragment ett nanogram av bakteriellt DNA med hjälp av en transposon baserad metod (tagmentation). Lägg adapter och indexsekvenser på fragmente DNA enligt tillverkarens anvisningar. Angående tagmented prover till 12 cykler av PCR som anges i tillverkarens anvisningar, vid vilken punkt de sekvense index ingår.

4. Automatiserad Gel Storlek Selection

  1. Hoppa standard efter PCR sanering steg som beskrivs i tillverkarens instruktioner (se tabell för material). Storlek Välj efter PCR prover direkt med en automatiserad gelbaserad storlek urvalsplattform.
    1. Lägg 3,5 pl laddningsbuffert till varje prov.
    2. Efter tillverkarens protokoll, ladda proverna på elektrofores arbetsstation och ange ett storleksurvalet målet på 500-800 bp, i en 300 pl extraktjonvolymen, med användning av en förtillverkad 1,5% agaros kassett.
    3. Koncentrera rå producerat material (300 l) ner till 25 ul via etanolprecipitation.
      Obs: Du kan också använda elektrofores arbetsstation för att automatisera koncentrationen för ett större antal prover via filterplattan och vakuumröret.
      1. Fällning rå elueringsvolym genom att använda 0,1 volymer 3 M natriumacetat, 2 volymer av 100% etanol och 5 pl av 5 ug / ul linjär akrylamid. Blanda väl, placera prover vid -80 ° CO / N. Centrifugera proverna vid 17.000 xg under 30 min.
      2. Kasta supernatanterna och fortsätt tvätta DNA pellets med 1 ml iskall 70% etanol.
      3. Centrifugera prover igen vid 17.000 xg under 30 min, kasta supernatanter, lufttorka, och slutligen resuspendera DNA-pelleten i 25 | il 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
  2. (Valfritt) Använd 1 pl av DNA-bibliotek storlek väljs med den automatiserade gelen storleken val plattform för att göra en fem-faldig utspädning med användning av Tris-EDTA-buffertlösning, pH 8,0. Analysera bibliotek med användning av en chipbaserad kapillärelektrofores instrument för att analysera dsDNA kvalitet enligt tillverkarens instruktioner.

5. Bibliotek Normalisering och sekvense

  1. Fortsätt att normalisera prover med biblioteksnormaliserings pärlor (ingår i transposon baserade preparat biblioteks kit) som beskrivs i tillverkarens förberedelseguide.
    1. Alternativt, mät dsDNA bibliotek med hjälp av en hög känslighet fluorescerande nukleinsyra kvantifiering analys, följt av att samla på ekvimolära förhållanden för att nå en slutlig dsDNA koncentration av 2 nM. Fortsätt att denaturera bibliotek med användning av 10 pl av sammanslagna bibliotek och 10 ul av 0,2 N NaOH, inkubera i 5 min vid RT Späd denature bibliotek använder hybridiseringsbuffert (medföljer transposon baserade preparat kit) till en slutlig volym av 1 ml och koncentration av 11:05.
  2. Last provsi nästa generations sekvense plattform genom att följa tillverkarens standardsekvenseprotokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DNA Koncentration och bedömning Kvalitet

Bakteriella DNA-koncentrationer som varierade från 0,01 till 0,11 ng ​​/ ml per prov vatten av de olika vattendelare platserna (tabell 1). DNA isolerat från bakteriedelen hade A 260/280 och A 260/230 nyckeltal på 1,4 till 1,8 och 0,3-1,6, respektive. Medan vissa av de A 260/230 nyckeltal var relativt låga, var ingen uppenbar hämning i den förberedda bibliotek och andra program nedströms. Dessa applikationer ingår PCR och qPCR tester riktar 16S rRNA och KVB 60, och efterföljande amplikon sekvense (data visas ej).

Ranger Technology

DNA-bibliotek som framställts med en transposon baserad metod och gel storlek väljs med en hög genomströmning automatiserad plattform gav en tät rad av DNA-fragment mellan 500-800 bp (Figur 3). Denna alternativa protocol gav koncentrationer varierande från 0,3 till 3,4 ng / ul (tabell 1). Använda ett genomsnitt på 650 bp av DNA-fragment storlek, genomsnittlig koncentration för detta bibliotek var 3,81 nM av insatsmaterial. Bibliotek var konsekvent storlek som valts i alla DNA-bibliotek framställda från flera vattendelare platser.

DNA-sekvense QC parametrar

DNA-sekvensering av detta bibliotek på Illumina MiSeq genererade ett kluster densitet av 1198 K / mm 2. Procentandelen kluster passerar filter var 84,2% med en beräknad direktavkastning om 9,2 Gb. Dessutom 7.4 Gb eller 82,8% av läsningar hade en kvalitetspoäng ≥30. Utnyttjande av en automatiserad gel storlek urvalsplattform konsekvent lett lämpliga utbyten och minimerat klustring av oönskade fragment under 200 bp.

Figur 1 <br /> Figur 1. Vattenprover togs från stads (A) och jordbruks (B) påverkade vattendelare.

Figur 2
Figur 2. Schematisk representation av metoder som används för att generera transposonbaserade baserade DNA-bibliotek från sötvattens prover. Klicka här för att se en större version av bilden.

Figur 3
Figur 3. elektroferogrammen av DNA-bibliotek som genereras från sötvattensprov: (A) Post-PCR DNA-bibliotek innan storleks urval och (B) DNA-bibliotek storlek väljs med automatiseradegel storlek val plattform (målområde: 500-800 bp). Alla prover späddes fem-faldigt med TE-buffert.

<td> 0,04 (0,04)
Miljöprov Bakteriell DNA-koncentration
(Ng / ml) *
En 260/280 En 260/230 DNA-koncentration (ng / ul) före val av storlek, volym: 25 | il DNA-koncentration (ng / ul) efter val av storlek, volym: 25 | il
1 0,11 (0,16) 1,8 1,4 27 1,2
2 0,11 (0,20) 1,8 1,3 27,4 3,3
3 0,10 (0,37) 1,8 1,6 19,5 3,4
4 1,5 0,5 24,4 1,6
5 0,11 (0,13) 1,7 1,0 26,1 1,1
6 0,05 (0,03) 1,5 0,7 15,2 0,4
7 0,01 (0,01) 1,4 0,3 15,1 0,3
8 0,03 (0,05) 1,6 0,7 17 0,9
* Värden indikerar dsDNA koncentration med hjälp av en hög känslighet fluorescerande nukleinsyra kvantifiering analys. Antal inom parentes representerar koncentrationen med hjälp av en microvolume spektrofotometer.

Tabell 1. Kvalitet och kvantitet bedömning av DNA extraherat från miljösötvattensprover, och transposonbaserade baserade bibliotek före och efterautomatiserad gel storlek val.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förekomsten av adapter dimerer och klustring av små skärstorlekar företrädesvis är sekvens i nuvarande plattformar utgör en minskning av användbara utbyten och underutnyttjande av utrustningens kapacitet 15. Användningen av pärla beating metoder i kombination med en transposon baserad strategi för att förbereda biblioteken kan resultera i mer DNA klippning jämfört med andra metoder för utvinning 4,5. Ändå alla metoder för utvinning och biblioteks förberedelse potentiellt introducera fördomar till distribution av sekvense läser 8,16. Experimentella iakttagelser användning av en automatiserad nukleinsyra extraktion plattform, i kombination med en ligering-baserad metod, inte verkar för att avlägsna överskottet av adapter dimerer från shotgun-bibliotek (data ej visade). Denna studie använde en modifierad protokoll för att förbereda bibliotek från miljöprover efter storleks Välja DNA-fragment inom ett mycket specifikt område, vilket minimerar överföring av adapter dimerer eller småDNA-fragment. Användningen av en automatiserad gel storlek urvalsplattform genererade reproducerbara spår av DNA-bibliotek inom ett specifikt område av 500-800 bp (Figur 3). Medan ett större antal raw lyder (~ 1,5 miljoner) erhölls genom att använda standardbehandling (paramagnetiska pärlor på 0,5x ratio) jämfört med andra uppstädningar (dvs, 2 gånger på 0,5x ratio) och den modifierade protokollet här beskrivna, endast 55% av de läser per prov var större än 225 bp. Andelen läsningar per prov med användning av det modifierade protokollet genererade minst 75% av läser större än 225 bp. I standardbehandling, det stora antalet läser indikerade en överrepresentation av korta läser i biblioteket. Fragment storlekar utvalda med paramagnetiska pärlor (standardbehandling) har rapporterats vara variabel jämfört med gel storlek valet närmar 17. Denna modifierade protokoll genererat mer informativ läser än paramagnetiska pärlor. Användningen av urvals gel för att bygga bibliotek har enLSO indikerade en minskning av incidensen av chimärer från ~ 5% till 0,02% 9.

Kritiska steg i det nuvarande protokollet innefattar överväganden för normalisering av ingångs DNA, mängden DNA i biblioteken, och kemi av PCR Master Mix. Beroende på startingångs DNA-koncentrationen, kan det vara tidsödande att mäta och späd DNA ned till ett belopp på 1 ng krävs av transposon baserade metod som används här och därmed snabbare automatiserbara pärla baserade strategier för att normalisera ingångs DNA kan också beaktas i den inledande provberedning 18. Efter tagmentation och inkorporering av index, prover var direkt storlek väljs med hjälp av elektrofores arbetsstation som beskrivs i denna studie. Ett kritiskt steg i detta förfarande är mängden av DNA som laddats till systemet. Den minsta prov DNA-koncentration för optisk detektion beror på typen av prov (amplikonen kontra hagelgevär sekvense). Inneboende återvinning avkastningen har varitvisat att hålla upp med snåla prover och återvinning effektivitet> 75%. Lägsta DNA belopp som kan detekteras av automatiserade gelen storleken urvalssystem som beskrivs här är 1,5 ng totalt DNA (Nesbitt, M. och Slodoban, J., 2014, opublicerade data). Ändå är optisk detektering av provet inte skyldig att göra storleks val, eftersom dubbla färgämnes markörer används för att bestämma var man ska storleken välja ett specifikt mål. Innan bibliotek framställda från miljöprover laddades i plattformen, var DNA-koncentrationen kvantifierades med användning av en fluorometer. En förhållandevis snävt intervall av DNA-koncentrationer detekterades i post PCR prover (tabell 1). Även dessa prover innehöll en blandning av salter, dimerer, DNA-polymeras, förstärkt miljö DNA och hemlig reagens 19, dessa koncentrationer representerade minst 252 gånger högre än det redovisade lägsta mängden DNA påvisbar med elektrofores arbetsstation. Normalt storleksselektion av DNA-fragment skulle genomföras i en buffertlösning i stället för PCR-masterblandning. Även om information om PCR Master Mix används i detta protokoll var hemlig från tillverkaren, har preliminära tester utförts för att spåra migration av dubbla färgämnes markörer i mixen (data visas ej). En buffert med hög jonstyrka i PCR Master Mix kommer att förändra den elektroforetiska mobiliteten av provet, och sålunda denna variabel måste rymmas för. Den automatiserade val gel plattform som beskrivs i denna studie utsätter ett alternativ för att ange om ett prov är i hög jonstyrka. När detta alternativ används, sedan förändrade elektromobilitetskurvor och fördröjda band spårning parametrar som används. Därför är det möjligt att kemin i PCR-blandningen kommer att ha en inverkan på laddningsbuffert och markörer, och påverkar migreringen av DNA-fragment i gelén.

Det finns ett fåtal system är kommersiellt tillgängliga för automatiserad eller halvautomatiserad urval gel storlek. Dessainstrument ger också separation, återvinning, och dokumentation på mindre än 1 timme. Det finns dock begränsningar när det gäller antalet prover som dessa system kan hantera, och kostnader i samband med förbruknings 17,20. I detta sammanhang, den teknik som beskrivs här hanterar aspekter av både agarosgel storleks urval och analys. Upp till 96 prover kan vara storlek väljs i en enda körning, medan upp till 192 prover kan karakteriseras med hög upplösning elektrofores. Vidare kan instrumentet också fylla vätskehanterings de generiska uppgifter användarna förväntar sig av en automatiserad arbetsstation.

Raw elueringsvolym av detta protokoll varierar 100-400 il, beroende på målområdet (25 bp till 40 kb). Medan denna aspekt av instrumentet kan uppfattas som en begränsning, måste det noteras att DNA-bibliotek som eluerats med en volym av 300 | il skulle ha en medelkoncentration av 301 pM (data ej visade). Denna resulterande värde representerar en 26 gånger högre än den som krävs slutliga koncentrationen för sekvense i en MiSeq plattform (~ 11:05). I den aktuella studien, etanolprecipitering representerade ytterligare ett steg i form av tid som används i biblioteks beredningen. För närvarande kan elueringsvolymen reduceras ytterligare genom användning av en on-däck vakuumfiltreringssteg som använder en kommersiell filterplatta och en vakuumgrenrör som passar på däck (uppgradering). Med hjälp av denna inställning är den råa elueringsvolymen överförs till filterplattan, koncentreras och sedan suspenderades i 25 ^ (Slodoban, J., 2014, personlig kommunikation). För denna studie var DNA nederbörd genomförts för att hålla arbetsflödet i överensstämmelse med ingångsvolymen som behövs för normalisering provsteg som beskrivs i transposon baserade kit.

Denna modifierade teknik kan tillämpas på DNA eller cDNA-bibliotek som framställts från andra miljöprover såsom havsvatten, avloppsreningsverk, sediment, jord, eller mikrobiella mattor. Den automatiskaMated gel storlek urvalsplattform redovisas här kan appliceras med minsta modifieringar som inte bara Illumina sekvense plattformar, men även till andra nästa generations sekvense plattformar inklusive Roche 454, Life Technologies, och Stilla BioSciences. Särskilda överväganden för att anpassa denna teknik till andra plattformar inkluderar last väl kapacitet (upp till 51 l), dimensionering referenser eller markörer, och andelen agarosgel kassett (beroende på mål fraktion). Denna hög genomströmning automatiserad gel storlek urvalsteknik är en diskriminerande form av rening och är tillräcklig för lågprisflygelektro karakteriseringar. Andra program som kan dra nytta av denna teknik inkluderar RNA-Seq projekt, långa fragment sekvense (inklusive funktionella metagenomik), gen syntes, mate par biblioteks konstruktion, de novo och komplext genomet sekvense, begränsning smälta analys och genotypning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jared R. Slobodan och Matthew J. Nesbitt både inneha aktier i Coastal Genomics, ett privatägt British Columbia corporation erbjuder Ranger Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series Thermo Scientific  1400-1620
0.2 µm Supor Membrane VWR CA28143-969 Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Tungsten carbide beads 3 mm (200) Qiagen 69997
Isopropyl alcohol 70% Jedmon Products 825751 Healthcare Plus
DNA away VWR 7010 Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q water purification system Fisher Scientific ZMQS6VF0Y Merck Millipore. This system has been discontinued.
20x PBS pH 7.5 VWR E703-1L Amresco, Inc., Solon, OH
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100 Fisher chemicals
Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes VWR 13000-V1-50 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) VWR SI-0236 Scientific Industries, Inc.
Beckman Centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd Model J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit VWR 12855-100 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes VWR 13000-V1-24 MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Nimbus Select workstation with Ranger Technology Hamilton Robotics 92720-01 Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)
Ranger reagent kit Coastal Genomics CG-10600-150-12-21 Includes loading buffer and cassettes
Ethyl alcohol (anhydrous) Commercial Alcohols P016EAAN Greenfield Ethanol
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Linear acrylamide (5 mg/ml) Life Technologies AM9520 Ambion
Eppendorf refrigerated centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. 5417R
Buffer EB (250 ml) Qiagen 19086
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
Qubit fluorometer Life Technologies Q32857 Invitrogen. This product has been discontinued.
Qubit dsDNA HS assay kit Life Technologies Q32854 Invitrogen
High sensitivity DNA reagent Agilent Technologies 5067-4626
High sensitivity DNA chips Agilent Technologies 5067-4626
Agilent 2011 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938B
Nextera XT DNA sample preparation kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT index kit Illumina FC-131-1001
MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) Illumina MS-102-2003
Miseq system Illumina SY-410-1003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
  2. Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
  4. Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
  5. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
  6. Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
  7. Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320 (2013).
  8. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18 (2011).
  9. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18 (2009).
  10. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
  11. Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
  12. Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. (2012).
  15. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
  16. Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
  18. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
  19. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. (2014).
  20. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats