Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

Bioengineering

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Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

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Abstract

Introduction

Les cellules sont soumises à des contraintes mécaniques dans de nombreux tissus, et cette stimulation mécanique a été montré pour promouvoir des changements dans les profils d'expression de gène, la libération de facteurs de croissance, des cytokines, ou le remodelage de la matrice extracellulaire et du cytosquelette 4.1. Les signaux intracellulaires transduction de ces stimuli mécaniques se produisent à travers le processus de mécanotransduction 5-7. Dans le système respiratoire, une issue de mécanotransduction est l'augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et 8,9 cytokines pro-inflammatoires dans 10 les cellules epitheliales pulmonaires en présence de contrainte de traction cyclique. Des preuves solides suggère également que la contrainte de tension excessive conduit à diriger un dommage à l'épithélium alvéolaire, en plus des réactions biochimiques de cellules 11-14. Bien que l'accent est mis ici principalement sur la réponse des cellules pulmonaires à la déformation mécanique, voies induites par mécanotransduction jouent un rôle clé dans les basic fonction de nombreux tissus dans le corps humain, y compris la régulation du tonus vasculaire 15 et le développement de la plaque de croissance 16.

L'intérêt croissant pour mécanotransduction a donné lieu à la mise au point de nombreux dispositifs pour l'application de contraintes mécaniques physiologiquement pertinentes à des cellules en culture et des tissus. En particulier, les dispositifs en appliquant une contrainte de traction, qui est une forme courante de chargement mécanique subi par le tissu, sont populaires 11,17-19. Cependant, de nombreux dispositifs disponibles sont soit conçu comme un bioréacteur pour les applications d'ingénierie tissulaire ou ne sont pas propices à une véritable imagerie de temps avec étirement. En tant que tel, il est nécessaire de développer des outils et des méthodes qui permettent de visualiser les cellules et les tissus en tension pour faciliter l'étude des voies de transduction mécanique.

Ici, un dispositif d'étirement mécanique dans le plan a été conçu et protocoles ont été élaborés pour appliquer multiples formes de la souche de tissus et de cellules, tout en permettant l'imagerie des réponses biochimiques et mécaniques en temps réel (figure 1A-D). Le dispositif utilise six pinces régulièrement espacées disposées circonférentiellement pour saisir une membrane flexible et d'appliquer une dans le plan, une distension radiale jusqu'à environ 20% (figure 1B). Le dispositif d'actionnement peut être placé dans un incubateur de culture cellulaire pendant une période prolongée de temps, tandis que le moteur (Figure 1C) est placée à l'extérieur de l'incubateur et contrôlé par un logiciel propriétaire fourni par le fournisseur du moteur. Le moteur est connecté à un conducteur linéaire, ce qui fait tourner une came interne, entraînant les six pinces Châssis uniformément en tension et de détente.

En plus du dispositif mécanique, les membranes flexibles personnalisés ont été créés à partir de culture disponibles dans le commerce des membranes de cellules prêtes à être utilisé dans le système mécanique. Ensuite, les parois circulaires (avec un diamètre d'environ28 mm) ont été faites sur et fixé à la membrane souple de sorte que les cellules peuvent être cultivées seulement dans cette région de bien décrit le profil de contrainte. Afin de déterminer si le placement de ces membranes dans le dispositif d'actionnement de fournir souche uniforme et isotrope dans le centre de la membrane flexible, l'analyse d'éléments finis a été réalisée en utilisant un logiciel disponible dans le commerce (figure 1E-F). La membrane flexible a été modélisée avec des conditions aux limites symétriques et en utilisant tous les éléments quadrilatères pour la maille. Les anneaux concentriques vu dans le tracé de contour de la souche maximum principal illustré à la figure 1F indiquent la distribution isotrope de la souche.

La souche subie par la membrane a été mesurée en enregistrant des images des repères à travers chargement (figure 2). La figure 2D montre que la souche de membrane moyenne mesurée dans les directions radiale et axiale est approximativement linéaireen ce qui concerne le moteur appliqué compte jusqu'à une déformation linéaire maximum de 20%. Il n'y avait aucune différence significative entre les niveaux de déformation mesurées pendant la distension par rapport à celles mesurées pendant la rétraction à la position de repos. Ensuite, le déplacement de cellules epitheliales bronchiques humaines (16HBE) et de leurs noyaux de culture sur la membrane souple sur mesure ont été mesurées. Marqué par fluorescence (DAPI) noyaux des cellules ont été imagées 16HBE en utilisant un objectif 20X sous un microscope confocal, alors que le déplacement de la cellule entière a été mesuré à l'aide des images à contraste de phase enregistrées avec un microscope numérique. Comme on le voit sur ​​la figure 3, la déformation mesurée par déplacement des noyaux était similaire à celle mesurée par déplacement de marquage sur la membrane, jusqu'à environ 20% de déformation linéaire. Cela confirme que la contrainte appliquée aux membranes a été transmis aux cellules adhérentes. Les protocoles décrivant l'utilisation de l'appareil de mesure sur un microscope traditionnelle et un microscop à force atomiquee sont fournies dans les étapes suivantes.

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Protocol

1. Construction de la membrane avec le bien Murs pour la rétention de Cell Culture, des Médias (voir la figure 1D pour le produit final)

  1. Utilisation de polydiméthylsiloxane (PDMS) tôles revêtues avec collagène I, découper le contour de la membrane flexible avec un scalpel ou une filière.
  2. Placez chaque membrane dans une boîte de 60 mm de Pétri pour le stockage.
  3. Création de murs:
    1. Mélanger PDMS à un ratio de 10: 1 en poids d'élastomère élastomère A à B (durcisseur).
    2. Verser 5 ml de PDMS entièrement mixtes en tubes de 50 ml.
    3. Passer tubes de 50 ml avec PDMS non durcies à l'horizontale dans un four à hybridation.
    4. Utiliser la fonction de rotor pour revêtir les parois intérieures des tubes à huit tours par minute pendant le temps de durcissement. A température ambiante, le PDMS seront entièrement durcies dans les 2 jours.
    5. Retirer les PDMS à partir du tube dans une hotte de culture cellulaire stérile.
    6. Utilisation d'une nouvelle lame de rasoir, partitionner le cylindre de PDMS en sections de 4 mm de hauteur.
    7. Placez les sections, qui serviront de wa membranells, dans un plat contenant Petri sans permettre les murs pour se froisser.
  4. Sélectionnez et le centre d'un mur de PDMS sur une membrane, tout en maintenant les deux dans la boîte de Pétri.
  5. Placez délicatement PDMS non durcis (10: 1 ratio) sur le périmètre extérieur de la paroi pour être utilisés comme de la colle. Eviter la formation de lacunes entre le mur et la membrane, car il est là pour retenir le liquide.
  6. Placer chaque boîte de Pétri contenant la membrane rempli et recouvert dans un four à 70 ° C pendant 24 heures pour durcir.

2. Corrélation des rotations moteur avec Clamp déplacement ou Radial croissance pour l'étalonnage (Figure 2)

  1. Démarrez le logiciel de commande du moteur.
  2. Déplacer les mâchoires de l'appareil à l'aide du réglage manuel dans le logiciel de moteur.
  3. Mesurez la distance et enregistrer la position de comptage du moteur entre des pinces opposées à la fois le déplacement minimum et maximum des pinces.
  4. Calculer le changement de pour cent dans la distance entre les pinces en fonction du comptage de moteur (~ 0-75k des chiffres). Cela indiquera la souche potentielle maximale atteinte sur la membrane.

3. Application du Plan sur la souris des cellules épithéliales du poumon Ligne (MLE12)

  1. Seed MLE12 cellules à 2,5 millions de cellules sur la membrane souple (étape 1) par puits à être confluentes dans les deux jours. La densité d'ensemencement peut varier pour différents types de cellules.
  2. Assurez-vous que l'actionneur mécanique est dans une position complètement détendue.
    1. Retirer milieux de culture cellulaire.
    2. Utilisation de 1,5 mm poinçons de biopsie, punch deux trous dans chacune des six pince (voir figure 1D) onglets de la membrane. Le positionnement radial des trous détermine la quantité de pré-tension de l'expérience de la membrane initialement. Percez les trous dans un rayon de 20,5 mm sur les onglets de la membrane si aucune pré-tension est souhaitée.
    3. Placer la membrane sur la civière avec les trous perforés alignant avec les broches à l'intérieur des pinces.Placez pinces supérieures en place. Serrer les vis une par une alternance côtés.
    4. Ajouter 1 ml de milieu de culture cellulaire.
  3. Placer l'appareil sur la platine du microscope de centrage au milieu de la membrane avec le trajet de la lumière.
  4. Utilisez du ruban adhésif ou des aimants (si possible) pour fixer le dispositif à la scène. Une fois fixé, le contrôle de l'en-plan (parallèle à la membrane) et verticale (direction z) du dispositif mécanique avec le contrôleur de platine du microscope.
  5. Appliquer tronçon avec le logiciel fourni par le fabricant en commandant manuellement la position et la vitesse de rotation du moteur 20.

4. Mesure de mitochondriales Reactive Oxygen Species (ROS)

  1. Une fois que les cellules sont confluentes, ajouter 2.1 ml de DMEM avec indicateur RT superoxyde mitochondrial (5 uM de concentration finale) directement sur les cellules.
  2. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
  3. Laver les cellules doucement trois fois avec un tampon réchauffé dans un bain d'eau pour37 ° C.
  4. Immédiatement placer la membrane flexible sur la civière (Étape 2.2) déjà en place en vertu d'un microscope confocal verticale.
  5. Ajouter 1 ml de DMEM avec du milieu sans rouge de phénol et 25 mM de HEPES.
  6. Définir des filtres d'excitation / émission de 510/580 nm.
  7. Plusieurs champs image toutes les 15 min pour créer l'évolution temporelle souhaitée de la production de superoxyde mitochondrial.
  8. A partir d'images capturées, l'intensité de fluorescence fiche histogrammes à chaque intervalle de temps en utilisant un logiciel capable de quantifier l'intensité de fluorescence.

5. Application de stretch et de microscopie à force atomique (AFM)

Remarque: Ces étapes sont prévues pour un AFM spécifique et la combinaison de microscope optique (Figure 4 et liste des matières).

  1. Préparer l'AFM pour l'expérience.
    1. Augmentation de la hauteur de la tête AFM à sa position maximale dans la direction z.
    2. Mettre diluants sur les jambes de l'AFM àsoulever l'avion à laquelle AFM contacts en porte à faux de l'échantillon. L'échantillon et la tête AFM doit être soulevé pour accueillir la hauteur du dispositif mécanique.
  2. Préparer le microscope optique (si disponible).
    1. Retirer la plaque du scanner de l'AFM. Retirer l'objectif souhaité.
    2. Ajouter une entretoise à l'objectif. La hauteur de l'entretoise dépendrait de l'objectif et l'AFM spécifique set-up, mais il est nécessaire si l'imagerie optique est souhaitée depuis plan d'observation sera changement dans la direction z par un montant égal à la civière et la hauteur de l'adaptateur (Figure 5A). Notez que l'AFM fournit habituellement l'imagerie à faible grossissement d'un chemin optique au-dessus du dispositif.
    3. Montez le dos objectif souhaité dans son emplacement. Placez le scanner à l'AFM.
    4. Démarrez le logiciel de l'AFM. Lancer toutes les sources de lumière nécessaires, y compris la source de lumière pour les mesures de fluorescence.
    5. Monter une puce avec un faisceau cantileverest approprié pour les mesures souhaitées. 200 PN / rigidité nm ou moins est préférable lorsque l'on mesure le module d'élasticité de cellules vivantes.
    6. Aligner le laser et calibrer la rigidité en porte à faux selon les suggestions du fabricant sur une lamelle de verre monté sur le dispositif.
  3. Préparer une membrane comme dans l'étape 1, mais avec les modifications suivantes.
    1. Immédiatement avant le montage de la membrane sur le dispositif d'étirement, couper les murs à environ 1 mm de hauteur. Ceci permet d'éviter les interférences entre les parois connu de membrane et la cellule de charge.
    2. Monter la membrane sur le dispositif mécanique comme décrit 3.2.1-3.2.3.
    3. Retirez le support de culture cellulaire pour éviter d'endommager le scanner de l'AFM en cas de déversement.
    4. Couple l'appareil avec un adaptateur (figure 5A). Placez le dispositif mécanique avec l'adaptateur sur le scanner.
    5. Étirer la membrane au niveau de la contrainte de traction désirée.
  4. Ajouter un limité (<0,5 ml) du volume des médias sur les cellules pour éviter scanner AFM ou des dommages en raison d'un microscope déversement.
  5. Engager la poutre en porte à faux avec la membrane.
  6. Suivez le protocole de l'appareil de l'AFM particulière à balayer des zones d'intérêt.

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Representative Results

Reactive Oxygen Species et Déformation

Des études antérieures ont démontré une augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les voies aériennes et les cellules épithéliales alvéolaires en réponse à l'étirement cyclique 21. Les espèces réactives de l'oxygène comprennent des molécules et de radicaux libres dérivés de l'oxygène moléculaire avec une haute réactivité pour les lipides, les protéines, les polysaccharides et les acides nucléiques de 22 à 24. ROS servir de signal commun intracellulaire à réguler la fonction du canal ionique, la protéine kinase / activation de la phosphatase, et l'expression du gène, mais une production excessive ou non régulée peut contribuer à apoptotiques et la mort cellulaire nécrotique, de la neurodégénération, l'athérosclérose, le diabète et le cancer 24,25. Superoxyde, un précurseur pour d'autres formes de ROS, peut être produite en tant que sous-produit de la respiration mitochondriale fuite lorsque les électrons de la chaîne de transfert d'électrons. Des études antérieures ont suggéré que stretch mécanique cyclique stimulé la production de superoxyde par une combinaison du système de la NADPH oxydase (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate-oxydase) et la chaîne de transport d'électrons mitochondriale (complexe I et III). Il a été proposé que cette stimulation est due à une déformation directe de la mitochondrie 21 probablement en raison de connexions au cytosquelette de la cellule. Afin de tester cette hypothèse, la cellule dispositif d'étirage a été développé afin que nous puissions les changements d'image dans la production de ROS dans les cellules vivantes en réponse à un étirement mécanique. Ici, les ROS mitochondriales produites par les cellules épithéliales bronchiques dues à étirer a été mesurée en utilisant le dispositif de mesure et de protocole. En l'absence d'étirement mécanique, la production de ROS n'a pas augmenté de manière significative plus de 60 min (Figure 4). Quand un seul tronçon de 17% a été appliqué et maintenu, il y avait une augmentation de ROS mitochondriale qui a persisté pendant encore 60 minutes.

Direct épithéliale monocouche dommages dus à stretch

2. Plusieurs études suggèrent que stretch mécanique excessive des cellules épithéliales pulmonaires peut provoquer des blessures directe impliquant des dommages aux cellules 11,13,26,27. Ce type de dommages est difficile à saisir sans imagerie en temps réel pendant la distension mécanique. En tant que tel, en utilisant le dispositif de mesure et microscopie à contraste de phase consécutives des images de cellules qui ont été étirés mécaniquement ont été enregistrées avant et après le traitement par une cytokine pro-inflammatoire (50 ml TNF-α ng / pendant 6 heures) (figure 5). Images du même champ de cellules ont été capturés à l'augmentation des niveaux de contrainte. Les images montrent la formation d'un interstice lorsque les cellules ont été tendus entre la souche 10 et 15%, comme indiqué par des flèches rouges. Il est important de noter que ces images ont été enregistrées en temps quasi-réel, <10 sec du décalage entre la fin de la stretch h et de l'imagerie, tandis que les cellules ont été étirés. Dans des études antérieures de l'imagerie cellulaire de cellules allongées, des images ont été obtenues avant et après l'étirage on compare seulement les images des cellules à l'état étiré pas 11,13,28.

AFM Nano-indentation sur les cellules étirées

Le dispositif mécanique est placé dans le manuel de vol à l'aide d'une plaque d'adaptation (voir Figure 6A). En utilisant des méthodes publiées antérieurement 13, des cartes de module d'élasticité (E-MAPS) de MLE12 cellules avant et après 10% de déformation de traction ont été obtenues (figure 6D-E). Bien que l'image de contraste de phase à 10% de déformation (figure 6D) a été obtenu dans les 10 secondes de l'étirement, les E-cartes de la figure 6D-E consommé environ 22 min avec 300 individuels courbes force-déflexion enregistrées sur une 40 um X 40 pm zone avec une vitesse / s de 2,5 um de la pointe dans la direction z.om / files / ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 1
Figure 1. Le dispositif conçu sur mesure pour la culture cellulaire et d'étirement. (A) de dessin générée par ordinateur de la conception mécanique de l'appareil, (B) une photographie de l'appareil terminée, (C) une photographie de périphérique connecté au moteur et le conducteur linéaire, qui convertit la rotation du moteur en un mouvement de dimension 1 qui étirage biaxial commande le serrage de la membrane en caoutchouc (D) de silicone. Le substrat contient deux trous sur chaque onglet de serrage pour être placées sur des poteaux sur chaque pince. (E) le modèle d'éléments finis coté de la membrane flexible qui est un quart de toute la structure en raison de l'utilisation de conditions aux limites symétriques. ( trong> F) déformation principale maximale est indiquée dans la membrane complète représentant la formation d'anneaux indicatifs de champ de déformation isotrope. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. (A) Le dispositif de support une membrane souple avec des marques appliquées pour mesurer la déformation appliquée est montrée. Close-up des images des marques, avant (B) et après (C) extensible, ont été marquées par une flèche pour indiquer clairement le déplacement des marquages ​​sur la membrane. (D) souche de membrane en fonction du moteur compte lors de l'approche et de rétraction. souche de membrane a été similaire dans les deux accostage et de retrait avec rétraction souches productrices légèrement plus élevés. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Membrane souche transmission aux cellules. (A - B) des images à contraste de phase de cellules epitheliales bronchiques humaines (de 16HBE) sur la membrane souple au moyen d'un objectif 10X, avant (A) et après (B) déformation de 20%. (C - D) marqués par fluorescence (DAPI) noyaux des cellules ont été imagées 16HBE en utilisant un objectif 20X sous un microscope confocal, avant (C) et après (D) la souche de 20%. (E) La souche de membrane connu par les cellules est linéaire et homogène.t = "_ blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. L'impact d'un seul tenant sur ​​la production de ROS de 16HBE cellules a été observée en utilisant un capteur de superoxyde mitochondrial cumulatif en utilisant un objectif 20X sous un microscope confocal (A - C). Instantanés du temps bien sûr (0, 60 min, et ~ 65 min) de la production de superoxyde cours étirement dans le même champ de cellules. (D) relative de l'intensité de fluorescence de 16HBE cellules au fil du temps indiquant une augmentation de 50% de l'intensité de fluorescence de la production de base de superoxyde dans la première heure (de A à B). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 5. images à contraste de phase d'un épithélium alvéolaire (MLE12) réponse à l'augmentation de la monocouche extensible (A - D). On a enregistré tous en utilisant un microscope numérique avec un objectif 20X. Les flèches indiquent les endroits où la séparation de cellule à cellule produite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. (A) Dispositif mécanique montré dans l'AFM pour la nano-indentation des cellules extensibles. Le scanner doit être enlevé pour la mise en place d'extenseur objectif. Trois d'allongement de la jambe sont attachés à tous les trois pieds de la tête de l'AFM pour permettre dispositifplacement. Une plaque adaptatrice est utilisée pour monter le brancard sur le scanner de l'AFM (plaque noire). Les balayages de faisceau en porte à faux dans le sens de la flèche représentée dans l'image à contraste de phase d'un tronçon avant de la cellule MLE12 (B). Les carrés rouges dans l'avant (B) et (C) après les images extensibles représentent la zone qui a été capturé lors de nano-indentation (objectif 40X). Les cartes de module d'élasticité, avant (D) et après (E) extensible, sont obtenus avec des techniques d'analyse publiées antérieurement 13. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Un dispositif unique pour l'imagerie de cellules vivantes au cours stretch mécanique a été développé; et ce dispositif a été utilisé dans un protocole d'étudier épithéliale du poumon cellule mécanobiologie. Dans des études préliminaires, on a constaté que seul un tronçon tenue stimulé la production de superoxyde mitochondriale dans les cellules épithéliales bronchiques. En outre, il a été démontré que l'augmentation des niveaux de contrainte mécanique causé des dommages directs à l'intégrité d'une monocouche de cellules épithéliales alvéolaires.

Pour réaliser ces expériences préliminaires, l'appareil a été étalonné premier, puis il a été montré que la souche a été transmise à la membrane des cellules (Figures 2-3). Dans l'ensemble du dispositif ainsi réalisé, comme indiqué par la corrélation étroite entre la souche de la membrane (mesurée par des marques sur la membrane) et la souche de cellules (mesuré par les distances entre les noyaux) représentée sur la figure 3E. Cependant, il y avait quelques différences mineures observées entre stradans mesurée sur les membranes pendant l'approche et les courbes des marqueurs de retour, comme le montre la Figure 2D. Cela était probablement dû à jeu dans l'appareil et peut-être liée à une préhension questions. En outre, un mécanisme de fixation universel pour le dispositif est nécessaire pour qu'il puisse être utilisé efficacement sur des microscopes avec des configurations différentes. Cela permettrait de réduire le temps passé entre le positionnement de l'acquisition de l'appareil et de l'image tout en conservant une connexion robuste pour le microscope. Les trous perforés dans les membranes ont été utilisés pour appliquer une pré-déformation mineure à la membrane pour empêcher la formation d'un état initial en raison de la compression de serrage d'un matériau élastique. L'état de compression conduit également à une réduction de la contrainte maximale applicable.

Le dispositif de mesure a été conçu pour tenir dans un microscope à force atomique asile MFP3D pour permettre de nano-indentation de cellules vivantes au cours stretch mécanique. Nous ne sommes pas au courant de tout autre dispositif qui est capable d'enduction d'un état de contrainte isotrope dans le plan de formation d'image pouvant fonctionner dans un AFM. Le dispositif a également été conçu pour une utilisation continue dans un incubateur de culture cellulaire (maintenue à 37 ° C dans un environnement humide, stérile avec 5% de CO 2). La capacité de fonctionner dans un incubateur permet l'étude des cellules subissant schémas extensibles à long terme.

Il existe plusieurs limites à l'approche présentée. Tout d'abord, comme les tronçons de membrane, le domaine de la mise au point se déplace hors du plan, bien que minime (~ 100 um). Cela devient une limitation lorsque le suivi d'un champ de cellules à travers un régime d'étirage, parce que le champ de vision change au cours de la distension de la membrane. Même si membrane à l'intérieur du diamètre de 22 mm éprouve 0,23 à 0,25 souche, les régions à l'extérieur de cette expérience de diamètre intérieur un champ de déformation plus variable. Bien que des études d'imagerie sont facilement limités à cette zone centrale, il est possible que les cellules répondant à des niveaux élevés de pressionau niveau de régions externes peut influer sur la réponse des cellules à l'intérieur de la région centrale. Une distribution de contrainte uniforme sur une plus grande zone d'intérêt peut être réalisé avec des améliorations dans la conception de la membrane. La membrane PDMS est auto-fluorescent aux longueurs d'onde couramment utilisées pour les indicateurs fluorescents, ce qui limite la capacité pour l'imagerie de fluorescence dans les cellules du dessous de la membrane. Pour cette raison, un microscope droit a été utilisé avec des objectifs d'immersion de l'eau dans nos études de la production de ROS décrites ci-dessus. Cela peut être une limitation pour des études dans lesquelles l'AFM et l'imagerie de fluorescence sont combinés.

Le dispositif commercial le plus commun (FX 5000 de système de tension FlexCell) pour appliquer une contrainte mécanique aux cellules intègre un système de vide contrôlable appliquer effort de traction sur une membrane tout en se déplaçant dans et hors du plan optique. La conception de la membrane et pince présentée ici de créer un champ de déformation bi-axiale où la souche est isotrope et reste dans le plan allowing imagerie en temps réel. Avec des modifications mineures à la conception de la membrane, la civière peut produire modes d'étirement uniaxial ainsi. Si les cellules sont d'abord ensemencées sur une membrane dilatée, dans le plan des charges de compression peuvent également être appliquées. Le dispositif est en mesure d'atteindre les deux niveaux physiologiques et pathologiques de la souche. En résumé, un nouveau périphérique et protocoles ont été élaborés qui peut être utilisé pour appliquer une contrainte mécanique à des cellules qui peut être imagée en utilisant la microscopie par fluorescence et AFM nano-indentation vivre.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Les auteurs souhaitent remercier que Fedex Institut de technologie de l'Université de Memphis pour leur soutien. Les auteurs tiennent à remercier les étudiants du groupe de projet de conception principal au Département de génie mécanique à l'Université de Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn du département Université de Memphis Technologie du génie pour le contrôle moteur , et le Dr Bin Teng et Mme Charlean Luellen pour leur aide dans la culture cellulaire. Ce travail a été soutenu par K01 HL120912 (ER) et R01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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