Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi

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Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

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Abstract

Introduction

Nel corso degli ultimi 30 anni, i progressi in materia di farmaci immunosoppressori sono diminuiti rigetto del trapianto a causa di rigetto acuto, ma il rigetto cronico rimane una sfida. La manifestazione principale del rigetto del trapianto cardiaco cronico è arteriosclerosi trapianto (TA) 1,2. Questa condizione è caratterizzata da iperplasia intimale e vasomotoria disfunzione delle arterie allogenico e si sviluppa come risultato di immunologica Il targeting delle cellule muscolari lisce endoteliali e dal sistema immunitario ricevente. La gestione mirata del sistema vascolare del trapianto a causa di riconoscimento del complesso di istocompatibilità straniera peptide-major (MHC) è evidenziata dallo sviluppo di TA esclusivamente nelle arterie innesto risparmiando vasi ospitanti 3. In linea con questo è l'osservazione che TA non si verifica sperimentalmente quando il destinatario è geneticamente identico al donatore o quando il destinatario manca cellule T e B 4. Danno vascolare immuno-mediata e dysfunction provoca lo sviluppo di ispessimento intimale e fibrosi, così come l'accumulo anormale di lipidi e proteine ​​ECM, in TA 5. Ispessimento intimale tende ad essere concentrici in tutto l'albero arterioso 4-6. Perdita del trapianto e la morte di solito si verificano a seguito di ischemia progressiva derivante dalla occlusione del lume delle arterie allotrapianto 4.

Nel 1991, Mennander et al. 7 ha favorito un modello di interposizione aortica nei ratti per modellare TA. Diversi gruppi hanno successivamente adattato questo procedimento per l'utilizzo nei topi. In questo modello, i segmenti aortici trapianto allogenico di sviluppare lesioni che hanno caratteristiche analoghe a TA osservate nei trapianti clinici. Questo include ispessimento intimale caratterizzata da accumulo di cellule come-muscolari lisce e leucociti destinatari 7. Nel corso degli ultimi 2 decenni questo modello è stato utilizzato per generare importanti informazioni sui meccanismi di danno vascolare, il rifiuto e TA. Può essere noied esaminare le questioni relative alla risposta immunitaria e vascolari durante la patologia arteriosa. La scelta degli impatti antigene disadattamento la capacità di affrontare in modo appropriato a queste domande.

Trapianto attraverso le barriere complete MHC permette una valutazione completa delle risposte immunitarie che sono noti per essere coinvolti nel rigetto dei trapianti d'organo. Questo include il riconoscimento delle cellule CD4 e CD8 T diretta e la destinazione di stranieri peptide-MHC presentato da cellule innesto di derivazione, CD4 indiretta (e possibilmente CD8) il riconoscimento delle cellule T e la destinazione dei alloantigeni innesto di derivazione presentati da antigene destinatario presentano cellule, e anticorpi riconoscimento mediata di alloantigeni sulla superficie delle cellule vascolari 8. Tuttavia, la risposta vascolare al danno in completi esperimenti MHC-non corrispondenti possono variare rispetto a quello osservato clinicamente. Johnson et al. 9 hanno mostrato che, negli innesti interposizione aortici trapiantati attraverso una barriera completa MHC disallineamento, la maggior parte dile cellule neointimal sono di origine destinatario e non di provenienza dei donatori. Questo è diverso da quello osservato nei trapianti umani, dove la maggior parte delle cellule muscolari lisce intimale di origine donatore 9,10. Per tenere conto di questa limitazione, modelli sperimentali alternativi che coinvolgono innesto attraverso piccoli disallineamenti antigene di istocompatibilità sono stati sviluppati che innescano le risposte vascolari che si avvicinano maggiormente a quelli osservati nel trapianto clinica 11. Anche se questi modelli alternativi permettono di conclusioni importanti da effettuare per quanto riguarda le risposte vascolari che guidano lo sviluppo della TA, i processi immunologici che causano il rigetto vascolare in antigene di istocompatibilità minore innesti corrispondenti non completamente ri-capitolare quelle che si verificano in ambito clinico. Ad esempio, antigeni di istocompatibilità minori sono riconosciuti male da innesto anticorpi reattivi 12. Alla luce delle considerazioni che precedono, è importante considerare il QUESTI patologicosu essere esaminato quando si sceglie il tipo di antigene disadattamento utilizzato un modello interposizione aortica. Qui si descrive un protocollo dettagliato per murino aortica interposizione innesto. Descriviamo interposizione innesto tra completi topi MHC-non corrispondenti, ma lo stesso protocollo viene utilizzato per l'innesto su altri ceppi di antigene non corrispondenti mouse.

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Protocol

Tutti i protocolli di questo studio sono stati esaminati e approvati dal comitato etico per la cura degli animali Simon Fraser University. Utilizzare Balb / CYJ (H2 d) topi donatori e topi C57BL / 6 (H2 b) destinatario per esaminare le reazioni allogeniche. I topi sono utilizzati per esperimenti di età compresa tra 8 a 12 settimane tra. Utilizzare i topi o sesso femminile o maschile. Controlli singenico costituiti da segmenti aortici da C57Bl / 6 donatori in C57BL / 6 destinatari.

1. donatore e del ricevente Preparazione

Nota: Sia il donatore e il ricevente sono anestetizzati e preparati prima della chirurgia per ridurre al minimo l'ischemia dell'innesto. Anestetici iniettabili sono utilizzati nel protocollo per impedire l'ostruzione dell'animale da attrezzature necessarie per l'erogazione di anestetici inalatori. Tuttavia, se desiderato, l'anestetico inalato è un'alternativa appropriata. Dalla iniezione iniziale degli anestetici, l'intera procedura richiede circa 90 minuti per completare. Tempo ischemica dell'innesto è meno than 30 min.

  1. Anestetizzare il mouse con iniezioni intraperitoneali di ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg, 1 mg / ml). Il mouse sarà sedato entro 10 o 15 minuti. Valutare la profondità dell'anestesia pizzicando la parte grassa del pad piede animale. Somministrare 1/3 della dose originale del cocktail anestetico, come necessario, fino a quando l'animale non presenta recesso reflex. Monitorare la frequenza respiratoria strettamente dopo ogni cocktail viene somministrato. Durante l'intervento, valutare il livello di anestesia ogni 15 minuti pizzicando la parete addominale anteriore con un paio di pinze. I topi dovrebbe rimanere profondamente anestetizzati per 60 a 90 min.
  2. Lubrificare gli occhi del topo con una pomata oftalmica per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  3. Radere capelli come vicino alla pelle il più possibile sulla regione ventrale addominale dalla metà del torace al pube. Prestare particolare attenzione a non nick tutta la pelle. Non usare la crema depilatoria perché può essere assorbito into la pelle e potrebbe essere infiammatorio.
  4. Posto l'animale in posizione supina su un asciugamano sopra il tavolo riscaldamento o pad.
  5. Pulire il sito chirurgico con uno scrub preliminare con il 2% clorexidina. Preparare una grande area di lavoro per massimizzare il campo chirurgico. Avviare lavaggio al centro del sito chirurgico e spostare verso l'esterno in modo lineare o circolare. Smaltire la garza. Ripetere questa procedura almeno 5 volte di più. Applicare un tampone di alcool preparazione alla stessa area. Una volta che l'alcol è asciutto, preparare l'area pulita con una soluzione di Betadine e drappeggio con garza sterile.

Anastomosi procedura 2. end-to-end

  1. Donor Operazione
    1. Mantenere tecnica asettica durante tutta l'operazione. Pulire tutte le superfici del controsoffitto e da tavolo chirurgico con 0,5% di soluzione di perossido di idrogeno accelerato prima dell'uso. Avvolgere e autoclave tutti chirurgiche strumenti, garze, tende e abiti prima dell'uso. Verificare la sterilità degli strumenti con un bagno turcostriscia indicatrice sterilizzatrice posto in ogni confezione. Guanti chirurgici sterili vengono usati e smaltiti tra interventi chirurgici. In caso di più interventi chirurgici, sterilizzare gli strumenti chirurgici tra impieghi con il caldo perle di vetro sterilizzatore.
    2. Posizionare il mouse donatore in posizione supina su una superficie pulita, consiglio plexiglas sottile avvolto con telo sterile sotto il microscopio operatorio a 8-30X ingrandimento.
    3. Dopo aver verificato l'anestesia chirurgica adeguati come indicato nella sezione 1.1, procedere con un intervento chirurgico.
    4. Utilizzando forbici sterili, fare un unico mediana inferiore incisione longitudinale addominale, dal pube al processo xifoideo.
    5. Usando un piccolo divaricatore, aprire le pareti addominali per esporre la cavità.
    6. Utilizzando cotone sterile con punta applicatori, ritrarre delicatamente l'intestino superiormente all'animale di sinistra e coprire con una garza inumidita con soluzione fisiologica. Spostare gli organi riproduttivi inferiormente e individuare sottorenale e la vena cava inferiore (IVC). Moisdieci tessuti esposti periodicamente con soluzione salina.
    7. Utilizzando i No. medico 5 pinze, separare l'aorta dal IVC, dal livello dell'arteria renale sinistra alla biforcazione. Utilizzare 10-0 monofilamento poliammide per legare i piccoli rami in prossimità dell'aorta.
    8. Una volta aorta del donatore è stato separato dal IVC, saturare il recipiente con soluzione salina, coprire la cavità esposta con garza inumidita e impostare il donatore parte su una zona sterile. Controllare lo stato del donatore (funzione respiratoria e cardiovascolare, e la profondità dell'anestesia) ogni 15 min. Inizia operano sul destinatario, isolando l'aorta come descritto di seguito (passaggi da 2.2.1 a 2.2.7).
    9. Una volta che l'aorta destinatario è stato separato dal IVC e mettere da parte, restituire il donatore sotto il microscopio. Morsetto a croce (prossimale e distale al segmento di interesse) dell'aorta donatore, a circa 5 mm di distanza, con due morsetti 4 millimetri microvascolari.
    10. Utilizzando le microscissors Vannas-Tübingen,transezione un piccolo segmento graft (3 a 4 mm di lunghezza) dell'aorta addominale.
    11. Utilizzando un ago 25 G 5/8 attaccato ad una siringa, svuotare l'aorta escissa con eparinizzata (100 U / ml) di soluzione salina. Assicurare la punta dell'ago non venire a contatto con il recipiente.
    12. Luogo aorta in eparina (100 U / ml) di soluzione salina in ghiaccio e mettere da parte. Mentre era ancora sotto anestesia profonda, rilasciare i morsetti microvascolari. Euthanize il donatore per dissanguamento.
    13. Impiantare la nave cedente entro 30 min di escissione. Anche se è possibile utilizzare una nave cedente per più destinatari escissione una lunghezza maggiore di aorta, mantenere il tempo ischemico per meno di 30 min.
  2. Operazione Destinatario
    1. Mantenere asettiche durante l'operazione, come nel funzionamento donatore.
    2. Posizionare il mouse destinatario in posizione supina su una tavola di plexiglas sottile avvolto con telo sterile sotto il microscopio operatorio a 8-30X ingrandimento.
    3. After garantire un'adeguata anestesia, procedere con la chirurgia quando l'animale non presenta ritiro reflex.
    4. Utilizzando forbici sterili, fare un unico mediana inferiore incisione longitudinale addominale, dal pube al processo xifoideo.
    5. Usando un piccolo divaricatore, aprire le pareti addominali per esporre la cavità.
    6. Utilizzando cotone sterile con punta applicatori, ritrarre delicatamente l'intestino superiormente all'animale di sinistra e coprire con una garza inumidita con soluzione fisiologica. Spostare gli organi riproduttivi inferiormente e individuare sottorenale e IVC. Bagnare i tessuti esposti periodicamente con soluzione salina.
    7. Separare l'aorta dal IVC, dal livello dell'arteria renale sinistra alla biforcazione. Se necessario, utilizzare 10-0 suture monofilamento poliammide per legare i piccoli rami vicino l'aorta.
    8. Morsetto a croce (prossimale e distale al segmento di interesse) dell'aorta, a circa 5 mm di distanza, con due morsetti 4 millimetri microvascolari.
    9. Utilizzando le microscissors Vannas-Tübingen, fare un unico aortotomy orizzontale e resecare un piccolo segmento (non più di 0.5 mm) dell'aorta addominale per accogliere il donatore trapianto aortica.
    10. Lavare l'aorta escissa con eparinizzata (100 U / ml) di soluzione salina. Il trapianto aortico donatore dovrebbe essere di lunghezza adeguata per collegare le estremità aortica transected del destinatario.
    11. Posizionare il donatore trapianto aortica in posizione ortotopica e anastomosi fine innesto del donatore alla fine del destinatario, che corrisponde con la graft orientamento anatomico con quello del destinatario.
    12. Afferrare il externa tunica della nave e rovesciare leggermente con le pinze No.5 mediche. Utilizzando le pinze, guidare l'ago per il gol del 10-0 poliammide monofilamento sutura attraverso l'intero spessore della parete del vaso, al fine di garantire l'innesto aortico donatore nave resezione del destinatario. Prestare attenzione al fine di garantire che l'apertura nave non è chiusa a causa to cucitura involontaria della parete di fondo del recipiente.
    13. Per punti continui, posizionare suture alle 9 entrambe le estremità superiore ed inferiore dell'innesto. Partendo all'estremità superiore dell'innesto dalle 3, anastomosi le estremità resecate con 2 suture corsa e fissare la sutura al soggiorno suture.
      1. Capovolgere l'innesto sopra e continuare la sutura corsa per dorsale parte della nave, incontrando il soggiorno provenienza di sutura. Fissare senza applicare molta pressione sulla nave. Ripetere la sutura per l'anastomosi inferiore.
        Nota: i punti staccati iniziano allo stesso modo come la sutura continua con l'eccezione che la nave è anastomizzato con tre punti separati fra le suture. Tempo anastomosi è di solito di 20 min.
    14. Una volta che l'anastomosi è completa, rilasciare il morsetto microvascolare distale per permettere al sangue di fluire retrogrado e controllo delle perdite dei siti anastomizzato. Se vi è una perdita, immediately posizionare un punto di chiudere il sito difettoso. Se non c'è sanguinamento nei siti, quindi rilasciare il morsetto prossimale.
    15. Esaminate il trapianto e verificare che non vi siano ostacoli sangue nel trapianto, e prossimale e distale del vaso del destinatario. Vigoroso modello impulso nel recipiente sia il destinatario del donatore e di una indicazione primaria che il sangue scorre liberamente. Utilizzando la coppia di pinze, afferrare delicatamente un'estremità delle suture e rovesciare leggermente il vaso di ispezionare la parete di fondo del recipiente.
      Nota: Non ci dovrebbero essere increspature della parete del vaso ad entrambe le estremità dei siti anastomizzato. Scadente flusso sanguigno dopo la rimozione dei morsetti è un segno di trombosi.
    16. Utilizzando cotone punta applicatori, restituire l'intestino nella cavità addominale.
    17. Con il porta-aghi Castroviejo e pinze Graefe, chiudere la parete addominale con 5-0 punti di sutura in polipropilene con cucitura continua. Chiudere lo strato di pelle con la stessasuture con chiusura sottocuticolare.
    18. Somministrare immediatamente Torbugesic (1 mg / kg) im al termine del trapianto.
    19. Dare immediatamente, nell'ordine, Atipamezolo (1 mg / kg), ketoprofene (5 mg / kg) e riscaldato soluzione sottocutanea Ringer lattato.
    20. Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, collocare topi in una gabbia riscaldato sotto una coperta acqua per una notte (12 ore). Durante il periodo di anestetico recupero, posizionare gli animali da solo in un ambiente pulito zona libera asciutta,. Linea gabbia (autoclave) con carta assorbente pulita e regolare la temperatura della coperta di acqua a circa 20 a 22 ° C. Fornire crocchette secche e umide ad libitum sul pavimento della gabbia.
      Nota: Una componente importante di cura post-chirurgica è l'osservazione dell'intervento animali e opportuno, come richiesto, durante il recupero da anestesia e chirurgia. L'intensità necessaria di monitoraggio varia con l'animale e potrebbe essere maggiore durante il periodo di recupero anestetico immediato come compared a tardi nel recupero post-operatorio.
    21. Continuamente controllare gli animali che hanno subito l'anestesia monitorati fino a che non guariscono completamente. L'animale deve essere in grado di mantenere senza aiuto decubito sternale e deve apparire calmo e priva di dolore prima di poter essere lasciato incustodito.
    22. Dare buprenorfina (0,1 mg / kg BID) e ketoprofene (5 mg / kg SID) per un periodo di tre giorni, sia per via sottocutanea.
    23. Monitorare cardiovascolare e la funzione respiratoria, la temperatura corporea, e il dolore post-operatorio o disagio durante il recupero dall'anestesia per un minimo di tre giorni. Cura supplementare può essere richiesto, come ad esempio la somministrazione di analgesici e altri farmaci, e liquidi per via parenterale per ridurre al minimo la disidratazione e la perdita di elettroliti.
    24. Valutare il successo della chirurgia dei trapianti osservando la funzione motoria degli arti posteriori. Completa il successo del trapianto comporta ostruita flusso di sangue al dell'arto posteriore e la coda, che dovrebbe essere immediata recupero del Animal, e il recupero completo senza paralisi degli arti posteriori il secondo giorno

3. Tissue Collection

Nota: punti finali predeterminata gamma 3-60 giorni a seconda del tipo di analisi desiderata e la natura del disallineamento antigene. In generale, ispessimento intimale è robusto a 30 giorni dopo il trapianto attraverso complete MHC ceppi di topi non corrispondenti.

  1. Anestetizzare il mouse con iniezioni intraperitoneali di ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg, 1 mg / ml). Valutare la profondità dell'anestesia pizzicando la parte grassa del pad piede animale. Procedere con la chirurgia quando l'animale non presenta ritiro reflex.
  2. Pulire il sito chirurgico con acqua e termina con il 70% di alcol.
  3. Posto l'animale in posizione supina su un vassoio rivestito con tampone assorbente.
  4. Aprire la cavità addominale con una incisione longitudinale grande linea mediana. Posizionare un divaricatore di auto-mantenimento per esporre la cavità, l'una IVCd l'aorta addominale.
  5. Separare delicatamente il segmento aortico donatore trapiantato dalla vicina IVC con un paio di n medico 5 pinze. Prestare particolare attenzione a non mettere a nudo l'avventizia della nave trapiantato.
  6. Esporre la cavità toracica tagliando attraverso le nervature lungo entrambi i lati della colonna vertebrale toracica fino toracico. Riflettere parete toracica anteriore superiormente per esporre il pericardio e fissare la gabbia toracica con un paio di emostatico.
  7. Una volta che il cuore è esposto, inserire un ago 25 G 5/8 (attaccato ad una siringa) nel ventricolo sinistro ea filo con 0,1 ml di soluzione salina eparinizzata (100 U / ml).
  8. Utilizzando un paio di forbici, rimuovere l'atrio destro per permettere al sangue, soluzione salina eparinizzata e fissativo per lasciare il corpo durante la perfusione. Profumato l'animale con 5 ml di paraformaldeide al 4% o fino a quando viene eseguito il liquido chiaro. Rimuovere il cuore al fine di garantire l'eutanasia.
  9. Excise trapiantato segmento nave e immergere nel 4% paraformaldeide per non più di un'ora. Impostare la nave trapiantato in OCT (temperatura ottimale di taglio) matrice e flash freeze. Sezione della nave in un criostato fissato a 8 spessori um. Sezioni Macchia con Ematossilina e eosina e / o Verhoeff-van Gieson (van Gieson) macchia elastico.

4. Analisi morfologica di innesti

Nota: TA è caratterizzata da ispessimento intimale 13. In questo modello, ispessimento intimale e una conseguente riduzione delle dimensioni del lume sono riflettenti della gravità delle lesioni vascolari immuno-mediata. Controlli Syngraft vengono utilizzati per determinare le caratteristiche di base delle navi, in assenza di risposte immunitarie allogenici. Questi controlli permettono anche la valutazione del danno arterioso che si verifica come risultato della procedura chirurgica. Non ci dovrebbero essere ispessimento intimale in syngrafts.

  1. Per esaminare ispessimento intimale e luminale occlusione, misurare l'area all'interno della cellula endotelialestrato, lamina interna elastica (IEL) e lamina elastica esterna (EEL) su elastici van Gieson segmenti delle arterie macchiato con un software di analisi delle immagini. I parametri di seguito possono essere utilizzati per determinare i cambiamenti arteriosi riflettenti di TA.
    1. Misurare l'area intimale assoluto: area all'interno della lamina elastica interna - l'area all'interno dello strato di cellule endoteliali. Ciò fornisce una misura assoluta di espansione intimale, che è il segno distintivo di TA.
    2. Misurare l'area mediale assoluto: area all'interno della lamina elastica esterna - area all'interno della lamina elastica interna. Questo fornisce una misura assoluta di degradazione mediale o di crescita, che occasionalmente può verificarsi a seguito di variazioni immunomediate a questa regione della parete del vaso.
    3. Misurare l'area totale del vaso come l'area all'interno della lamina elastica esterna. Questo fornisce una misura del rimodellamento nave che coinvolge espansione o costrizione di un'arteria a causa di danno immunologico.
    4. Misural'intima / Media: (area all'interno della lamina elastica interna - area all'interno dello strato di cellule endoteliali) / (area all'interno della lamina elastica esterna - area all'interno della lamina elastica interna). Ciò fornisce una misura relativa di espansione intimale e normalizza le differenze di dimensioni delle navi.
    5. Misurare la Restringimento% Luminal: [(area all'interno della lamina elastica interna - area all'interno dello strato di cellule endoteliali) / area con la lamina elastica interna)] * 100. Questo fornisce una misura del grado di occlusione del lume, che deriva da una combinazione di espansione intimale e rimodellamento (verso l'interno o verso l'esterno) della parete del vaso.

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Representative Results

In questo modello, l'aorta addominale da un topo Balb / CYJ è interposto in aorta sottorenale di un / 6 ricevente C57Bl. Questo permette una valutazione completa di alloimmuni risposte che colpiscono le arterie trapianto allogenico. Danno vascolare Immune-mediata in questo modello inizia risposte riparative vascolari che culminano in ispessimento dell'intima, restringimento del lume e il reclutamento di cellule immunitarie (figure 1 e 2). Questi criteri agiscono come uno-out lettura per la gravità della alloimmuni risposte, rigetto vascolare e TA. Il successo della procedura può essere valutata dallo sviluppo di robusta ispessimento intimale dei segmenti delle arterie allogenico e l'assenza di ispessimento intimale nei controlli syngraft. Clinicamente immunosoppressione rilevante può essere utilizzato con questo modello ad assomigliare più da vicino il trapianto clinico. Questo modello può essere utilizzato anche con animali transgenici per studiare l'effetto di specifiche proteine ​​/ percorsi in un alloimmuni rispostes abbiamo fatto 14.

Alloinnesto segmenti aortici sviluppare ispessimento intimale

L'ammontare del danno vascolare allogenico immuno-mediata è stata esaminata quantificando ispessimento intimale e restringimento del lume in segmenti aortici innestate al giorno 30 post-trapianto. Segmenti delle arterie alloinnesto sviluppano significativo ispessimento intimale e l'occlusione del lume e nessun cambiamento si osservano in syngraft segmenti di controllo delle arterie (Figura 1).

L'accumulo di leucociti nei segmenti aortica trapianto allogenico.

L'accumulo di leucociti nelle arterie allogenico è stata esaminata quantificando il numero di cellule T CD4, le cellule T CD8 e macrofagi (Mac-3) 15 mediante immunoistochimica. Mac-3 è stato usato per colorare per macrofagi in questo studio, anche se altri marcatori, come F4 / 80, possono anche essere utilizzati 16. Cellule T CD4, le cellule CD8 T e macrofagi sono stati rilevati nel l'intima delle arterie alloinnesto (Figura 2)

Figura 1
Figura 1: L'analisi istologica delle arterie innestati (A) segmenti dell'aorta addominale da singenici topi e allogenici erano interposti nelle aorte addominali resezione di topi C57BL / 6.. Le arterie innestati sono state raccolte in 30 giorni post-trapianto. Sono mostrati microfotografie rappresentativi di van elastico Giesen arterie macchiati. Barra di scala = 0.1 mm = 100 micron (B) Schema che illustra come i diversi strati della nave sono misurate, L:. Lumen, E: strato endoteliale, I: intima, M: i media, A:. Avventizia (C) Quantificazione del intima / media e rapporto% restringimento del lume da 30 giorni singenici (n = 3) e allogenici (n = 6) trapianti, * p <0,05.= "_ Blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: l'accumulo di cellula immunitaria nelle arterie trapianto allogenico. Microfotografie rappresentativi di trapianto allogenico di segmenti aortici immunoistochimica colorate per (A) CD4, (B) CD8, e (C) Mac-3 e di contrasto con ematossilina sono mostrati. Scala bar = 0.1 mm = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo descritto un protocollo per interposizione aortica innesti in topi che è utile per studiare il rigetto vascolare immunomediata e TA. Questo modello può essere utilizzato per analizzare le cause dei TA nonché lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. E 'stato usato in passato per stabilire un ruolo essenziale di immunità adattativa, citotossici risposte delle cellule T, le risposte effettrici CD4 T cellule citochine-mediata, e danni trapianto mediata da anticorpi in TA 14,17-21. Trapianto Artery nei topi è difficile a causa delle piccole dimensioni evidente dell'animale; tuttavia, con la pratica e la dovuta diligenza, interventi chirurgici di successo può essere realizzato. Il successo dipende la pervietà del vaso. Ciò comporta assicurando che l'innesto non sia danneggiato gestendo impropriamente nave con una pinza, costrizione del lume del vaso, sutura della parete posteriore della nave, e la sutura ripetitiva dello stesso sito. Perdita della nave è anche problematico e richiede attenzione per postaNsure che il numero e la posizione dei punti sono divisi in modo uniforme intorno alla parete del vaso. È anche essenziale che l'ischemia innesto è ridotto al minimo per meno di 30 minuti. Con questo, un tasso di successo superiore al 95% può essere raggiunto.

L'aorta è il più grande arteria del mouse in modo tale procedura è il più semplice approccio microchirurgico per indagare rigetto vascolare in questo modello animale. Inoltre, il segmento aortico si innesta in una posizione fisiologicamente rilevanti, sperimenta normale flusso di sangue, e ispessimento intimale sviluppa rapidamente. L'altro modello principale utilizzato per la valutazione del rigetto vascolare e TA è il trapianto cardiaco eterotopico, che ha il vantaggio di esaminare lo sviluppo di TA in arterie coronariche e nel contesto del trapianto di cuore che è lo scenario clinico più rilevante per TA. Tuttavia, trapianti di cuore eterotopici sono collocati in una posizione non fisiologica all'interno del corpo (di solito anastamosed alla vena cava eaorta nell'addome) e il cuore non pompa sangue attraverso i ventricoli a causa della natura retrograda della fornitura di sangue al cuore trapiantato. Come tale, la natura del flusso di sangue attraverso l'albero coronarico potrebbe essere diverso da quello normalmente sperimentato da vascolatura coronarica 22,23. Inoltre, le strategie per superare il rigetto acuto del cuore deve essere incorporato per valutare cambiamenti arteriosi. In entrambi i modelli, è importante scegliere con attenzione il tipo di antigene disadattamento utilizzato per essere in grado di affrontare adeguatamente questioni specifiche relative al rigetto vascolare e TA.

In sintesi, aortico interposizione innesto è una tecnica potente per studiare danni arteriosa immuno-mediata e TA. Può essere masterizzato routine con la pratica e diligenza da parte del ricercatore. Una volta masterizzato, questa procedura può essere modificata per l'innesto interposizione di altri segmenti arteriosi, come la carotide, thpresso può consentire l'esame delle ulteriori questioni scientifiche. Inoltre, l'uso di questo modello può essere esteso oltre lo studio del trapianto. Interposizione innesto delle arterie può essere utilizzato per introdurre segmenti arteriosi da modificata (es transgenici o lipidi alimentati) in topi omologhi non modificato, o viceversa, per isolare gli effetti biologici di molecole alle cellule delle pareti dell'arteria contro cellule della parete non-arteriose 24 , 25.

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Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Canadian Institutes of Health Research e Heart and Stroke Foundation of BC & Yukon (CCM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/ml Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/ml Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 BD REF 309309
25 G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27 G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 - Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

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References

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