Modelo rato de rejeição vascular induzida por Aloimune e Transplante Arteriosclerose

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Nos últimos 30 anos, os avanços em drogas imunossupressoras têm diminuído a rejeição do enxerto por rejeição aguda, mas a rejeição crônica permanece um desafio principal. A principal manifestação da rejeição do transplante cardíaca crônica é a arteriosclerose de transplante (TA) 1,2. Esta condição é caracterizada por hiperplasia intimai e disfunção vasomotora das artérias aloenxerto e se desenvolve como um resultado de direccionamento imunológico de células endoteliais e do músculo liso pelo sistema imune receptor. O direcionamento específico da vasculatura do enxerto devido ao reconhecimento do complexo de histocompatibilidade estrangeira peptídeo-major (MHC) é realçada pelo desenvolvimento de TA exclusivamente nas artérias do enxerto, poupando os navios de acolhimento 3. De acordo com isto é a observação de que não ocorre TA experimentalmente quando o receptor é geneticamente idêntico ao doador ou quando o receptor não tem células T e B 4. Lesão vascular mediada imunologicamente e dysfunction faz com que o desenvolvimento de espessamento da íntima e fibrose, assim como a acumulação anormal de lípidos e proteínas da MEC, em TA 5. Espessamento da íntima tende a ser concêntrica ao longo de toda a 4-6 árvore arterial. Perda do enxerto e morte geralmente ocorrem como resultado de isquemia progressiva resultante da oclusão luminal de artérias allograft 4.

Em 1991, Mennander et al. 7 pioneira um modelo de interposição aórtica em ratos para modelar TA. Diversos grupos têm subsequentemente adaptado este procedimento para utilização em ratos. Neste modelo, os segmentos da aorta de aloenxerto desenvolver lesões que apresentam características comparáveis ​​às TA observada em transplantes clínicos. Isso inclui espessamento da íntima caracterizada pelo acúmulo de células musculares lisas-like e leucócitos beneficiários 7. Nos últimos 2 décadas este modelo tem sido usado para gerar importantes insights sobre os mecanismos de lesão vascular, rejeição e TA. Pode ser-nosed para analisar as questões relacionadas com as respostas imunes e vasculares durante patologia arterial. A escolha dos impactos antígeno de incompatibilidade a capacidade de abordar adequadamente essas questões.

Transplante através das barreiras de MHC completos permite uma avaliação abrangente das respostas imunes que são conhecidos por serem envolvidos na rejeição de transplante de órgãos. Isso inclui o reconhecimento direto de células CD4 e CD8 T e direcionamento da política externa peptídeo-MHC apresentado por células derivadas do enxerto, CD4 indireta (e, possivelmente, CD8) reconhecimento de células T e segmentação de aloantígenos derivados do enxerto apresentados por antigénio destinatário que apresentam células e por anticorpos reconhecimento mediado de aloantigénios na superfície das células vasculares 8. No entanto, a resposta vascular à lesão em experiências de MHC desemparelhado completos pode ser diferente do que a observada clinicamente. Johnson et al., 9 revelaram que, em enxertos transplantados interposição da aorta através de uma barreira completa de MHC incompatibilidade, a maioria deas células são de origem neointimais receptor e não de origem do doador. Isto é diferente do que a observada em transplantes humanos, onde a maioria das células do músculo liso da íntima são de origem do doador 9,10. Para ter em conta esta limitação, modelos experimentais alternativos que envolvem enxerto através menores descasamentos dos antígenos de histocompatibilidade têm sido desenvolvidos que desencadeiam respostas vasculares que mais se assemelham aos observados no transplante clínico 11. Embora estes modelos alternativos permitem conclusões importantes a serem feitas sobre as respostas vasculares que impulsionam o desenvolvimento de TA, os processos imunológicos que causam rejeição vascular em antígeno de histocompatibilidade menor enxertos incompatíveis não completamente re-capitular aquelas que ocorrem no ambiente clínico. Por exemplo, antígenos de histocompatibilidade menores são reconhecidos mal por enxerto anticorpos reativos 12. Dadas as considerações acima, é importante considerar o questi patológicono a ser examinado quando se escolhe o tipo de antigénio incompatibilidade utilizado num modelo interposição aórtica. Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado para murino enxertia interposição aórtica. Nós descrevemos enxerto de interposição entre camundongos MHC-incompatíveis completos, mas o mesmo protocolo é usado para enxerto através de outras linhagens de camundongos incompatíveis antígeno.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os protocolos deste estudo foram revisados ​​e aprovados pelo comitê de ética de cuidados de animais Simon Fraser University. Use Balb / CYJ (H2 d) camundongos doadores e camundongos C57BL / 6 (H2 b) beneficiários para analisar reações alogênicos. Os ratos são utilizados em experiências, com idades entre 8 a 12 semanas. Use camundongos ou femininos ou masculinos. Controlos singeneicos consistem de segmentos de aorta de ratinhos C57BL / 6 dadores em receptores C57BL / 6.

1. doador e receptor Preparação

Nota: Tanto o dador eo receptor são anestesiados e preparados antes da cirurgia para minimizar a isquemia do enxerto. Anestésicos injectáveis ​​são usados ​​no protocolo para evitar a obstrução do animal por equipamentos necessários para a entrega de anestésicos inalados. No entanto, se desejado, anestésico inalatório é uma alternativa adequada. A partir da injecção inicial de os anestésicos, todo o procedimento leva cerca de 90 minutos a completar. Tempo de isquemia do enxerto é menos than 30 min.

  1. Anestesiar o rato com injecções intraperitoneais de cetamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg; 1 mg / mL). O rato vai ser sedado dentro de 10 a 15 min. Avaliar a profundidade da anestesia por beliscar a parte gorda da almofada do pé animal. Administrar 1/3 da dose original do cocktail de anestésico, conforme necessário, até que o animal não apresentam reflexo de retirada. Monitorar a freqüência respiratória de perto depois de cada cocktail é administrada. Durante a cirurgia, avaliar o nível de anestesia a cada 15 min, apertando a parede abdominal anterior com um par de pinças. Os ratos devem permanecem profundamente anestesiados por 60 a 90 min.
  2. Lubrifique os olhos do rato com uma pomada oftálmica para evitar a secura sob anestesia.
  3. Raspar o cabelo tão perto da pele quanto possível sobre a região ventral abdominal do meio-tórax ao púbis. Tenha especial cuidado para não nick qualquer pele. Não utilizar creme depilatório, pois pode ser absorvida into da pele e pode ser inflamatória.
  4. Colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma toalha sobre a mesa de aquecimento ou pad.
  5. Limpe o local da cirurgia com uma esfoliação preliminar com 2% de cloro. Prepare uma grande área de trabalho para maximizar o campo cirúrgico. Iniciar a esfregar no centro do local cirúrgico e mover-se para o exterior de uma forma linear ou circular. Descarte a gaze. Repita este procedimento pelo menos cinco vezes mais. Aplique uma compressa embebida em álcool prep para a mesma área. Uma vez que o álcool é seco, prepare a área limpa com solução Betadine e cortina com gaze estéril.

2. End-to-end Anastomosis Procedimento

  1. Doador de Operação
    1. Manter uma técnica asséptica durante toda a operação. Limpe todas as superfícies da bancada e mesa cirúrgica com solução de 0,5% de peróxido de hidrogênio acelerado antes da utilização. Enrole e autoclave todos os instrumentos, gazes cirúrgicas, cortinas e roupas antes de usar. Verifique a esterilidade dos instrumentos com um vaportira indicadora esterilizador colocados em cada pacote. Luvas cirúrgicas estéreis são utilizados e eliminados entre as cirurgias. Por várias cirurgias, esterilizar os instrumentos cirúrgicos entre os usos com o esterilizador talão de vidro quente.
    2. Posicione o mouse doador em decúbito dorsal em uma placa de Plexiglas fina limpa envolvida com cortina estéril sob o microscópio cirúrgico na ampliação 8-30X.
    3. Depois de garantir anestesia cirúrgica adequada, conforme descrito no ponto 1.1, proceder com a cirurgia.
    4. Com uma tesoura estéril, fazer uma única linha média inferior incisão abdominal longitudinal, a partir do púbis ao processo xifóide.
    5. Usando um pequeno afastador, abra a parede abdominal para expor a cavidade.
    6. Usando algodão estéril derrubado aplicadores, retrair delicadamente os intestinos superiormente para o animal de esquerda e cobrir com gaze umedecida com solução salina. Mova os órgãos reprodutivos inferiormente e localize a aorta infra-renal e veia cava inferior (VCI). Moisdez os tecidos expostos periodicamente com solução salina.
    7. Usando os No. médico 5 fórceps, separar a aorta a partir da VCI, a partir do nível da artéria renal esquerda para a bifurcação. Use 10-0 suturas monofilamento de poliamida para ligar as filiais pequenas perto da aorta.
    8. Uma vez que a aorta do dador foi separada da veia cava inferior, saturar o recipiente com solução salina, cobrir a cavidade exposta com gaze humedecida e definir o doador de lado para uma área estéril. Verifique o status do doador (a função respiratória e cardiovascular, e profundidade da anestesia) a cada 15 minutos. Começar a operar no destinatário, isolando a aorta como descrito abaixo (Passos 2.2.1 a 2.2.7).
    9. Uma vez que a aorta do receptor foi separado do IVC e anular, devolver o dador sob o microscópio. Braçadeira transversal (proximal e distal ao segmento de interesse) a aorta do doador, aproximadamente 5 mm, com dois grampos microvasculares 4 milímetros.
    10. Usando a microtesoura Vannas-Tübingen,transecção um segmento de enxerto pequeno (3-4 mm de comprimento) da aorta abdominal.
    11. Usando uma agulha de 25 G 5/8 ligado a uma seringa, lave a aorta excisado com solução heparinizada (U / ml 100) solução salina. Assegurar a ponta da agulha não entra em contacto com o vaso.
    12. Aorta lugar em heparina (100 U / ml) de solução salina no gelo e reserve. Embora ainda sob anestesia profunda, solte os grampos microvasculares. Euthanize o doador por sangria.
    13. Implantar o navio dador dentro de 30 min de excisão. Embora seja possível utilizar um recipiente dador para vários receptores através da excisão de um comprimento maior da aorta, manter o tempo de isquemia para menos de 30 min.
  2. Operação Destinatário
    1. Manter uma técnica asséptica durante toda a operação, como na operação dador.
    2. Posicione o mouse destinatário em decúbito dorsal em uma placa de Plexiglas fina envolvido com cortina estéril sob o microscópio cirúrgico na ampliação 8-30X.
    3. After garantia de anestesia adequada, prosseguir com a cirurgia quando o animal não apresenta reflexo de retirada.
    4. Com uma tesoura estéril, fazer uma única linha média inferior incisão abdominal longitudinal, a partir do púbis ao processo xifóide.
    5. Usando um pequeno afastador, abra a parede abdominal para expor a cavidade.
    6. Usando algodão estéril derrubado aplicadores, retrair delicadamente os intestinos superiormente para o animal de esquerda e cobrir com gaze umedecida com solução salina. Mova os órgãos reprodutivos inferiormente e localize a aorta infra-renal e da VCI. Humedecer os tecidos expostos periodicamente com solução salina.
    7. Separa-se a aorta a partir da veia cava inferior, a partir do nível da artéria renal esquerda para a bifurcação. Se necessário, use 10-0 suturas monofilamento poliamida para ligar as filiais pequenas perto da aorta.
    8. Braçadeira transversal (proximal e distal ao segmento de interesse) na aorta, cerca de 5 mm entre si, com dois grampos microvasculares 4 milímetros.
    9. Usando os microtesouras Vannas-Tubingen, fazer uma única aortotomy horizontal e ressecção de um pequeno segmento (não mais do que 0,5 mm) da aorta abdominal para acomodar o doador do enxerto aórtico.
    10. Lave a aorta retirado com solução heparinizada (U / ml 100) salina. O doador do enxerto aórtico deve ser de comprimento apropriado para ligar as extremidades da aorta seccionados do receptor.
    11. Coloque a prótese aórtica doador na posição ortotópica e anastomose extremidade do enxerto do doador para a extremidade do receptor, correspondentes a respectiva orientação anatómica do enxerto com o do receptor.
    12. Gentilmente segure a túnica externa do navio e everter-lo um pouco usando a pinça No.5 médicos. Usando fórceps, conduzir a agulha acoplada ao monofilamento de sutura 10-0 poliamida através de toda a espessura da parede do vaso, a fim de garantir o doador do enxerto aórtico para o vaso ressecado do destinatário. Tome cuidado para garantir que a abertura navio não está fechada devido tO costura inadvertida da parede do fundo do recipiente.
    13. Para pontos contínuos, colocar suturas de ancoragem em 9:00 em ambas as suas extremidades superior e inferior do enxerto. Começando na extremidade superior do enxerto a partir de 03:00, anastomose nas extremidades ressecados com duas suturas de funcionamento e proteger o fio de sutura à sutura estadia.
      1. Virar o enxerto mais e continuar a sutura corrida para dorsal parte da embarcação, atendendo a sutura origem estadia. Fixe sem aplicar muita pressão sobre o navio. Repita a sutura para a anastomose inferior.
        Nota: As suturas interrompidas começar da mesma maneira que o fio de sutura contínua com a excepção de que o recipiente é anastomosado com três pontos separados entre as suturas de ancoragem. Tempo de anastomose é geralmente 20 min.
    14. Uma vez que a anastomose é completa, solte o grampo microvascular distal para permitir que o sangue flua retrógrada e verificar se há vazamento dos locais anastomosada. Se houver uma fuga, immediately coloque um ponto para fechar o site com defeito. Se não houver hemorragia nos locais, em seguida, solte a braçadeira proximal.
    15. Examinar o transplante e verificar que não existe obstrução arterial no enxerto, e a porção proximal e distal do vaso do destinatário. Padrão de impulso vigoroso no vaso tanto do doador e do receptor é uma indicação preliminar que o sangue está fluindo livremente. Utilizando o par de fórceps, agarre cuidadosamente uma das extremidades das suturas de ancoragem e ligeiramente everter do navio para inspeccionar a parede traseira do recipiente.
      Nota: Não deve haver nenhum enrugamento da parede do vaso em ambas as extremidades dos sítios anastomosados. Má circulação sanguínea após a remoção das pinças é um sinal de trombose.
    16. Usando algodão derrubou aplicadores, devolva o intestino para a cavidade abdominal.
    17. Com o suporte de agulha Castroviejo e fórceps Graefe, feche a parede abdominal com 5-0 suturas de polipropileno usando costura contínua. Fechar a camada de pele com a mesmasuturas usando encerramento subcuticular.
    18. Administrar Torbugesic (1 mg / kg) im imediatamente após a conclusão do transplante.
    19. Dê imediatamente, na ordem, atipamezol (1 mg / kg), cetoprofeno (5 mg / kg) e aqueceu-se por via subcutânea solução de Ringer com lactato.
    20. Imediatamente após a cirurgia, os ratos colocar em uma gaiola aquecida sob um cobertor de água durante a noite (12 h). Durante o período anestésico-recuperação, colocar os animais em paz em uma área desobstruída limpo e seco. Linha a gaiola (autoclavada), com toalhas de papel limpas e ajustar a temperatura do cobertor de água para aproximadamente 20 a 22 ° C. Fornecer croquetes secos e molhados ad libitum no chão da gaiola.
      Nota: Um componente importante dos cuidados pós-cirúrgico é a observação do animal e de intervenção apropriada, se necessário, durante a recuperação da anestesia e cirurgia. A intensidade necessária de monitorização variará com o animal e pode ser maior durante o período de recuperação anestésico imediato como compared para mais tarde na recuperação pós-operatória.
    21. Continuamente monitorar animais que têm sofrido anestesia monitorados até que eles se recuperar completamente. O animal deve ser capaz de manter decúbito esternal sem ajuda e tem de aparecer calmo e livre de dor antes que possa ser deixado sem vigilância.
    22. Submeter buprenorfina (0,1 mg / kg bid) e cetoprofeno (5 mg / kg SID) para um período de três dias, tanto por via subcutânea.
    23. Monitorar cardiovascular e função respiratória, temperatura do corpo, e dor pós-operatória ou desconforto durante a recuperação da anestesia durante um mínimo de três dias. Cuidados adicionais podem ser necessárias, como a administração de analgésicos e outros medicamentos, e fluidos parenterais para minimizar a desidratação e perda de eletrólitos.
    24. Avaliar o sucesso da cirurgia de transplante através da observação da função motora dos membros posteriores. Completo sucesso do transplante envolve o fluxo sanguíneo livre para o membro posterior e cauda, ​​que deve ser imediata após a recuperação do animai, e a recuperação completa sem paralisia dos membros traseiros, no segundo dia

Coleção 3. Tissue

Nota: Os pontos finais pré-determinado intervalo 3-60 dias, dependendo do tipo de análise desejado e da natureza do antigénio de incompatibilidade. Geralmente, espessamento da íntima é robusta no dia 30 após o transplante através de MHC estirpes completas rato incompatíveis.

  1. Anestesiar o rato com injecções intraperitoneais de cetamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg; 1 mg / mL). Avaliar a profundidade da anestesia por beliscar a parte gorda da almofada do pé animal. Prosseguir com a cirurgia quando o animal não apresenta reflexo de retirada.
  2. Limpar o local cirúrgico com água e terminando com 70% de álcool.
  3. Colocar o animal em decúbito dorsal em uma bandeja forrada com almofada absorvente.
  4. Abra a cavidade abdominal através de uma incisão longitudinal grande linha média. Coloque um afastador de auto-retenção para expor a cavidade, a uma VCId aorta abdominal.
  5. Delicadamente separar o segmento da aorta transplantado doador do IVC vizinha usando um par de fórceps 5 No. médica. Tenha especial cuidado para não retirar o adventícia do vaso transplantado.
  6. Expor a cavidade torácica, cortando através das nervuras ao longo de ambos os lados da coluna vertebral torácica todo o caminho até à entrada torácica. Reflectem a parede anterior do tórax superiormente para expor o pericárdio e garantir a caixa torácica com um par de pinça hemostática.
  7. Uma vez que o coração é exposto, inserir uma agulha 25 G 5/8 (ligada a uma seringa) para o ventrículo esquerdo e nivelada com 0,1 ml de solução salina heparinizada (100 U / mL).
  8. Utilizando um par de tesouras, remover a aurícula direita para permitir que o sangue, soro fisiológico heparinizado, e o fixador para deixar o corpo durante a perfusão. Perfundir o animal com 5 ml de paraformaldeído a 4% ou até que o fluido corre claro. Remover do coração para assegurar a eutanásia.
  9. Excise transplantado segmento de vaso e mergulhar no parágrafo 4%formaldeído para não mais do que uma hora. Defina o navio transplantadas em outubro (temperatura de corte óptima) da matriz e congelamento flash. Seção do navio sob um criostato fixado em 8 hum espessura. Seções mancha com Hematoxilina e Eosina e / ou Verhoeff-van Gieson (van Gieson) mancha elástica.

4. Análise morfológica de enxertos

Nota: TA é caracterizada por espessamento da camada íntima 13. Neste modelo, o espessamento da íntima e uma consequente redução no tamanho do lúmen são um reflexo da gravidade da lesão vascular mediada imunologicamente. Syngraft controlos são utilizados para determinar as características basais dos vasos na ausência de respostas imunitárias alogénicas. Esses controles também possibilitar a avaliação de danos arterial que ocorre como resultado do procedimento cirúrgico. Não deve haver espessamento da íntima em syngrafts.

  1. Para examinar o espessamento da íntima e oclusão luminal, medir a área dentro da célula endotelialcamada, lâmina interna elástica (IEL) e lâmina elástica externa (EEL) em segmentos de artérias elásticas coradas van Gieson com um software de análise de imagem. Os parâmetros a seguir podem ser utilizados para determinar as alterações arteriais reflectoras de TA.
    1. Medir a área da íntima absoluta: a área da lâmina elástica interna - a área dentro da camada de células endoteliais. Isso fornece uma medida absoluta de expansão da íntima, que é a marca do TA.
    2. Medir a absoluta área medial: área dentro da lâmina elástica externa - área dentro da lâmina elástica interna. Isto fornece uma medida absoluta da degradação medial ou o crescimento, que pode ocorrer ocasionalmente, como resultado de alterações mediadas pelo sistema imunológico para esta região da parede do vaso.
    3. Medir a área total do vaso, como a área da lâmina elástica externa. Isso proporciona uma medição de remodelagem vascular que envolve a expansão ou constrição da artéria, como resultado de dano imunológico.
    4. Medidada íntima / Média: (a área da lâmina elástica interna - área dentro da camada de células endoteliais) / (área da lâmina elástica externa - área da lâmina elástica interna). Isto proporciona uma medida relativa da expansão da íntima e normaliza as diferenças no tamanho do vaso.
    5. Meça o estreitamento% Luminal: [(área dentro da lâmina elástica interna - área dentro da camada de células endoteliais) / área com a lâmina elástica interna)] * 100. Isto proporciona uma medida do grau de oclusão luminal, que resulta de uma combinação de expansão e remodelação da íntima (para dentro ou para fora) da parede do vaso.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neste modelo, a aorta abdominal de um rato Balb / CYJ é interposta na aorta infra-renal de um C57BL / 6 destinatário. Isto permite uma avaliação abrangente de aloimunes respostas que visam artérias aloenxerto. Lesão vascular mediada imunologicamente neste modelo inicia respostas reparadoras vasculares que culminam em espessamento da íntima, estreitamento luminal e recrutamento de células imunitárias (Figuras 1 e 2). Estes critérios, em seguida, servir como um ler-out para a gravidade da aloimunes respostas, a rejeição vascular, e TA. O sucesso do procedimento pode ser avaliado pelo desenvolvimento de robusto espessamento da íntima dos segmentos arteriais de aloenxertos e a ausência de espessamento da íntima em controlos syngraft. Clinicamente relevante imunossupressão pode ser usado com esse modelo para se parecer mais com o transplante clínico. Este modelo também pode ser utilizado com animais transgénicos para estudar o efeito de proteínas / percursos específicos em resposta aloimune ums fizemos 14.

Segmentos aórticos aloenxerto desenvolver espessamento intimai

A quantidade de dano vascular do enxerto imune mediada foi analisada por meio da quantificação espessamento da íntima e estreitamento luminal nos segmentos de aorta enxertadas no dia 30 pós-transplante. Segmentos de artéria aloenxerto desenvolver espessamento intimal significativa e oclusão luminal e não há alterações são observados em segmentos de artéria syngraft controlo (Figura 1).

A acumulação de leucócitos em segmentos da aorta aloenxerto.

A acumulação de leucócitos em artérias de aloenxertos foi analisada por quantificação do número de células T CD4 +, células T CD8 e macrófagos (Mac-3) 15 por imuno-histoquímica. Mac-3 foi utilizado para corar para macrófagos neste estudo, embora outros marcadores, tais como F4 / 80, também pode ser utilizado 16. As células T CD4 +, células T CD8 e macrófagos foram detectados em íntima das artérias aloenxerto (Figura 2)

Figura 1
Figura 1: A análise histológica das artérias enxertadas (A) segmentos de aorta abdominal de ratinhos singeneicos e alogeneicas foram interpostos nas aortas abdominais ressecados de ratinhos C57BL / 6.. As artérias enxertadas foram colhidas aos 30 dias pós-transplante. Fotomicrografias representativas de van elástica Giesen artérias manchadas são mostrados. Barra de escala = 0,1 mm = 100 um (B) Diagrama mostrando como as diferentes camadas do recipiente é medida, L:. Lúmen, E: camada endotelial, eu: íntima, M: meios, A:. Adventícia (C) Quantificação de íntima / rácio de meios e% de estreitamento luminal 30 dias singeneico (n = 3) e alogénicos (n = 6) transplantes, * P <0,05.= "_ Blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: acumulação de células imunes em artérias de aloenxerto. Fotomicrografias representativas de segmentos de aorta de aloenxerto immunohistochemically coradas para (A), CD4, (B), CD8, e (C) Mac-3 e contrastadas com hematoxilina são mostrados. Scale bar = 0,1 mm = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nós descrevemos um protocolo para a interposição aórtica miocárdio em ratos que é útil para estudar rejeição vascular imunomediada e TA. Este modelo pode ser usado para investigar as causas de AT, bem como o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Tem sido usado no passado para estabelecer um papel essencial da imunidade adaptativa, respostas de células T citotóxicas, as respostas efectoras de células T CD4 mediada por citoquinas, e danos do enxerto mediada por anticorpos em TA 14,17-21. Artéria transplante em ratinhos é difícil devido ao pequeno tamanho óbvia do animal; no entanto, com a prática e diligência, as cirurgias bem-sucedidas pode ser realizado. O sucesso depende da permeabilidade do vaso. Este consiste em assegurar que o enxerto não é danificado pela manipulação do recipiente de modo inadequado com uma pinça, constrição do lúmen do vaso, suturando a parede traseira do recipiente, e repetitivo de sutura no mesmo local. O vazamento do navio também é problemático e requer cuidados a eNsure que o número e posição dos pontos de malha são divididos uniformemente em torno da parede do vaso. É também essencial que a isquemia do enxerto é minimizado para menos de 30 minutos. Com isso, uma taxa de sucesso superior a 95% pode ser alcançado.

A aorta é o maior artéria do rato de modo que este procedimento é a abordagem mais simples para investigar microcirúrgico rejeição vascular neste modelo animal. Além disso, o segmento da aorta é enxertado em um local fisiologicamente relevante, experimenta o fluxo de sangue normal, e espessamento da íntima se desenvolve rapidamente. O outro modelo principal utilizado para a avaliação da rejeição vascular e TA é o transplante cardíaco heterotópico, que tem a vantagem de analisar o desenvolvimento de TA em artérias coronárias e no contexto do transplante de coração que é o cenário clínico mais relevante para TA. No entanto, os transplantes cardíaco heterotópico são colocados em um local não-fisiológica dentro do corpo (geralmente anastamosed para a veia cava eaorta no abdómen) e o coração não bombeia sangue através dos ventrículos, devido à natureza retrógrada do fornecimento de sangue para o coração transplantado. Como tal, a natureza do fluxo de sangue através da circulação coronária pode ser diferente do que é normalmente experimentado pela vasculatura coronária 22,23. Além disso, as estratégias para superar a rejeição aguda do coração devem ser incorporadas a fim de avaliar as alterações arteriais. Em ambos os modelos, é importante escolher cuidadosamente o tipo de incompatibilidade de antigénio utilizadas, a fim de ser capaz de tratar adequadamente questões específicas relacionadas com a rejeição vascular e TA.

Em resumo, enxerto de interposição aórtica é uma técnica poderosa para investigar dano arterial imune mediada e TA. Ele pode ser rotineiramente dominado com a prática e diligência por parte do pesquisador. Uma vez dominado, este procedimento pode ser modificado para o enxerto de interposição de outros segmentos arteriais, tais como a artéria carótida, thno pode permitir o exame de questões científicas adicionais. Além disso, a utilização deste modelo pode ser estendido para além do estudo de transplante. A interposição de enxerto das artérias pode ser utilizada para introduzir segmentos arteriais de modificada (por exemplo, ou transgénicos alimentados com lipido) em ratinhos homólogos não modificados, ou vice-versa, para isolar os efeitos biológicos de moléculas a células de parede arterial em comparação células de parede arterial não-24 , 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por doações dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e Heart and Stroke Foundation of BC & Yukon (JCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/ml Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/ml Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 BD REF 309309
25 G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27 G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 - Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
  2. Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
  3. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  4. Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
  5. Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
  6. Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
  7. Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
  8. Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
  9. Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
  10. Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
  11. Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
  12. Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
  13. Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
  14. Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
  15. Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
  16. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
  17. Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
  18. Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
  19. Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
  20. Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
  21. Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
  22. Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
  23. Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
  24. Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
  25. Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics