Modelo rato de rejeição vascular induzida por Aloimune e Transplante Arteriosclerose

Summary

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Abstract

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

Introduction

Nos últimos 30 anos, os avanços em drogas imunossupressoras têm diminuído a rejeição do enxerto por rejeição aguda, mas a rejeição crônica permanece um desafio principal. A principal manifestação da rejeição do transplante cardíaca crônica é a arteriosclerose de transplante (TA) ^1,2. Esta condição é caracterizada por hiperplasia intimai e disfunção vasomotora das artérias aloenxerto e se desenvolve como um resultado de direccionamento imunológico de células endoteliais e do músculo liso pelo sistema imune receptor. O direcionamento específico da vasculatura do enxerto devido ao reconhecimento do complexo de histocompatibilidade estrangeira peptídeo-major (MHC) é realçada pelo desenvolvimento de TA exclusivamente nas artérias do enxerto, poupando os navios de acolhimento ^3. De acordo com isto é a observação de que não ocorre TA experimentalmente quando o receptor é geneticamente idêntico ao doador ou quando o receptor não tem células T e B ^4. Lesão vascular mediada imunologicamente e dysfunction faz com que o desenvolvimento de espessamento da íntima e fibrose, assim como a acumulação anormal de lípidos e proteínas da MEC, em TA ^5. Espessamento da íntima tende a ser concêntrica ao longo de toda a ^4-6 árvore arterial. Perda do enxerto e morte geralmente ocorrem como resultado de isquemia progressiva resultante da oclusão luminal de artérias allograft ^4.

Em 1991, Mennander et al. ⁷ pioneira um modelo de interposição aórtica em ratos para modelar TA. Diversos grupos têm subsequentemente adaptado este procedimento para utilização em ratos. Neste modelo, os segmentos da aorta de aloenxerto desenvolver lesões que apresentam características comparáveis ​​às TA observada em transplantes clínicos. Isso inclui espessamento da íntima caracterizada pelo acúmulo de células musculares lisas-like e leucócitos beneficiários ^7. Nos últimos 2 décadas este modelo tem sido usado para gerar importantes insights sobre os mecanismos de lesão vascular, rejeição e TA. Pode ser-nosed para analisar as questões relacionadas com as respostas imunes e vasculares durante patologia arterial. A escolha dos impactos antígeno de incompatibilidade a capacidade de abordar adequadamente essas questões.

Transplante através das barreiras de MHC completos permite uma avaliação abrangente das respostas imunes que são conhecidos por serem envolvidos na rejeição de transplante de órgãos. Isso inclui o reconhecimento direto de células CD4 e CD8 T e direcionamento da política externa peptídeo-MHC apresentado por células derivadas do enxerto, CD4 indireta (e, possivelmente, CD8) reconhecimento de células T e segmentação de aloantígenos derivados do enxerto apresentados por antigénio destinatário que apresentam células e por anticorpos reconhecimento mediado de aloantigénios na superfície das células vasculares ^8. No entanto, a resposta vascular à lesão em experiências de MHC desemparelhado completos pode ser diferente do que a observada clinicamente. Johnson et al., ⁹ revelaram que, em enxertos transplantados interposição da aorta através de uma barreira completa de MHC incompatibilidade, a maioria deas células são de origem neointimais receptor e não de origem do doador. Isto é diferente do que a observada em transplantes humanos, onde a maioria das células do músculo liso da íntima são de origem do doador ^9,10. Para ter em conta esta limitação, modelos experimentais alternativos que envolvem enxerto através menores descasamentos dos antígenos de histocompatibilidade têm sido desenvolvidos que desencadeiam respostas vasculares que mais se assemelham aos observados no transplante clínico ^11. Embora estes modelos alternativos permitem conclusões importantes a serem feitas sobre as respostas vasculares que impulsionam o desenvolvimento de TA, os processos imunológicos que causam rejeição vascular em antígeno de histocompatibilidade menor enxertos incompatíveis não completamente re-capitular aquelas que ocorrem no ambiente clínico. Por exemplo, antígenos de histocompatibilidade menores são reconhecidos mal por enxerto anticorpos reativos ^12. Dadas as considerações acima, é importante considerar o questi patológicono a ser examinado quando se escolhe o tipo de antigénio incompatibilidade utilizado num modelo interposição aórtica. Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado para murino enxertia interposição aórtica. Nós descrevemos enxerto de interposição entre camundongos MHC-incompatíveis completos, mas o mesmo protocolo é usado para enxerto através de outras linhagens de camundongos incompatíveis antígeno.

Protocol

Todos os protocolos deste estudo foram revisados ​​e aprovados pelo comitê de ética de cuidados de animais Simon Fraser University. Use Balb / CYJ (H2 d) camundongos doadores e camundongos C57BL / 6 (H2 b) beneficiários para analisar reações alogênicos. Os ratos são utilizados em experiências, com idades entre 8 a 12 semanas. Use camundongos ou femininos ou masculinos. Controlos singeneicos consistem de segmentos de aorta de ratinhos C57BL / 6 dadores em receptores C57BL / 6. 1. d…

Representative Results

Neste modelo, a aorta abdominal de um rato Balb / CYJ é interposta na aorta infra-renal de um C57BL / 6 destinatário. Isto permite uma avaliação abrangente de aloimunes respostas que visam artérias aloenxerto. Lesão vascular mediada imunologicamente neste modelo inicia respostas reparadoras vasculares que culminam em espessamento da íntima, estreitamento luminal e recrutamento de células imunitárias (Figuras 1 e 2). Estes critérios, em seguida, servir como um ler-out para a gr…

Discussion

Nós descrevemos um protocolo para a interposição aórtica miocárdio em ratos que é útil para estudar rejeição vascular imunomediada e TA. Este modelo pode ser usado para investigar as causas de AT, bem como o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Tem sido usado no passado para estabelecer um papel essencial da imunidade adaptativa, respostas de células T citotóxicas, as respostas efectoras de células T CD4 mediada por citoquinas, e danos do enxerto mediada por anticorpos em TA ^{14,17-21.</s…}

Materials

Name	Company	Catalogue	Comments
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	Strain# 000664
Balb/cBYJ	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ mL	Ketalean	DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/mL	Rompum	DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/mL	Anafen	DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/mL	Torbugesic	DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/mL	Reckitt Benckiser	B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution	Antisedan	DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1000 units/mL	McKesson Distribution	DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment	Alcon	DIN 02082519
Stereomicroscope	Leica	M80
0.9% Sodium Chloride, sterile	Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile	Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 mL	Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads	Loris
Povidone Iodine	Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v	Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament	AROSurgical Instruments	T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns	Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle	Ethicon	8698G
1 ml Syringe	BD	REF 309659
10 ml Syringe	BD	REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28G 1/2	BD	REF 309309
25G 7/8, hypodermic needle	BD	REF 305124
27G 1/2, hypodermic needle	BD	REF 305109
Colibri Retractor- 1.5cm spread 4cm	Fine Science Tools	17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock	Fine Science Tools	00072-14
Supergrip forceps, S&T	Fine Science Tools	00632-11
Medical No.5 forceps	Fine Science Tools	11253-20
Lexer Baby Scissors	Fine Science Tools	14078-10
Micro Adson forceps serrated	Fine Science Tools	11018-12
Vannas-Tubingen microscissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length	Fine Science Tools	00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1×2 teeth	Fine Science Tools	11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws	Fine Science Tools	12565-14
Hot glass bead sterilizer	Inotech 250	IS-250 – Steri-250
Non-woven gauzes	Progene
Cotton Tipped Applicators	Puritan
Beard Trimmer	Wahl
Heating pad	Sunbeam