Mouse Model van Allo-immuun geïnduceerde Vascular Afwijzing en Transplant Aderverkalking

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

In de afgelopen 30 jaar, hebben de vooruitgang in de immunosuppressieve geneesmiddelen afstoting verminderd als gevolg van acute afstoting, maar chronische afstoting blijft een grote uitdaging. De belangrijkste manifestatie van chronische harttransplantaatafstoting is transplantatie arteriosclerose (TA) 1,2. Deze aandoening wordt gekenmerkt door intimale hyperplasie en vasomotorische disfunctie van allograft slagaders en ontwikkelt als gevolg van immunologische targeting van endotheliale en gladde spiercellen van de ontvanger immuunsysteem. De specifieke gerichtheid van de graft vasculatuur gevolg van opname van vreemd peptide-major histocompatibility complex (MHC) wordt benadrukt door de ontwikkeling van TA uitsluitend graft slagaders en spaart ontvangende vaartuigen 3. In overeenstemming hiermee is de waarneming dat TA niet experimenteel optreden wanneer de ontvanger genetisch identiek aan de donor of wanneer de ontvanger mist T- en B-cellen 4. Immuungemedieerde vasculaire letsel en dysfunction veroorzaakt de ontwikkeling van intimale verdikking en fibrose, alsook de afwijkende accumulatie van lipiden en ECM eiwitten in TA 5. Intimaverdikking neigt concentrische het gehele arteriële boom 6/4 is. Transplantaatverlies en overlijden doorgaans het gevolg zijn van progressieve ischemie gevolg van luminale occlusie van arteriën 4 allograft.

In 1991, Mennander et al. 7 pionierde een aorta tussenkomst model in ratten tot model TA. Verschillende groepen zijn vervolgens aangepast deze procedure voor gebruik bij muizen. In dit model, allograft aorta segmenten ontwikkelen letsels die hebben eigenschappen vergelijkbaar TA waargenomen in klinische transplantaties. Dit omvat intimale verdikking gekenmerkt door de accumulatie van gladde spier-achtige cellen en leukocyten ontvanger 7. De laatste 2 decennia is dit model gebruikt om belangrijke inzicht in de mechanismen van vasculaire verwonding, afwijzing en TA genereren. Het kan onsed te vragen met betrekking tot het immuunsysteem en vasculaire reacties tijdens arteriële pathologie te onderzoeken. De keuze van het antigeen mismatch van invloed op de mogelijkheid om de juiste te pakken deze vragen.

Transplantaties binnen volledige MHC-barrières maakt een uitgebreide evaluatie van immuunresponsen die bekend is dat ze betrokken zijn bij orgaantransplantatie afstoting. Dit omvat directe CD4 en CD8 T-cel herkenning en doelgerichtheid van de buitenlandse peptide-MHC door graft-afgeleide cellen, indirecte CD4 (en eventueel CD8) T-cel herkenning en doelgerichtheid van graft-afgeleide alloantigenen door ontvangende antigeen presenterende cellen en antilichaam gemedieerde opname van allo-antigenen op vasculaire celoppervlakken 8. Echter de vasculaire respons op verwonding in volledige MHC-mismatch experimenten anders dan die klinisch waargenomen worden. Johnson et al. 9 blijkt dat, bij aorta-interpositie grafts getransplanteerd over een volledige MHC mismatch barrière meestede neointimale cellen zijn van de ontvanger oorsprong en niet die van donor oorsprong. Dit is anders dan waargenomen in menselijke transplantaties waar de meeste intimale gladde spiercellen van donor oorsprong 9,10. Om rekening te houden met deze beperking, hebben alternatieve experimentele modellen die gepaard enten over minor histocompatibility antigen mismatches ontwikkeld dat vasculaire reacties die meer lijken op deze waargenomen in klinische transplantatie 11 triggeren. Hoewel deze alternatieve apparaten kan belangrijke conclusies worden getrokken ten aanzien van de vasculaire reacties die de ontwikkeling van TA, de immunologische processen die vasculaire afstoting bij minor histocompatibility antigen mismatched grafts veroorzaken niet volledig opnieuw overgeven die welke voorkomen in de klinische setting drijven. Zo worden kleine histocompatibiliteitsantigenen slecht herkend door graft reactieve antilichamen 12. Gezien de bovenstaande overwegingen, is het belangrijk om de pathologische questi overwegenop wordt onderzocht bij het kiezen van het type antigeen mismatch gebruikt in een aorta tussenkomst model. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor muizen aorta tussenkomst enten. We beschrijven tussenvoeging enten tussen volledige MHC-incompatibele muizen maar hetzelfde protocol wordt gebruikt voor enting tussen ander antigeen mismatched muizenstammen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protocollen die in deze studie werden beoordeeld en door de Simon Fraser University Dierverzorging ethische commissie goedgekeurd. Gebruik Balb / CYJ (H2 d) donor muizen en C57BL / 6 (H2 b) ontvangende muizen allogène reacties te onderzoeken. Muizen worden gebruikt voor experimenten in de leeftijd van 8-12 weken. Gebruik een vrouwelijke of mannelijke muizen. Syngene controles bestaan ​​uit aortische segmenten uit C57BL / 6 donors in C57BL / 6 ontvangers.

1. donor en ontvanger Voorbereiding

Opmerking: Zowel de donor en ontvanger worden verdoofd en voorbereid voor de operatie ischemie van het transplantaat te beperken. Injecteerbare anesthetica worden gebruikt in het protocol bij obstructie van het dier te voorkomen door apparatuur die nodig is voor de levering van inhalatie anesthetica. Indien gewenst, inhalatie verdovingsmiddel een geschikt alternatief. Uit de eerste injectie van anesthesie, het hele procedure duurt ongeveer 90 minuten in beslag. Ischemische tijd van het transplantaat minder than 30 min.

  1. Verdoven de muis met intraperitoneale injecties van ketamine (100 mg / kg, 10 mg / ml) en xylazine (10 mg / kg, 1 mg / ml). De muis wordt verdoofd binnen 10 tot 15 min. Beoordeel de diepte van de anesthesie door knijpen de vette deel van het dier voet pad. Dien 1/3 van de oorspronkelijke dosis van het anestheticum cocktail, indien nodig, totdat het dier vertoont geen terugtrekking reflex. Bewaken van de ademfrequentie nauw na elke cocktail wordt toegediend. Tijdens de operatie, een beoordeling van de anesthesie elke 15 minuten door afklemmen van de voorste buikwand met een pincet. De muizen moeten blijven diep geanesthetiseerd 60 tot 90 min.
  2. Smeer ogen van de muis met een oogzalf tot droog voorkomen terwijl onder narcose.
  3. Scheer haar zo dicht mogelijk bij de huid mogelijk op de buik ventrale gebied van de midden-thorax aan het schaambeen. Wees vooral voorzichtig niet te nick elke huid. Laat ontharingscrème niet gebruiken omdat het ik kan worden geabsorbeerdnto de huid en inflammatoire zou kunnen zijn.
  4. Plaats het dier in rugligging op een handdoek boven de verwarming tafel of pad.
  5. Reinig de chirurgische site met een voorlopige scrub met 2% chloorhexidine. Bereid een grote werkruimte aan het chirurgische veld te maximaliseren. Begin schrobben in het midden van de operatieplaats en naar buiten in een lineaire of cirkelvormige wijze. Gooi het gaas. Herhaal deze procedure ten minste 5 keer. Breng een alcohol prep pad naar hetzelfde gebied. Zodra de alcohol droog is, de voorbereiding van de schone ruimte met Betadine-oplossing en laken met een steriel gaasje.

2. End-to-end Anastomosis Procedure

  1. Donor Operation
    1. Handhaaf aseptische techniek tijdens de gehele operatie. Maak alle aanrecht en chirurgische tafelbladen met 0,5% versnelde waterstofperoxideoplossing vóór gebruik. Wikkel en autoclaaf alle chirurgische instrumenten, gazen, gordijnen en jassen voor gebruik. Controleer steriliteit van de instrumenten met een stoomsterilisator indicator strip geplaatst in elke verpakking. Steriele chirurgische handschoenen worden gebruikt en weggegooid tussen ingrepen. Voor meerdere operaties, steriliseren de chirurgische instrumenten tussen toepassingen met de hete glaskraal sterilisator.
    2. Plaats de donor muis in rugligging op een schone, dunne Plexiglas board omwikkeld met steriel laken onder de operationele microscoop bij 8-30X vergroting.
    3. Na een adequate chirurgische anesthesie, zoals beschreven in paragraaf 1.1, doorgaan met de operatie.
    4. Met behulp van een steriele schaar, maken een middellijn lagere longitudinale incisie in de buik van het schaambeen naar de xyphoid proces.
    5. Met behulp van een kleine retractor, opent de buik muren om de holte bloot te leggen.
    6. Met behulp van steriele wattenstaafje applicators, zachtjes trekken de darmen superieur aan het dier links en bedekken met een gaasje bevochtigd met een zoutoplossing. Beweeg de voortplantingsorganen inferiorly en zoek de infrarenale aorta en de vena cava inferior (IVC). Moistien van de blootgestelde weefsels periodiek met zoutoplossing.
    7. De medische No. 5 forceps, scheid de aorta van de IVC, vanaf het niveau van de linker renale arterie naar de bifurcatie. Gebruik 10-0 polyamide monofilament hechtingen aan de kleine takken ligeren nabij de aorta.
    8. Zodra aorta van de donor is gescheiden van de IVC, verzadigen het vat met een zoutoplossing, bedekken de blootgestelde holte met vochtig gaas en zet de donor apart op een steriele omgeving. De status van de donor (ademhalings- en cardiovasculaire functie, en de diepte van anesthesie) elke 15 min. Begin met die op de ontvanger, het isoleren van de aorta zoals hieronder beschreven (stappen 2.2.1 tot 2.2.7).
    9. Wanneer de ontvanger aorta is gescheiden van de IVC en laat terug de donor onder de microscoop. Kruisklem (proximaal en distaal van het segment van belang) de donor aorta ongeveer 5 mm van elkaar, twee 4 mm microvasculaire klemmen.
    10. Met behulp van de microscissors Vannas-Tübingen,doorsnijden een transplantaatsegment (3-4 mm lang) van de abdominale aorta.
    11. Met behulp van een 25 G 08/05 naald bevestigd aan een injectiespuit, spoel de uitgesneden aorta met heparine (100 U / ml), zoutoplossing. Zorg ervoor dat de punt van de naald niet in contact komt met het vat komen.
    12. Plaats aorta in heparine (100 U / ml) zoutoplossing op ijs en zet apart. Hoewel nog steeds onder diepe narcose, laat de microvasculaire klemmen. Euthanaseren de donor door verbloeding.
    13. Implanteren de donor vaartuig binnen 30 min van uitsnijding. Hoewel het mogelijk is één donor vat voor meerdere ontvangers gebruikt door uitsnijden van een grotere lengte van de aorta, houdt de ischemische tot minder dan 30 min.
  2. Ontvanger Operation
    1. Handhaaf aseptische techniek tijdens de gehele operatie, zoals in donor operatie.
    2. Plaats de ontvanger muis in rugligging op een dunne plexiglas bord omwikkeld met steriel laken onder de operationele microscoop bij 8-30X vergroting.
    3. After adequate anesthesie, verder met operatie wanneer het dier vertoont geen terugtrekking reflex.
    4. Met behulp van een steriele schaar, maken een middellijn lagere longitudinale incisie in de buik van het schaambeen naar de xyphoid proces.
    5. Met behulp van een kleine retractor, opent de buik muren om de holte bloot te leggen.
    6. Met behulp van steriele wattenstaafje applicators, zachtjes trekken de darmen superieur aan het dier links en bedekken met een gaasje bevochtigd met een zoutoplossing. Beweeg de voortplantingsorganen inferiorly en zoek de infrarenale aorta en IVC. Bevochtig de blootgestelde weefsels periodiek met zoutoplossing.
    7. Scheid de aorta van de IVC, vanaf het niveau van de linker renale arterie naar de bifurcatie. Gebruik indien nodig 10-0 polyamide monofilament hechtingen aan de kleine takken in de buurt van de aorta afbinden.
    8. Kruisklem (proximaal en distaal van het segment van belang) de aorta ongeveer 5 mm van elkaar, twee 4 mm microvasculaire klemmen.
    9. De microscissors Vannas-Tübingen, maak een horizontale aortotomy en resectie een klein segment (niet meer dan 0,5 mm) van de abdominale aorta naar de donor aortaprothese tegemoet.
    10. Spoel de uitgesneden aorta met heparine (100 U / ml), zoutoplossing. De donor aorta graft moeten van de juiste lengte zijn om doorsneden aorta uiteinden van de ontvanger aan te sluiten.
    11. Plaats de donor aortaprothese in de orthotope positie en anastomoseren graft einde van de donor op het einde van de ontvanger, die overeenkomen met de respectieve implantaat anatomische oriëntatie het ontvangende organisme.
    12. Voorzichtig grijpen van de tunica externa van het schip en Evert het iets met de medische No.5 tang. Met behulp van de tang, rijdt de naald naar 10-0 polyamide monofilament hechtmateriaal door de volledige dikte van de vaatwand teneinde de donor aorta-implantaat te bevestigen aan operatief weggenomen vaartuig de ontvanger. Let erop dat de opening vaartuig niet is afgesloten vanwege to onbedoelde stikken van de achterwand van het vat.
    13. Voor continue hechtingen plaatst verblijf hechtingen om 9:00 in zowel de bovenste en onderste einden van het transplantaat. Vanaf het bovenste uiteinde van het transplantaat uit 03:00, anastomose de gereseceerd uiteinden met 2 hechtingen lopen en zet de hechting aan het verblijf hechtdraad.
      1. Flip het transplantaat over en blijven de lopende hechtdraad om een ​​deel van het schip dorsale, aan de oorsprong verblijf hechtdraad. Beveiligde zonder toepassing veel druk op het vat. Herhaal het hechten van de onderste anastomose.
        Opmerking: De onderbroken hechtingen begint net als de continue hechting behalve dat het vaartuig anastomose drie gescheiden hechtingen tussen het verblijf hechtingen. Anastomose is meestal 20 min.
    14. Zodra de anastomose is voltooid, laat de distale microvasculaire klem om retrograde bloed te laten stromen en te controleren op lekkage van de geanastomoseerd sites. Bij een lekkage, immediately plaats een steek om de defecte plaats te sluiten. Als er geen bloeden op de plaatsen, dan is de proximale klem los.
    15. Onderzoek de transplantatie en controleer of er geen bloed obstructie in de graft, en de proximale en distale gedeelte van het schip van de ontvanger. Krachtige impuls patroon in vat zowel de donor en de ontvanger is een primaire indicatie dat het bloed vrij kan stromen. Met behulp van de pincet voorzichtig grijpen ene einde van het verblijf hechtingen en iets buiten keren vaartuig naar de achterwand van het vaartuig inspecteren.
      Opmerking: Er mag geen plooien van de vaatwand worden aan beide zijden van de anastomose plaatsen. Slechte doorbloeding na verwijdering van de klemmen is een teken van trombose.
    16. Met behulp van wattenstaafje applicators, de terugkeer van de darmen in de buikholte.
    17. Met de Castroviejo naaldhouder en Graefe pincet, sluit de buikwand met 5-0 polypropyleen hechtingen met een continue stiksels. Sluit de huidlaag met dezelfdehechtingen gebruikt subcutane afsluiting.
    18. Dien Torbugesic (1 mg / kg) im onmiddellijk na beëindiging van het transplantaat.
    19. Onmiddellijk geven, in de volgorde, Atipamezole (1 mg / kg), ketoprofen (5 mg / kg) en verwarmd Ringer-lactaatoplossing subcutaan.
    20. Onmiddellijk na de operatie, plaatst muizen in een verwarmde kooi onder water deken 's nachts (12 uur). Tijdens de narcose-herstelperiode, plaatst de dieren alleen in een schone, droge vrije ruimte. Lijn de kooi (geautoclaveerd) met schone papieren handdoeken en stel de temperatuur van het water deken ongeveer 20 tot 22 ° C. Zorg voor droge en natte brokjes ad libitum op de kooi vloer.
      Opmerking: Een belangrijk onderdeel van postoperatieve zorg is de observatie van de dieren en passende interventie, indien nodig, tijdens het herstel van de anesthesie en chirurgie. De noodzakelijke intensiteit van de controle varieert met het dier en kan groter zijn in de directe verdoving herstelperiode compared later in postoperatief herstel.
    21. Voortdurend toezicht op dieren hebben ondergaan anesthesie gevolgd tot ze volledig te herstellen. Moet het dier in staat zijn om zonder hulp borstligging te behouden en het moet rustig en vrij van pijn verschijnen voordat het onbeheerd worden achtergelaten.
    22. Geef Buprenorfine (0,1 mg / kg BID) en ketoprofen (5 mg / kg SID) gedurende drie dagen zowel subcutaan.
    23. Monitor cardiovasculaire en respiratoire functie, lichaamstemperatuur en postoperatieve pijn of ongemak tijdens het herstel van anesthesie gedurende ten minste drie dagen. Extra zorg kan nodig zijn, zoals de administratie van analgetica en andere drugs, en parenterale vloeistoffen om uitdroging en elektrolyten verlies te minimaliseren.
    24. Beoordelen van het succes van de transplantatie door het observeren van de motorische functie van de achterpoten. Compleet succes van de transplantatie omvat onbelemmerde bloedstroom naar de achterste ledematen en staart, die onmiddellijk na herstel van de anim moetal, en volledig herstel zonder verlamming van de achterpoten op de tweede dag

3. Tissue Collection

Opmerking: Vooraf bepaalde eindpunten variëren 3-60 dagen afhankelijk van het type analyse gewenst is en de aard van het antigeen mismatch. In het algemeen, intimale verdikking robuust op dag 30 na transplantatie over volledige MHC mismatch muizenstammen.

  1. Verdoven de muis met intraperitoneale injecties van ketamine (100 mg / kg, 10 mg / ml) en xylazine (10 mg / kg, 1 mg / ml). Beoordeel de diepte van de anesthesie door knijpen de vette deel van het dier voet pad. Ga verder met operatie wanneer het dier vertoont geen terugtrekking reflex.
  2. Reinig de chirurgische site met water en eindigend met 70% alcohol.
  3. Plaats het dier in rugligging op een dienblad vol met absorberende pad.
  4. Open de buikholte met een grote middellijn longitudinale incisie. Plaats een self-behoud oprolmechanisme aan de holte bloot te leggen, de IVC eend de abdominale aorta.
  5. Voorzichtig scheiden de getransplanteerde donor aortasegment van de naburige IVC met een paar medische No. 5 forceps. Wees vooral voorzichtig de adventitia van de getransplanteerde schip niet te strippen.
  6. Maak de borstholte door snijden door de ribben langs beide zijden van de ribbenkast tot aan het borstingang. Weerspiegelen de voorste borstwand superieur aan het hartzakje bloot te leggen en te beveiligen de ribbenkast met een paar hemostaat.
  7. Zodra het hart is blootgesteld Plaats een 25 G 08/05 naald (bevestigd aan een spuit) in de linker ventrikel en het spoelen met 0,1 ml van heparine (100 U / ml), zoutoplossing.
  8. Met behulp van een schaar, verwijder het rechter atrium om het bloed, gehepariniseerde saline en fixatief om het lichaam tijdens perfusie verlaten. Perfuseren het dier met 5 ml 4% paraformaldehyde of totdat de vloeistof helder is. Verwijder het hart om euthanasie te garanderen.
  9. Accijnzen getransplanteerd segment vat en onder te dompelen in 4% paraformaldehyde niet langer dan een uur. Stel de getransplanteerde schip in oktober (optimale snijden temperatuur) matrix en flash bevriezen. Sectie van het vaartuig onder een cryostaat ingesteld op 8 um dikte. Stain secties met Hematoxyline & Eosine en / of Verhoeff-van Gieson (van Gieson) elastische vlek.

4. morfologische analyse van Enten

Opmerking: TA wordt gekenmerkt door intimale verdikking 13. In dit model, intimale verdikking en een resulterende verkleining van de lumen reflecterend zijn van de ernst van de immuun-gemedieerde vasculaire verwonding. Syngraft controles worden gebruikt om de basislijn kenmerken van de vaartuigen te bepalen bij afwezigheid van allogene immuunresponsen. Deze controles ook in staat de evaluatie van arteriële schade die optreedt ten gevolge van de chirurgische procedure. Er mag geen intimale verdikking in syngrafts zijn.

  1. Om intimaverdikking en luminal occlusie onderzoeken, meet het gebied binnen de endotheelcellenlaag, interne elastische lamina (IEL) en externe elastische lamina (EEL) op elastiek van Gieson gekleurd slagader segmenten met een beeld analyse software. De volgende parameters kunnen worden gebruikt om arteriële veranderingen weerspiegelt TA bepalen.
    1. Meet de absolute intima gebied: gebied binnen de interne elastische lamina - het gebied binnen de endotheliale cellaag. Dit geeft een absolute meting van intimale groei, die kenmerkend is voor TA.
    2. Meet de absolute mediale gebied: gebied binnen de externe elastische lamina - gebied binnen de interne elastische lamina. Dit geeft een absolute meting van mediale afbraak of groei, die soms kunnen optreden als gevolg van immuungemedieerde wijzigingen in dit gebied van de vaatwand.
    3. Meet de totale vaartuig gebied als het gebied binnen de externe elastische lamina. Dit verschaft een meting van het vaartuig remodeling waarvan uitbreiding of vernauwing van de slagader als gevolg van immunologische schade omvat.
    4. Maatregelde intima / media: (gebied binnen de interne elastische lamina - gebied binnen de endotheliale cellaag) / (gebied binnen de externe elastische lamina - gebied binnen de interne elastische lamina). Dit verschaft een relatieve maat voor intimale expansie en normaliseert verschillen in grootte vat.
    5. Meet het% vernauwing van het lumen: [(gebied binnen de interne elastische lamina - gebied binnen de endotheliale cellaag) / gebied met de interne elastische lamina)] * 100. Dit verschaft een maat voor de omvang van luminale occlusie, ten gevolge van een combinatie van intimale groei en hermodellering (binnen of naar buiten) van de vaatwand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In dit model wordt de abdominale aorta van een Balb / CYJ muis geplaatst in de infrarenale aorta van een C57BL / 6 ontvanger. Dit maakt een uitgebreide evaluatie van alloimmune reacties die allograft slagaders richten. Immuungemedieerde vasculaire schade in dit model initieert vasculaire herstellende reacties die leiden tot intimale verdikking luminale vernauwing en rekrutering van immuuncellen (figuren 1 en 2). Deze criteria dienen dan als een uitlezing voor de ernst van alloimmuun reacties, vasculaire afwijzing, en TA. Het succes van de procedure kan worden beoordeeld door het ontwikkelen van robuuste intimale verdikking van allograft arteriesegmenten en de afwezigheid van intimale verdikking in syngraft controles. Klinisch relevante immunosuppressie kan worden gebruikt met dit model sterker lijken klinische transplantatie. Dit model kan ook worden gebruikt met transgene dieren om het effect van specifieke eiwitten / pathways bestuderen allo respons eens hebben we gedaan 14.

Allograft aorta segmenten ontwikkelen intimaverdikking

De hoeveelheid immuungemedieerde allograft vasculaire schade werd onderzocht door het kwantificeren intimaverdikking en luminale vernauwing in geënt aorta segmenten op dag 30 na de transplantatie. Allograft arteriesegmenten ontwikkelen significant intimale verdikking en luminale occlusie en geen veranderingen waargenomen in syngraft control arterie segmenten (Figuur 1).

Ophoping van leukocyten in allograft aorta segmenten.

De accumulatie van leukocyten in allograft slagaders werd onderzocht door het kwantificeren van het aantal CD4 T-cellen, CD8 T-cellen en macrofagen (Mac-3) 15 door immunohistochemie. Mac-3 werd gebruikt om kleur wordt macrofagen in dit onderzoek hoewel andere markers zoals F4 / 80, kan worden gebruikt 16. CD4 T-cellen, CD8 T-cellen en macrofagen werden aangetroffen de intima van de arteriën allograft (figuur 2)

Figuur 1
Figuur 1: Histologische analyse van geënte bloedvaten (A) Abdominale aorta segmenten van allogene en syngene muizen werden geplaatst in de abdominale aorta weggesneden van C57BL / 6-muizen.. De geënte slagaders werden geoogst op dag 30 na de transplantatie. Vertegenwoordiger microfoto van elastiek van Giesen gekleurd slagaders worden getoond. Schaal bar = 0,1 mm = 100 urn (B) diagram hoe de verschillende lagen van het vaartuig gemeten, L:. Lumen, E: endotheellaag, I: intima, M: media, A:. Adventitia (C) Kwantificering van intima / media ratio en% luminale vernauwing van 30 dagen syngene (n = 3) en allogene (n = 6) transplantaten, * P <0,05.= "_ Blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Immune cel accumulatie in allograft slagaders. Representatieve microfoto's van transplantaatafstoting aortische segmenten immunohistochemisch gekleurd (A) CD4, (B) CD8, en (C) Mac-3 en tegengekleurd met hematoxyline getoond. Schaal bar = 0,1 mm = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wij hebben een protocol beschreven voor aorta tussenplaatsing enting in muizen die bruikbaar zijn voor het bestuderen van immuungemedieerde vasculaire afstoting en TA is. Dit model kan worden gebruikt om de oorzaken van TA, alsook de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën onderzocht. Het werd in het verleden een essentiële rol adaptieve immuniteit, cytotoxische T-cel responsen, cytokine gemedieerde CD4 T cel effector responsen en antilichaam-gemedieerde graft schade vaststellen TA 14,17-21. Artery transplantatie in muizen moeilijk vanwege de duidelijke kleine grootte van het dier; Echter, met de praktijk en due diligence, succesvolle operaties kan worden bereikt. Succes hangt af van de openheid van het vat. Dat wil zeggen dat bij het implantaat niet wordt beschadigd door onjuist hanteren van het vaartuig met een pincet, vernauwing van het lumen van het vat, hechten van de achterwand van het vat, en repetitieve hechten van dezelfde site. Lekkage van het schip is ook problematisch en vereist zorg aan eNSure dat het aantal en de positie van de steken gelijkmatig verdeeld over de vaatwand. Het is ook essentieel dat graft ischemie wordt beperkt tot minder dan 30 minuten. Hiermee kan een slagingspercentage van meer dan 95% worden bereikt.

De aorta is de grootste slagader in de muis, zodat deze procedure is de eenvoudigste microchirurgische benadering voor het onderzoeken van vasculaire afstoting bij deze diermodellen. Ook is het aortasegment geënt in een fysiologisch relevant locatie, ervaart normale bloedstroom en intimale verdikking ontwikkelt zich snel. De andere belangrijke model voor het beoordelen van vasculaire afstoting en TA is heterotope harttransplantatie, die het voordeel waarin de ontwikkeling van TA in kransslagaders en in de context van harttransplantatie dat het meest relevante klinische scenario voor TA is. Echter, heterotope harttransplantatie in een niet-fysiologisch locatie geplaatst in het lichaam (gewoonlijk anastamosed de vena cava enaorta in de buik) en het hart geen bloed door de ventrikels pompen vanwege de retrograde aard van de bloedtoevoer naar het getransplanteerde hart. Als zodanig kan de aard van de bloedstroom door de coronaire boom anders wat normaal ervaren door de coronaire vasculatuur 22,23 zijn. Ook strategieën te overwinnen acute afstoting van het hart moet om arteriële veranderingen te evalueren worden opgenomen. In beide modellen is het belangrijk om zorgvuldig kiezen welk type antigen mismatch gebruikt om te kunnen passende wijze specifieke vragen vasculaire afstoting en TA.

Samengevat, aorta tussenvoeging enten is een techniek voor het onderzoeken van immuungemedieerde arteriële schade en TA. Het kan routinematig worden beheerst met de praktijk en voortvarendheid van de onderzoeker. Eenmaal geleid, kan deze werkwijze worden aangepast voor tussenvoeging enten van andere arteriële segmenten, zoals de halsslagader, thbij kan het onderzoek van de aanvullende wetenschappelijke vragen in te schakelen. Ook kan het gebruik van dit model dan de studie van transplantatie verlengd. Interpositie enten van slagaders kan worden gebruikt om arteriële segmenten introduceren van gemodificeerde (bijvoorbeeld transgene of lipide-gevoede) muizen aan niet-gemodificeerde tegenhangers, of vice versa, de biologische effecten van moleculen aan slagaderwand cellen versus niet-slagaderwand cellen 24 te isoleren , 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research en Heart and Stroke Foundation van BC & Yukon (JCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/ml Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/ml Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 BD REF 309309
25 G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27 G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 - Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
  2. Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
  3. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  4. Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
  5. Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
  6. Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
  7. Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
  8. Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
  9. Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
  10. Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
  11. Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
  12. Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
  13. Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
  14. Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
  15. Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
  16. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
  17. Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
  18. Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
  19. Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
  20. Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
  21. Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
  22. Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
  23. Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
  24. Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
  25. Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics