एक जलीय माइक्रोबियल Metaproteomics कार्यप्रवाह: अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित विश्लेषण के लिए उपयुक्त tryptic पेप्टाइड्स के लिए कोशिकाओं से

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Colatriano, D., Walsh, D. A. An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis. J. Vis. Exp. (103), e52827, doi:10.3791/52827 (2015).

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Abstract

Introduction

सूक्ष्मजीवों सर्वव्यापी हैं और पृथ्वी की biogeochemical चक्र 1 में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। वर्तमान में, माइक्रोबियल समुदाय संरचना और समारोह निस्र्पक के लिए उपलब्ध कई आणविक दृष्टिकोण हैं। 4 - सबसे आम -16 rRNA जीन का विश्लेषण पर्यावरण डीएनए 2 से पीसीआर प्रवर्धित दृश्यों है। -16 RRNA जीन विश्लेषण का एक नुकसान यह है कि यह केवल चयापचय समारोह पर कम जानकारी के साथ, वंशावली पहचान और समुदाय की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करता है। Metagenomics, metatranscriptomics और metaproteomics समुदाय संरचना और चयापचय के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के रूप में इसके विपरीत, इस तरह के दृष्टिकोण। 8 - metagenomics, या जीवों का एक संयोजन के जीन की सामग्री का विश्लेषण, समुदाय 5 की संरचना और कार्यात्मक क्षमता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। शक्तिशाली है, यह कार्यात्मक संभावित चयापचय के अनुरूप नहीं हो सकता हैजीवों की गतिविधियों। एक जीव के जीनोटाइप आरएनए को लिखित और आगे एक phenotype में जिसके परिणामस्वरूप, प्रोटीन के लिए अनुवाद किया जा सकता है जिनमें से प्रत्येक की अपनी जीन, का प्रतिनिधित्व करती है। इस प्रकार, एक वातावरण में माइक्रोबियल कार्यात्मक गतिविधि की समझ में सहायता करने के लिए, बाद जीनोमिक विश्लेषण 9 प्रदर्शन किया जाना चाहिए। यह किसी भी वातावरण में लिखित रहे हैं जो जीन का पता चलता है, क्योंकि Metatranscriptomics, या शाही सेना टेप का विश्लेषण उपयोगी है। हालांकि, mRNA स्तर हमेशा की वजह से translational विनियमन, आरएनए आधा जीवन है, और कई प्रोटीन प्रतियां हर mRNA 10 के लिए उत्पन्न किया जा सकता है कि इस तथ्य को उनके इसी प्रोटीन के स्तर से मेल नहीं खाते।

इन कारणों metaproteomics के लिए अब पर्यावरण माइक्रोबायोलॉजी के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में मान्यता प्राप्त है। आम metaproteomic एक जटिल नमूने में प्रोटीन के पास पूर्ण पूरक आमतौर पर एन के माध्यम से, शुद्ध और एक साथ विश्लेषण कर रहे हैं, जहां एक बन्दूक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का उपयोग का विश्लेषण करती हैएक मास स्पेक्ट्रोमीटर पर पेप्टाइड्स और विश्लेषण में zymatic पाचन। इसके बाद मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) "पेप्टाइड फिंगरप्रिंटिंग" खोज प्रोटीन डेटाबेस से पेप्टाइड अनुक्रम और मूल के संभावित प्रोटीन (एक समीक्षा के लिए 11 देखें) निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रोटियोमिक काम जीनोमिक डेटा की उपलब्धता में वृद्धि हुई है और संवेदनशीलता और उच्च throughput प्रोटीन की पहचान और मात्रा का ठहराव 11,12 के लिए अनुमति मास स्पेक्ट्रोमीटर की सटीकता में वृद्धि करने के लिए पिछले 25 वर्षों के लिए धन्यवाद में एक लंबा सफर तय किया है। प्रोटीन जीन अभिव्यक्ति की अंतिम उत्पाद हैं, metaproteomic डेटा किसी भी पर्यावरण और क्या प्रोटीन वे व्यक्त कर रहे हैं में सक्रिय हैं, जो जीवों निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं। पर्यावरण चर के एक विशेष सेट एक जीव या समुदाय के phenotype को कैसे प्रभावित करेगा निर्धारित करने की कोशिश करते हैं तो यह फायदेमंद है। शुरू में, सागर में एमएस / एमएस आधारित metaproteomic अध्ययनों लक्षित में विशिष्ट प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गयाSAR11 समुद्री बैक्टीरिया 13 में प्रकाश संचालित प्रोटॉन पंप proteorhodopsin पर ध्यान केंद्रित पहला अध्ययन के साथ माइक्रोबियल प्रजातियों। हाल ही में, तुलनात्मक metaproteomic विश्लेषण जटिल समुदायों के बीच अंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न स्पष्ट कर दिया है। उदाहरण तटीय उत्तर पश्चिमी अटलांटिक महासागर में 14 या अंटार्कटिक प्रायद्वीप 5 में चयापचय में अस्थायी पारियों की पहचान शामिल है। अन्य अध्ययनों से एक उच्च उत्पादक तटीय उमड़ने सिस्टम 15 के लिए एक कम पोषक तत्व सागर चक्र से एक भौगोलिक आड़ा काट-साथ, उदाहरण के लिए, स्थानिक तराजू भर में प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न में बदलाव का वर्णन किया है। Metaproteomics के आगे समीक्षा के लिए हम श्नाइडर एट अल। (2010) 9 और विलियम्स एट अल। (2014) 16 सलाह देते हैं। लक्षित प्रोटिओमिक्स भी पर्यावरण 17,18 में विशिष्ट चयापचय मार्ग की अभिव्यक्ति यों के लिए हाल के वर्षों में नियोजित किया गया है।

वहाँmetaproteomic विश्लेषण में तीन मुख्य चरणों कर रहे हैं ए। पहले चरण नमूना संग्रह, सेल और प्रोटीन की एकाग्रता भी शामिल है जो नमूना तैयार है। समुद्री सूक्ष्म जीव विज्ञान में नमूना संग्रह अक्सर सामान्यतः एक 0.22 माइक्रोन कारतूस के उपयोग के साथ, मुक्त रहने माइक्रोबियल कोशिकाओं के कब्जा करने के लिए निस्पंदन द्वारा पीछा बड़ा कोशिकाओं, कणों और कण-जुड़े बैक्टीरिया को दूर करने के लिए एक पूर्व फिल्टर के माध्यम से समुद्री जल का निस्पंदन जरूरत पर जोर देता फिल्टर यूनिट 19,20। ये फिल्टर एक प्लास्टिक सिलेंडर में incased कर रहे हैं और फिल्टर यूनिट के भीतर किया जा सकता है कि एक सेल और प्रोटीन निकासी प्रोटोकॉल एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा। बायोमास प्राप्त हो जाने के बाद, कोशिकाओं में प्रोटीन निकासी के लिए अनुमति देने के लिए lysed किया जाना चाहिए। कई तरीकों guanidine एचसीएल सेल 21 और सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) आधारित सेल तरीकों सहित, नियोजित किया जा सकता है। एसडीएस जैसे डिटर्जेंट, concentrati कई प्रोटीन प्रकार झिल्ली में खलल न डालें और solubilizing में बहुत कुशल हैं, यद्यपि0.1% नीचे की ओर प्रोटीन के पाचन और एमएस विश्लेषण 22 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में के रूप में कम ons। प्रमुख चिंता का विषय आयन स्रोत 23 के अंदर रिवर्स चरण तरल क्रोमैटोग्राफी और आयन दमन या संचय की शक्ति को हल करने, trypsin पाचन क्षमता पर एसडीएस के नकारात्मक प्रभाव है।

दूसरे चरण में प्रोटीन प्रारंभिक tryptic पेप्टाइड के प्राथमिक अमीनो एसिड अनुक्रम का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि AM / Z विखंडन पैटर्न में जिसके परिणामस्वरूप, नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण के बाद enzymatic पाचन के अधीन हैं, जहां विभाजन और विश्लेषण है। विभिन्न पाचन तरीकों का इस्तेमाल किया डिटर्जेंट के प्रकार, साथ ही नीचे की ओर मास स्पेक्ट्रोमेट्री कार्यप्रवाह पर निर्भर किया जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल में, जेल से एसडीएस को हटाने के बाद 1-डी पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन किसी भी डिटर्जेंट संक्रमण को दूर करने के लिए उपयोग किया जाता है। ऐसी झिल्ली प्रोटीन के रूप में, solubilize के लिए मुश्किल हो जाता है कि प्रोटीन का विश्लेषण, उच्च ध्यान केंद्रित के उपयोग की आवश्यकताएसडीएस या अन्य डिटर्जेंट की trations। इस एसडीएस जेल वैद्युतकणसंचलन साथ संगतता के मुद्दों की ओर जाता है। एक अध्ययन का उद्देश्य प्रोटीन solubilize करने के लिए इन मुश्किल के solubilization की आवश्यकता है, ट्यूब-जेल प्रणाली 22,24 इस्तेमाल किया जा सकता है। ट्यूब-जेल विधि वैद्युतकणसंचलन के उपयोग के बिना जेल मैट्रिक्स के भीतर प्रोटीन को शामिल किया गया। इसके बाद solubilization के लिए प्रयोग किया जाता है किसी भी डिटर्जेंट प्रोटीन के पाचन से पहले हटा रहे हैं।

तीसरे चरण bioinformatic विश्लेषण है। इस चरण में एमएस / एमएस पेप्टाइड डेटा पेप्टाइड्स और प्रोटीन के नमूने में मौजूद हैं, जो निर्धारित करने के लिए अनुवाद न्यूक्लियोटाइड दृश्यों का एक डाटाबेस के खिलाफ की खोज कर रहे हैं। पेप्टाइड्स की पहचान इसके खिलाफ खोज की है डेटाबेस पर निर्भर है। समुद्री metaproteomic डेटा सामान्यतः संदर्भ जीनोम, जैसे ग्लोबल महासागर सैम्पलिंग डाटासेट के रूप में 25 metagenomic डेटा, साथ ही असभ्य ली से एकल कक्ष परिलक्षित जीनोम के शामिल डेटाबेस के खिलाफ की खोज कर रहे हैं26,27 neages। Metaproteomic डेटा 5 निकाली थी के रूप में प्रोटीन की पहचान भी एक ही नमूना से metagenomic दृश्यों का समावेश करके बढ़ाया जा सकता है।

यहाँ हम माइक्रोबियल बायोमास से एमएस / एमएस आधारित विश्लेषण के लिए उपयुक्त पेप्टाइड्स निस्पंदन द्वारा एकत्र की है और एक शाही सेना स्थिरीकरण समाधान में संग्रहीत की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल डीएनए और प्रोटीन सभी कदम प्रोटीन करने के लिए अग्रणी और डीएनए बारिश के समान हैं, इसलिए है कि एक ही नमूना से अलग होने के लिए अनुमति देता है। केवल एक फिल्टर प्रोटीन और डीएनए निष्कर्षण दोनों के लिए आवश्यक है के बाद से एक व्यावहारिक दृष्टिकोण से, कम निस्पंदन की आवश्यकता है। हम भी इस प्रोटोकॉल दो पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल का संयोजन, अनुकूलन और संशोधन के माध्यम से बनाया गया था कि स्वीकार करना चाहते हैं। सेल कदम (2011) 28। उल्लेख किया गया था एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं और घटक को पचाने में जेल ट्रिप्सिन Shevche से अनुकूलित हैNKO एट अल। (2007) 29।

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Protocol

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. एसडीएस निकासी समाधान तैयार: 0.1 एम Tris एचसीएल पीएच 7.5, 5% ग्लिसरॉल, 10 मिमी EDTA और 1% एसडीएस। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान का उपयोग कर फ़िल्टर बाँझ।
  2. Polyacrylamide जेल के लिए आवश्यक शेयर अभिकर्मकों तैयार करें।
    1. 1.5 एम Tris एचसीएल पीएच 8.8 से तैयार करें। कमरे के तापमान पर एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान का उपयोग कर फ़िल्टर बाँझ।
    2. 0.5 एम Tris एचसीएल 6.8 पीएच। कमरे के तापमान पर एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान का उपयोग कर फ़िल्टर बाँझ।
    3. 10% एसडीएस तैयार करें। फ़िल्टर कमरे के तापमान पर एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान का उपयोग कर बाँझ।
  3. जेल में trypsin पचाने और पेप्टाइड निकासी के लिए आवश्यक समाधान तैयार करें।
    1. 100 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान का उपयोग कर फ़िल्टर बाँझ।
    2. 1 एम डीटीटी शेयरों तैयार करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट और दुकान में निलंबित कर दिया।
    3. 550 मिमी iodoacetamide शेयरों तैयार करें। में निलंबित100 मिमी -80 डिग्री सेल्सियस पर अमोनियम बिकारबोनिट और दुकान।
    4. 100 एनजी तैयार / ट्रिप्सिन शेयरों μl। -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 60 μl विभाज्य और दुकान।
    5. 1% फार्मिक एसिड, 2% acetonitrile: निष्कर्षण समाधान तैयार है।
    6. 5% acetonitrile और 0.1% फार्मिक एसिड: मेजबान समाधान तैयार है।

2. आरएनए स्थिरीकरण समाधान में संरक्षित कोशिकाओं के साथ कारतूस फ़िल्टर यूनिट में सेल प्रदर्शन करना

  1. कारतूस फिल्टर यूनिट (1.5 एमएल) से और फिल्टर की luer ताला अंत में संलग्न एक 60 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में आरएनए स्थिरीकरण समाधान निष्कासित।
  2. किसी भी सेलुलर मलबे गोली 17,000 XG पर 10 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब अपकेंद्रित्र। 2.3 कदम में फिल्टर रोकना नहीं है कि यह इसलिए किया जाता है।
  3. फ्रीज / Tha से lysed है कि कोशिकाओं से होने वाले किसी भी प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए एक 10 कश्मीर ultracentrifugal फिल्टर यूनिट स्थानांतरण सतह पर तैरनेवालानमूने के डब्ल्यू। गोली नहीं छोड़ें। यह 2.5 चरण में इस्तेमाल किया जाएगा। 30 मिनट के लिए या मात्रा तक 3270 XG पर ultracentrifugal फिल्टर यूनिट की centrifugation प्रदर्शन करना लगभग 600 μl करने के लिए कम हो गया है।
  4. एक P10 टिप टिप पिघला और टिप के खुले अंत के साथ कारतूस फिल्टर यूनिट के गैर luer ताला पक्ष ब्लॉक। यह कोई निकासी बफर और बायोमास कदम 2.5-2.7 दौरान पलायन यह सुनिश्चित करेगा।
  5. 1 मिलीलीटर एसडीएस निष्कर्षण समाधान में गोली निलंबित और मूल कारतूस फिल्टर यूनिट में यह विंदुक। कारतूस फिल्टर यूनिट में पिपेट के लिए सबसे आसान तरीका है एक P1000 नोक पर एक P200 टिप चुकी है और pipetting के लिए इस दोहरे टिप का उपयोग करने के लिए है।
  6. कुल मात्रा के बारे में 2 मिलीलीटर है इसलिए कारतूस फिल्टर यूनिट के लिए एसडीएस निकासी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक संकरण ओवन में घूर्णन जबकि कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। 3 crumpled प्रयोगशाला एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के नीचे पोंछे रखें। बंद हुआ कारतूस फिल्टर यूनिट के दोनों सिरों Parafilmऔर 50 मिलीलीटर ट्यूब में कारतूस फिल्टर यूनिट डाल दिया। ढक्कन बंद करें और संकरण ओवन में ट्यूब डाल दिया।
  7. 10 मिनट के लिए जगह के बाद Sterivex एक फोम फ्लोटर पर फिल्टर और luer ताला छोर पर एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के साथ जगह में सुरक्षित है। फ्लोट और 15 मिनट के लिए एक 95 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं।
  8. शांत कारतूस फिल्टर यूनिट करते हैं और (2.6 कदम के रूप में) 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बारी बारी से।
  9. (2.3 कदम) पहले की तरह ही ultracentrifugal फिल्टर यूनिट में एक 60 मिलीलीटर सिरिंज के साथ फिल्टर से बाहर एसडीएस निष्कर्षण समाधान / सेल lysate निष्कासित। कारतूस फिल्टर यूनिट के लिए ताजा एसडीएस निकासी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और हाथ से 30 सेकंड के लिए मिश्रण, फिर 60 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग ultracentrifugal फिल्टर यूनिट में निष्कासित। यह सभी प्रोटीन हटा दिया गया है सुनिश्चित करने के लिए कारतूस फिल्टर यूनिट कुल्ला करने के लिए है।
  10. 3270 XG पर या फिल्टर यूनिट में मात्रा तक 45 मिनट के लिए ultracentrifugal फिल्टर यूनिट पर centrifugation के प्रदर्शन करना कम से कम 600 μl है।
  11. त्यागें प्रवाह के माध्यम से और ताजा एसडीएस निकासी समाधान के साथ टॉप अप ultracentrifugal फिल्टर यूनिट।
  12. एक्स जी 3270 में एक और 45 मिनट के लिए फिल्टर यूनिट अपकेंद्रित्र।
  13. दोहराएँ दो बार अधिक 2.11 और 2.12 कदम। Ultracentrifugal फिल्टर यूनिट में अंतिम मात्रा सुनिश्चित अंतिम स्पिन के अंत में सबसे कम 600 μl है।
  14. इस बिंदु पर, दो में ध्यान केंद्रित विभाजित। एक अंश डीएनए वर्षा के लिए इस्तेमाल किया और प्रोटीन वर्षा के लिए अन्य किया जाएगा।
    नोट: विभाजन राशि फ़िल्टर किया गया था कि बायोमास की राशि और उत्पादों का इरादा उपयोग करता है पर निर्भर करता है। हमारे मामले में, हम डीएनए वर्षा की दिशा में 10% और प्रोटीन वर्षा की दिशा में 90% के साथ ध्यान केंद्रित विभाजित।

3. प्रोटीन वर्षा

  1. 10 सेकंड के लिए ध्यान और भंवर में से एक मात्रा को एसीटोन (50:50): 4 संस्करणों मेथनॉल जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  2. 30 मिनट के लिए 17,000 XG पर स्पिन। सतह पर तैरनेवाला छाननाऔर गोली 1 घंटा (या सूखी जब तक) के लिए एक speedvac में शुष्क (अदृश्य हो सकता है) करते हैं।
    नोट: ओवर गोली सूखी नहीं है इस resuspend के लिए मुश्किल बना सकता है।
  3. एसडीएस निष्कर्षण समाधान के 25 μl में गोली निलंबित। तो ऊपर और नीचे pipetting द्वारा resuspend एक घंटे के लिए बैठते हैं।
  4. एक प्रोटीन परख किट और निर्माताओं के निर्देशों का उपयोग प्रोटीन यों।

4. डीएनए वर्षा

  1. सांद्र अंश के लिए एसडीएस निष्कर्षण समाधान जोड़ें 500 μl निशान तक डीएनए वर्षा के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यह कदम, समाधान की मात्रा को बढ़ाने के लिए यह आसान के साथ काम करने के लिए बना है बस।
  2. 10 सेकंड के लिए और भंवर (जैसे एमपीसी प्रोटीन वर्षा अभिकर्मक के रूप में) एक प्रोटीन वर्षा अभिकर्मक की 0.583 मात्रा में जोड़ें। आप एक सफेद वेग रूप में देखना चाहिए।
    नोट: हम भी फिनोल इस्तेमाल किया है: क्लोरोफॉर्म डीएनए निष्कर्षण तरीकों, लेकिन यह कम होने के कारण संस्करणों के लिए और अधिक कठिन है। हम उपयोग कर बेहतर डीएनए पैदावार प्राप्तएमपीसी प्रोटीन वर्षा अभिकर्मक।
  3. 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  4. एक और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और isopropanol की 0.95 खंडों को जोड़ने। 30-40 बार पलटना।
  5. अधिकतम गति से 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  6. ध्यान से छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. 70% इथेनॉल के 750 μl के साथ दो बार कुल्ला।
  8. के रूप में ज्यादा इथेनॉल pipetting द्वारा संभव के रूप में निकालें, तो हवा-सूखी।
    नोट: ओवर डीएनए सूखी नहीं इस resuspend के लिए मुश्किल बना सकता है।
  9. कम ते बफर, पीएच 8 (10 मिमी Tris एचसीएल, 0.1 मिमी EDTA) के 25 μl में Resuspend।
  10. एक dsDNA परख किट और निर्माताओं के निर्देशों का उपयोग डीएनए यों। इसकी गुणवत्ता की जांच करने के लिए डीएनए के 3 μl पर agarose जेल (1%) वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करते हैं।

प्रोटीन की 5. एसडीएस पृष्ठ जेल

  1. नमूना बफर तैयार (950 μl Laemmli नमूना बफर और 50 μl β-mercaptoethanol)। </ Li>
  2. प्रोटीन की 15 ग्राम के लिए इसी मात्रा या नमूना बफर के बराबर मात्रा के लिए 20 μl की एक अधिकतम जोड़ें और 4 मिनट के लिए उबाल लें। एसडीएस पृष्ठ प्रदर्शन किया जा सकता है जब तक नमूने अब -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. एक 5% एक्रिलामाइड स्टैकिंग जेल के साथ 10% एक्रिलामाइड को हल करने के जेल तैयार करें।
  4. नमूनों और एक प्रोटीन की सीढ़ी के 4 μl के साथ जेल लोड करें। 250 केडीए सीढ़ी मार्कर तक लगातार 120 वी पर जेल चला बस को हल करने के लिए जेल पहुंच गया है।
  5. निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार दाग आधारित एक Coomassie का उपयोग कर जेल दाग।

6. में जेल ट्रिप्सिन डाइजेस्ट और पेप्टाइड निष्कर्षण

नोट: 6.10 तक यहां से सभी कदम प्रदूषण को कम करने के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. प्रत्येक लेन के लिए 10 केडीए सीढ़ी चिह्न के तहत अतिरिक्त जेल काट दिया। प्रत्येक लेन अलग एमएस / एमएस पर विश्लेषण किया जाएगा। सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए 1 मिमी x 1 मिमी वर्गों में प्रत्येक लेन कट और सब squa जगहएक कम बाध्यकारी सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में लेन से रिस। सभी गलियों के लिए इस दोहराएँ। (1% एसिटिक एसिड बाहर सुखाने और कटौती करने के लिए मुश्किल होता जा रहा से जेल को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)।
    नोट: संदूषण कम से कम इस स्तर पर महत्वपूर्ण है, इसलिए जेल टुकड़ा करने की क्रिया जेल बनाने के लिए इस्तेमाल किया कांच एसडीएस पृष्ठ जेल मोल्ड पर एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है।
  2. डी-दाग
    1. प्रत्येक कम बाध्यकारी ट्यूब, करीब टोपी में 100 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के 50 μl बांटना और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. Acetonitrile, करीब टोपी के 50 μl बांटना और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. महाप्राण और 150 μl त्यागें।
    4. दोहराएँ 6.2.1 और 6.2.2 कदम।
    5. महाप्राण और 95 μl त्यागें।
  3. निर्जलीकरण
    1. 50 μl acetonitrile, करीब टोपी बांटना और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। महाप्राण और 45 μl त्यागने और 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  4. कमी
    1. 100 मिमी AMM में पतला 50 μl डीटीटी (10 मिमी, बांटनाonium बिकारबोनिट), करीब टोपी और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  5. Alkylation
    1. (100 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट में पतला 55 मिमी), 50 μl iodoacetamide, करीब टोपी बांटना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    2. Acetonitrile, करीब टोपी के 100 μl बांटना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। महाप्राण और 195 μl त्यागें।
  6. धुलाई
    1. 50 μl अमोनियम बाइकार्बोनेट, करीब टोपी बांटना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. Acetonitrile, करीब टोपी के 50 μl बांटना और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। महाप्राण और 120 μl त्यागें।
  7. निर्जलीकरण
    1. 50 μl acetonitrile, करीब टोपी बांटना और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। महाप्राण और 45 μl त्यागें।
    2. Acetonitrile के 50 μl बांटना, 5 मिनट इंतज़ार करो।
    3. महाप्राण और 75 μl त्यागने और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  8. पाचन
    1. 25-30 μl एनजी 6 के बग़ैर / यू (trypsin μlntil सब जेल टुकड़े) कवर कर रहे हैं। बंद टोपी और कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (4.5 घंटा न्यूनतम) सेते हैं।
    3. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं।
  9. निष्कर्षण और पेप्टाइड स्थानांतरण
    1. निकासी के समाधान के 30 μl बांटना और बर्फ पर 30 मिनट के लिए ढक्कन के साथ कवर किया।
    2. महाप्राण 30 μl और एक नया लेबल कम बाध्यकारी ट्यूब में aspirated मात्रा बांटना।
    3. निकासी के समाधान के 12 μl और (जेल) के साथ मूल ट्यूब में acetonitrile के 12 μl बांटना। बंद टोपी और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. नया ट्यूब में महाप्राण 15 μl और जमा।
    5. दोहराएँ कदम (6.9.3 और 6.9.4)।
  10. सूखे तक एक speedvac में नए ट्यूबों रखें।
  11. मेजबान समाधान के 50 μl में Resuspend। 10 मिनट के लिए मध्यम पर भंवर resuspend।
  12. नैनो / नियंत्रण रेखा के लिए उपयुक्त नैनो / नियंत्रण रेखा शीशियों या 96 अच्छी तरह प्लेटें या तो में पिपेट पेप्टाइड समाधानएमएस / एमएस काम करते हैं।

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Representative Results

एक प्रदर्शन के रूप में, हम सतह और उत्तरी कनाडा में तटीय समुद्र की क्लोरोफिल अधिकतम से एकत्र दो समुद्री जल के नमूने पर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। समुद्र में समुद्री जल के 6-7 एल 3 माइक्रोन GF / डी prefilter के माध्यम से पारित किया गया था, जबकि उसके बाद माइक्रोबियल कोशिकाओं वाल्श एट अल। 20 के प्रोटोकॉल के बाद एक 0.22 माइक्रोन कारतूस फिल्टर यूनिट पर एकत्र किए गए थे। कोशिकाओं तुरंत आगे की प्रक्रिया जब तक एक शाही सेना स्थिरीकरण समाधान में संग्रहीत किया गया। यह यहां प्रस्तुत किया है के रूप में प्रयोगशाला की ओर लौटने पर, हम प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। केंद्रित सेल lysate विभाजित किया गया था; डीएनए की मात्रा की शेष 10% से उपजी थी, जबकि प्रोटीन, मात्रा का 90% से उपजी था। हम 24-26 प्रोटीन की माइक्रोग्राम और इन नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के 250-308 एनजी (चित्रा 1) बरामद किया। जेल में trypsin पाचन और पेप्टाइड निकासी, हम Orbitrap एली करने के लिए मिलकर एक नैनो नियंत्रण रेखा का उपयोग एमएस / एमएस विश्लेषण करने के लिए पेप्टाइड्स अधीन करने के बादते मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, Waltham, एमए, संयुक्त राज्य अमरीका)। पेप्टाइड्स से, हम नमूना प्रति 23,000 से अधिक एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा उत्पन्न। पेप्टाइड्स और प्रोटीन तो चोटियों जैव सूचना विज्ञान उपकरण (बीएसआई, वाटरलू, पर, कनाडा) का उपयोग कर एक कस्टम घर में अनुक्रम डेटाबेस के खिलाफ इन स्पेक्ट्रा खोज के द्वारा पहचान की गई। डेटाबेस समुद्री संदर्भ जीनोम और metagenomes से भविष्यवाणी की प्रोटीन के शामिल किया गया था। खोज 1000 के आसपास पेप्टाइड्स और प्रत्येक नमूना के लिए 700-800 प्रोटीन की पहचान में हुई। स्वाभाविक रूप से, इन परिणामों माइक्रोबियल सेल बहुतायत, एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन, और प्रोटीन खोज डेटाबेस और एल्गोरिदम पर निर्भर कर रहे हैं। बहरहाल, इन परिणामों के इस प्रोटोकॉल के माहौल में प्रोटीन के सैकड़ों की पहचान के लिए उपयुक्त पर्याप्त tryptic पेप्टाइड्स का उत्पादन करने की क्षमता है कि प्रदर्शित करता है। Metagenomic पुस्तकालयों डीएनए 30 के रूप में छोटे रूप में 100 एनजी से निर्माण किया जा सकता है, क्योंकि इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी डीएनए की पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध कराने की क्षमता हैमिलान किया metagenomic-metaproteomic डेटासेट उत्पन्न करने के लिए।

Metaproteomes के वर्गीकरण और कार्यात्मक संरचना BLASTp और मेगन (Metagenome विश्लेषक) सॉफ्टवेयर पैकेज 31,32 के संयोजन का उपयोग विश्लेषण किया गया था (चित्रा 2)। अल्फा-proteobacteria को सौंपा प्रोटीन सबसे उच्च डाटासेट में प्रतिनिधित्व किया है, जिनमें से ज्यादातर का SAR11 क्लेड को सौंपा गया थे। अल्फा-proteobacteria की Rhododobacterales क्लेड भी अत्यधिक प्रतिनिधित्व किया है और सतह के पानी में सबसे अधिक बार की पहचान की थी। Bacteroidetes को सौंपा प्रोटीन समान रूप से सतह और क्लोरोफिल अधिकतम के बीच वितरित किए गए, लेकिन Flavobacteria प्रोटीन क्लोरोफिल अधिकतम पर एक डिग्री से अधिक की पहचान की गई। गामा-proteobacterial प्रोटीन समान रूप से पानी कॉलम भर में वितरित किए गए बीटा-proteobacterial प्रोटीन सतह में predominately पाए गए, जबकि । सेएक कार्यात्मक परिप्रेक्ष्य, चयापचय मार्ग की एक विस्तृत श्रृंखला की पहचान की गई। इन चयापचय मार्ग के कार्यक्षेत्र संरचना स्पष्ट किया गया था। उदाहरण के लिए, एमिनो एसिड चयापचय, कार्बोहाइड्रेट चयापचय और प्रोकार्योटिक कार्बन निर्धारण रास्ते के साथ जुड़े प्रोटीन की सतह पर मुख्य रूप से पहचान की गई है, और नाइट्रोजन चयापचय सतह पर विशेष रूप से पाया गया था। प्रकाश संश्लेषण में शामिल प्रोटीन की सतह और क्लोरोफिल अधिकतम के बीच समान रूप से पहचान की गई है, जबकि संश्लेषक कार्बन निर्धारण प्रोटीन क्लोरोफिल अधिकतम पर मुख्य रूप से मनाया गया। इन परिणामों के माइक्रोबियल टाक्सा की विविधता से प्रोटीन की एक विस्तृत विविधता यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। आर्कटिक स्टेशन पर 2 गहराई से जीनोमिक डीएनए S633 पहली लेन एक 1 केबी डीएनए एल के 4 μl शामिलयोजक, 2 लेन S633_2 मीटर से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के 3 μl शामिल हैं, 3 लेन S633_20 मीटर से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के 3 μl होता है और गलियों 4-6 (0.5 μl (85 एनजी), 2 μl (333 एनजी) और 4 μl शामिल HindIII के 667 एनजी) लैम्ब्डा डीएनए पचता।

चित्र 2
चित्रा 2:। आर्कटिक स्टेशन S633 आर्कटिक स्टेशन 633 सतह और क्लोरोफिल अधिकतम जल के वर्गीकरण विविधता तुलना (ए) में 2 गहराई के वर्गीकरण और कार्यात्मक विश्लेषण MEGAN उपयोग कर बनाई गई। (बी) KEGG डेटाबेस के खिलाफ क्वेरी करने के लिए MEGAN का उपयोग कर बनाई आर्कटिक स्टेशन 633 सतह और क्लोरोफिल अधिकतम जल के कार्यात्मक विविधता तुलना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

नमूना संरक्षण metaproteomic के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है और पिछले काम एक शाही सेना स्थिरीकरण समाधान से पहले प्रोटीन निकासी के लिए 28 कोशिकाओं के भंडारण के लिए एक उपयोगी भंडारण बफर है कि प्रदर्शन किया। आदर्श रूप में, नमूने 33,34 से निपटने के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति में बदलाव को नकारना बगल में संरक्षित किया जाएगा। वास्तव में, सीटू नमूने और निर्धारण प्रौद्योगिकियों जहाज तैनात उपकरणों द्वारा स्वायत्त संग्रह और नमूने के संरक्षण के लिए अनुमति देते हैं, जो विकसित किया गया है। हालांकि, इन प्रौद्योगिकियों का उपयोग हमेशा संभव नहीं है। ऐसा नहीं है कि आम मामले में, नमूने के रूप में जल्द से जल्द संग्रह के बाद संरक्षित किया जाना चाहिए।

यहाँ हम आमतौर पर जलीय सूक्ष्म जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है जो एक कारतूस फिल्टर यूनिट, पर एकत्र आरएनए स्थिरीकरण समाधान संग्रहीत कोशिकाओं से प्रोटीन निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल एक पीआर द्वारा पीछा एक एसडीएस lysis समाधान और हीटिंग का उपयोग सेल भी शामिल है,एक आवश्यक desalting कदम के रूप में दोगुनी हो कि ultracentrifugal फिल्टर इकाइयों का उपयोग otein एकाग्रता कदम। यह ध्यान दे और desalting कदम अनदेखा नहीं किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। हम तीन बफर विनिमय कदम की एक न्यूनतम हमारे ध्यान केंद्रित फीका बनाना करने के लिए आवश्यक था कि पाया। उचित desalting उत्पन्न नहीं होती है, तो कारण आरएनए स्थिरीकरण समाधान के उच्च नमक एकाग्रता के लिए, बहुत ज्यादा नमक रात भर प्रोटीन वर्षा कदम और desalting और वर्षा कदम दोहराया जाना होगा दौरान उपजी किया जाएगा। विलवणीकरण ठीक से नहीं किया जाता है तो इसके साथ ही, 1 डी-पृष्ठ का काम नहीं करेंगे और नमूने खो जाएगा।

प्रोटीन वर्षा और डीएनए वर्षा दोनों का प्रदर्शन किया जा सकता है, ताकि अगली केंद्रित lysate विभाजित किया गया था। यह metagenomic और metaproteomic डेटा एक ही नमूने से उत्पन्न हो कि अक्सर वांछनीय है के रूप में यह उपयोगी है। एक प्रोटीन प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस में प्रतिनिधित्व नहीं कर रहा है तो पेप्टाइड होगापहचान नहीं हो। प्रोटिओमिक डेटा की वजह से डेटाबेस से अपनी अनुपस्थिति के लिए एक प्रोटीन की पहचान करने में सक्षम नहीं होने के जोखिम को कम कर के रूप में एक ही नमूना से जीनोमिक डेटा सहित।

इस प्रोटोकॉल कारतूस फिल्टर इकाइयों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित और तटीय समुद्र माइक्रोबियल समुदायों पर काम करने के लिए मान्य किया गया था, यद्यपि यह पर्यावरण के नमूने और फिल्टर के अन्य प्रकार के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, यह स्पष्ट रूप से इस प्रोटोकॉल की सफलता बायोमास शुरू करने की पर्याप्त मात्रा पर निर्भर है कि कहा जाना चाहिए। इसलिए बायोमास बहुत कम हो सकता है, जहां जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में, हम उसके अनुसार फ़िल्टर्ड पानी की मात्रा बढ़ती जा रही सलाह देते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterivex -GP 0.22 μm filter unit Millipore SVGP01050 Sampling
RNAlater Stabilization Solution Ambion AM7021 Sampling
Tris  Bio Basic 77-86-1 or TB0196-500G Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT Sigma-Aldrich D0632-1G Protein Extraction
SDS Bio Basic 15-21-3 Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA Bio Basic 6381-92-6 Protein Extraction
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5 Protein Extraction
10K Amicon Filter Millipore UFC801024 Protein Extraction
Methanol Sigma-Aldrich 179337-4L Protein Precipitation
Acetone Fisher Scientific 67-64-1 Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent Epicenter mmP03750 DNA Precipitation
2-Propanol Fisher Scientific 67-63-0 DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit Life Technologies Q32850 DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit Life Technologies Q33211 Protein Quantification
Sucrose Bio Basic 57-50-1 SDS PAGE gel
TEMED Bio Rad 161-0800 SDS PAGE gel
APS Bio Rad 161-0700 SDS PAGE gel
30% Acrylamide Bio Rad 161-0158 SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 SDS PAGE gel
Glycine Bio Rad 161-0718 SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol Bio Basic 60-24-2 SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer Bio Rad 161-0737 SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder Bio Rad 161-0375EDU SDS PAGE gel
Acetonitrile VWR CABDH6044-4 In-gel Trypsin digest
NH4HCO3 Bio Basic 1066-33-7 In-gel Trypsin digest
DTT Sigma-Aldrich D0632-1G In-gel Trypsin digest
Formic Acid Sigma-Aldrich F0507-500ML In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O Sigma-Aldrich 270733-4L In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide Bio Basic 144-48-9 In-gel Trypsin digest
Trypsin Promega V5111 In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5 ml Eppendorf 22431081 In-gel Trypsin digest
2 ml ROBO vial 9 mm Candian Life Science VT009/C395SB In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring Candian Life Science 4025P-631 In-gel Trypsin digest

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References

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