Альгинат инкапсуляции плюрипотентных стволовых клеток, используя коаксиальный Насадка

1Center for International Research on Integrative Biomedical System, Institute of Industrial Science, The University of Tokyo
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Horiguchi, I., Sakai, Y. Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle. J. Vis. Exp. (101), e52835, doi:10.3791/52835 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Подготовка материалов

  1. Подготовьте 10 мм HEPES буфера. Доводят рН до 7,0 при комнатной температуре и добавляют NaCl до 0,9%.
  2. Готовят 5% раствора альгината и раствора 10 мМ ЭДТА, смешивая HEPES-буферный солевой раствор, приготовленный в 1,1. Доводят рН до 7,0 при комнатной температуре.
  3. Автоклав реагенты (1.1, 1.2) в течение 20 мин при 121 ° С.
  4. Подготовьте желатин покрытием 60 мм блюда, покрытые 1,2 - 2,0 × 10 6 мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клеток, которые рассматриваются как фидерных клеток путем инкубации в течение DMEM, содержащей 10% ES-высококвалифицированных FBS и 10 мкг / мл митомицина С в течение 90 - 120 мин.
  5. Поддерживать мыши индуцированной плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток на блюдо с питающими клетками в присутствии 5 мл DMEM высокий уровень глюкозы, содержащей 20% ES-квалифицированным FBS, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, несущественные аминокислоты, и антибиотиков ( 100 ед / мл пенициллина G натрия, 100 мкг / мл стрептомицина сульфата и 250 нг / мл amphoteriCIN Б).
  6. Семя 4 х 10 5 клеток плюрипотентных на желатин покрытием 60 мм блюдо и инкубировать их при 37 ° С и 5% CO 2. Изменить культуральной среде каждый день во время инкубации. Через 3 - 4 дней культивирования клеток Trypsinize в течение 1 мин с 500 мкл 0,05% трипсина, содержащий 0,02% ЭДТА при 37 ° С и 5% СО 2. После этого отделить клетки нажав культуре блюдо десять раза.
  7. Добавить 2,5 мл DMEM с 10% ES-квалифицированный ФБС и антибиотики (следующие плюрипотентных клеток мыши диссоциации в отдельных клеток с помощью пипетки с 1000 мкл микропипетки три раза) центрифуги клеточной суспензии при 160 × г в течение 3 мин и удалить супернатант, и подсчет клеток , После подсчета клеток, повторное заполнение собранных клеток на желатин покрытием блюдо и инкубировать в течение 30 мин, чтобы изолировать клетки плюрипотентных из MEF клеток. После подсчета клеток (обычно 1 - 3 × 10 6 клеток / блюдо могут быть собраны) повторное заполнение 4 × 10 5 плюрипотентных клеток отблюдо.

2. Сотовый инкапсуляции в альгината гидрогеля капсул

  1. Сбор клеток по той же методике, описанной в 1.5 и 1.6. После центрифугирования при 160 × г в течение 3 мин, промыть осадок клеток IPS с HEPES-буферным раствором трижды. После повторного суспендирования клеток в HEPES-буферным раствором, фильтр клеточной суспензии через 40 мкм ячейки фильтра, чтобы удалить крупные агрегаты, которые в противном случае могут засорить сопло.
  2. Смешайте 2 мл клеточной суспензии в течение HEPES-буферным раствором и 3 мл 5% -ного раствора Na-Alg. Наконец 5 мл суспензии клеток в пределах 3% -ным раствором Alg-Na получают. Плотность клеток желательно более 10 6 клеток / мл.
  3. После сбора клеток суспензии в 5 мл шприц, установить коаксиальный сопло (рис 1а, б) на шприц и установите их на шприцевой насос. Испустите N 2 поток газа (ниже, чем 1 л / мин) через внешнюю иглу коаксиального сопла иизгнать клеточной суспензии через внутреннее сопло.
  4. Сбор капель в 250 мл 0,5% -ного раствора CaCl 2 и ждать 10 - 20 мин для образования геля при перемешивании при 60-90 оборотов в минуту.

3. Лечение альгината капсул (по желанию)

  1. Инкубируйте Alg-CA капсулы в 0,05% (вес / объем) поли-L-лизин (PLL) раствор в течение 5 мин при 37 ° С и 5% СО 2.
  2. После промывки капсулы с HEPES-буферным раствором, инкубируют их в среде DMEM, содержащей 10% FBS с целью нейтрализации электрического заряда на их поверхности. Используйте их как капсул, покрытых (рис 1в).
  3. Инкубируйте капсулы в HEPES-буферным раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА в течение 5 мин. В обработанной ЭДТА капсул используются как полые капсулы (рис 1c).

4. Культура и сбора клеток в альгината капсул

  1. Инкубируйте инкапсулированные клетки при 75 оборотах в минуту при встряхивании при 37 ° С и 5% CO 2на 10 дней.
  2. Сбор и инкубировать капсулы в 10 мМ ЭДТА при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 10 мин. Собирают клетки из альгинатных капсул без обработки ФАПЧ центрифугированием при 1000 х г в течение 3 мин.
  3. Если альгината капсулы обрабатывают с PLL, сломать мембрану Alg-PLL с помощью пипетки вверх и вниз около десяти раз с иглой со шприцем и центрифуги это при 1000 - 5000 × г в течение 5 мин. Диаметр иглы должен быть ниже, чем размер капсулы и 25 г игл (260 мкм) использовали в этом эксперименте (600 мкм)
  4. После центрифугирования собирают осадок клеток строго с разбитыми мембран Alg-PLL, если вы хотите, чтобы собрать образцы мРНК из клеток. Остальные Alg-PLL мембраны, возможно, предотвратить очистку мРНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В протоколе 2.5 исключен альгинат решение образует сферическую форму сразу после изгнания (рис 2A - H). Если суспензию исключили со скоростью потока N 2 ниже, чем 1 л / мин, размер капель равномерна (рис 2I). Тем не менее, если поток Н 2 выше 1 л / мин, капли ломается (рис 2G, белый стрелками) и размер капель будет гетерогенную (рис 2J). Учитывая это, трудно приготовить капли меньшего размера, чем 500 мкм с использованием этого метода.

В процессе гелеобразования (протокол 2.4), Alg-на капельки образуются сферические формы Alg-Ca капсулы в CaCl 2 решения, если концентрация Alg-Na (более 3%) достаточно (рис 3E-H, K, I). Однако низкая концентрация Alg-Na (ниже, чем 3%) вызывает несферическими и негладкой форма капсул (3А-D, I), котораяесть проблемы в процессе нанесения покрытия. Даже если концентрация Alg-Na недостаточно, сферические капсулы могут быть сформированы за счет увеличения концентрации CaCl 2 (рис 3J). Тем не менее, около 50 мМ CaCl 2 является подходящим для инкапсуляции, потому что слишком высокая концентрация CaCl 2 уменьшается клеточный рост и жизнеспособность (данные не показаны). После падения в CaCl 2 решения, возможно вы можете ждать в течение нескольких минут для желирующих но мы рекомендуем поднимая капсулы с CaCl 2 решения, потому что слишком долго инкубирование в CaCl 2 иногда влияет клеточный рост. Иногда вы получаете не сферические капсулы фасонных даже если концентрации достаточно. Это, вероятно, потому, что мытье сотовой осадок недостаточно, прежде чем ресуспендированием клетки в растворе Alg-Na. Остаточные реагенты, такие как сыворотки, возможно, предотвратить гелеобразование.

Капсула может расти в капсулах, но утечки сотовой (стрелками на рис4A) может происходить в капсулах без Alg-PLL покрытием (4А). В случае мышиных плюрипотентных клеток, клеток образуют дискообразные агрегатов в каждой Alg-Ca капсулы (фиг.4В), тогда как клетки слипаются и образуют одиночные сферические агрегаты в каждой капсуле полого (фиг.4С). Исходная плотность клеток не влияет на размер агрегатов в капсулах, но низкой плотности клеток (10 5 клеток / мл, гель) вызывает отказ расти (данные не показаны). Таким образом, 10 6 клеток / мл-гель желательно для инкапсуляции.

При сборе клеток из капсул, Alg-Са гидрогель может быть расторгнут с альгината лиазы или хелатных реагентов, хотя покрытие Alg-PLL трудно развести ферментов или химических веществ. Alg-ФАПЧ, следовательно, должны быть физически сломана с пипеткой, например. Сломанные мембраны могут быть отделены от клеток путем центрифугирования.


Рисунок 1. Изображения инкапсуляции системы и капсул. (A) образ инкапсуляции системы Alg-Ca инкапсуляции на чистом столе. (Б) Схематическое изображение коаксиальной насадкой для инкапсуляции. (C) три различных типа капсул, полученных в этом отчет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Влияние N 2 потока на морфологию капсул Непрерывные образы (A - H). И внешний вид (I, J) образования капель 3% раствора Alg-Na из коаксиального сопла в N 2течь на 1 л / мин (- D, I) и 2 л / мин (Е - Н, J). Непрерывные образы были захвачены привет-камеры скорости. Гидрогеля капсулы образуются в 0,5% CaCl 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Влияние Alg-Na и CaCl 2 Концентрация на морфологию капсул Непрерывные образы (- Н). И появление (я - л) Alg-Na капельки гелеобразования в CaCl 2 решения. В непрерывных изображений, капель, имеющих различную концентрацию Alg-Na, 2% (- D) и 3% (E - H), которые желирующий в 50 мМ CaCl 2 раствора. Непрерывные образы захвачены привет-Радар. Внешний вид изображения показывают морфологическое различие Alg-Са капсул, образованных различными концентрациями Alg-Na, 2% (L, J) и 3% (K, L), и CaCl 2, 50 мМ (L, K) и 500 мм (J, L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
. Рисунок 4. Морфология инкапсулированных мышь плюрипотентных клеточных агрегатов в капсулах микрофотографии изображения плюрипотентных клеток-агрегатов культивировали в течение 4, 6, 8 и 10 дней (1 - 4) соответственно в трех различных типов капсул: (а) голых, ( Б) с покрытием, и (С) полые капсулы. Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Инкапсуляция культура может быть по сравнению с прямыми суспензионных культур. Суспензионной культуре является более простой способ получения больших количеств плюрипотентных стволовых клеток, чем способов инкапсулирования. Тем не менее, управление агрегацию клеток в суспензионной культуре по-прежнему сложным. В методе инкапсуляции, клеточной агрегации ограничен в капсулы и может, следовательно, быть хорошо контролируется. Предыдущая публикация показала, что инкапсулированные клетки образуются агрегаты одинакового размера, в то время как крупные клеточные скопления появились в свободной подвески культуры 7. Кроме того, ранее отчет показал, что сильный агитация вызывает клеточную смерть в прямых подвески культур PS клеток; Таким образом, требуя ограниченной скорости перемешивания. В противоположность этому, инкапсуляции способен защищать клетки от напряжения сдвига даже в условиях подвески. Метод инкапсуляции, следовательно, позволяет уровень гибкости в условиях эксплуатации при выращивании клеток в суспензии.

ove_content "> Инкапсуляция является полезным инструментом как для исследования стволовых клеток, а также модификации массового производства. инкапсуляции стволовых клеток является полезным в исследовании стволовых клеток, в том числе нишу внеклеточного матрикса и факторов роста. Некоторые исследователи показали, что инкапсуляция ЭС клеток мыши в VEGF-конъюгированные агарозных гидрогелей способствует дифференциации клеток в клетки-предшественники в крови 8.

Эта статья показывает, как объединить плюрипотентных клеток в мышь размера управлением Alg-Са капсулы легко с помощью коаксиального сопла и N 2 потока. Хотя есть некоторые инкапсуляции процесс с различными инструментами, такими, как перистальтического насоса 9 и электрического напряжения 10, инкапсуляции, используя N 2 потока проще и безопаснее, чем метод другими методами. Кроме того, этот метод способен образовывать меньше (примерно больше, чем 600 мкм) Капсулы, чем метод с перистальтического насоса(Приблизительно более 3 мм). Большие капсулы занять больше времени для гелеобразования полностью и долгое время инкубации в CaCl 2, возможно, влияет на клеточные характеристики. Кроме того, большие капсулы также, возможно, имеют проблему массопереноса питательных веществ или отходов, таких как глюкоза и кислород. Поэтому размер капсул, образованных N 2 потока (600 -1000 мкм) идеально подходит для размер культуре клеток внутри.

Этот способ не подходит для приготовления небольших капсул и точно контролировать размер. Из-за распада капель этот способ не подходит для приготовления капсул меньше, чем 500 мкм. Кроме того, только визуальное наблюдение может определить размер капсул, таким образом, трудно контролировать размер капсул с помощью этого метода. В этом случае использование микрожидкостных устройств, возможно, может решить эти проблемы 11. Тем не менее, иногда засорение происходит в микроустройство потому Alg-на гели сразу после встречи CaCl 2 Solutионная.

Несмотря на то, альгинат не подходит для химической модификации из-за его высокой вязкости, оно способно образовывать гибридные капсулы с гидрогелем, который, как и ПЭГ, также трудно использовать для инкапсуляции. Предыдущая публикация показала, что герметизация мыши плюрипотентных клеток в RGD пептида, конъюгированного ПЭГ-Alg гибрид гидрогеля капсулы улучшить клеточный рост 12. Без химической модификации, инкапсуляция клеток в только что гидрогелевые капсулы можно было бы ожидать, чтобы изменить ниши стволовых клеток, сохраняя секретируемые факторы. В самом деле, предыдущие исследования показали, что секретируемые факторы роста, введенным в microbioreactor, были эффективны в борьбе стволовых клеток судьбу 13,14.

Коллекция клеток из капсул по-прежнему нерешенным вопросом относительно применения метода инкапсуляции для массового производства плюрипотентных стволовых клеток. Предыдущий доклад показал, что, что PLL покрытие необходимо KЕЭП мыши плюрипотентных клеток внутри 7. Если Alg-Ca-гидрогелевые капсулы хорошо покрыты поликатиона таких как PLL (протокол 3.1 - 3.2), то это будет трудно сломать капсул либо фермента или хелатных реагентов. В этом случае механический способ, такой как пипетки иглой требуется (протокол 4.3). Собранные клетки могут быть выделены из неполных мембран при центрифугировании более чем 5000 х г, хотя, возможно, центрифугирование может влиять на жизнеспособность клеток из-за высокой G-силы. Таким образом, методика плавно удаления мусора из клеток, а также нарушение капсулы играет важную роль в развитии технологии инкапсуляции. Хотя некоторые дальнейшее развитие требуется применять этот метод для массового производства клеток, инкапсуляция перспективный метод как массового производства и исследования стволовых клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse embryo fibroblast Cell Biolabs SNL 76/7
Mouse induced pluripotent stem cell RIKEN Bio resorce centre iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose GIBCO 11995
ES qualified  FBS GIBCO 16141079
Antibacterial Antibiotics GIBCO 15240
Nonessential Amino Acid GIBCO 11140
2-mercaptoethanol GIBCO 21985-023
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor Merck Millipore ESG1107
Trypsin/EDTA GIBCO 25300
26 G/16 G needle Hoshiseido
10 ml Syringe TERUMO SS-10ESZ
Sodium  Chloride Wako 191-01665
HEPES SIGMA H4034
Sodium Alginate Wako 194-09955
Calcium Chloride Wako 039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) SIGMA P7890
EDTA DOJINDO 345-01865
Sylinge pump AS ONE
Microscope Olympus IX71
Microscope Leica DM IRB
Hispeed camera nac image technology Memrecam HX-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
  2. Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7, (2), 97-111 (2011).
  3. Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92, (7), 920-933 (2005).
  4. Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17, (2), 165-172 (2011).
  5. Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, (3), 275-282 (2004).
  6. Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2, (1), 1-8 (2006).
  7. Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30, (4), 896-904 (2014).
  8. Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31, (32), 8262-8270 (2010).
  9. Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
  10. Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
  11. Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31, (8), 1223-1226 (2008).
  12. Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2, (176), 176-183 (2014).
  13. Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12, (6), 1097-1105 (2010).
  14. Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6, (1), 14117-14117-13 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics