Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Immunology and Infection
JoVE Journal
Immunology and Infection
AccessviaTrial
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sanchez, S. E., Cuevas, D. A., Rostron, J. E., Liang, T. Y., Pivaroff, C. G., Haynes, M. R., Nulton, J., Felts, B., Bailey, B. A., Salamon, P., Edwards, R. A., Burgin, A. B., Segall, A. M., Rohwer, F. Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52854, doi:10.3791/52854 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Faj konak etkileşimleri içine Güncel araştırmalar (meta) genomlar bilgiyi extrapolating bağlıdır. İlginçtir, 60 - tüm faj dizilerinin% 95 geçerli açıklamalı proteinlere hiçbir benzerliği paylaşırlar. Bunun bir sonucu olarak, faj genlerinin büyük bir kısmının varsayımsal olarak açıklamalı. Bu gerçeklik ağır hem yapısal ve yardımcı metabolik genlerin şerhi etkiler. Burada bu bilinmeyen faj genlerin birinin sentezlenmesi sırasında seçilen konakçı fizyolojik yanıt (lar) yakalamak için tasarlanmış Phenomic yöntem sunuyoruz. Metabolomik metaboliti bolluk ve çeşitlilik izleyerek iki ürün analizi sağlarken Çok fenotip Tahlil Tabaklar (MAP), ev sahibi substrat kullanımı ve sonraki biyokütle oluşumu çeşitliliğini izlemek için kullanılır. Her iki araç tek bir varsayımsal faj açık okuma çerçevesinin (ORF) ekspresyonu ile bağlantılı bir fenotipik profil sağlamak için eşzamanlı olarak kullanılır. Her iki yöntem için Örnek sonuçlar, highli karşılaştırıldığındafarazi yapısal veya metabolik faj genleri ya taşıyan bir ana fenotipik profil farklılıklarını ighting. Buna ek olarak, deneysel analizi kolaylaştırdı görselleştirme teknikleri ve yüksek verimlilik hesaplama boru hatları sunulmaktadır.

Introduction

(Bakteriyofaj veya faj aka) Bakteri bulaşan virüsler bir ortamda 1,2 küresel parçacıklar gibi 10'dan fazla 31 virüsü (VLP'ler) de var ve diğer tüm organizmalar sayıca tahmin edilmektedir. denizel ortamlarda ile ilişkili viral toplulukları araştıran ilk çalışma metagenomic viral fraksiyon 3 içinde görülen çeşitlilik miktarının üzerinde duruldu. Buna ek olarak, Breitbart ve arkadaşları, viral Topluluğu dizilerinin üzerinde 65% kamuya açık veri tabanlarında mevcut olan bir dizi ile homoloji paylaştığı bulundu. Daha sonraki çalışmalar metagenomic benzer kanıtlar bulundu: San Diego deniz çökelleri gelen metagenomes, California% 75 bilinmeyen virüs dizileri 4 içerirler; Salton Denizi hypersaline göllerden metagenomes% 98 bilinmeyen virüs dizileri 5 içerirler; % 98 bilinmiyor viral sekanslar 6 - ve mercan ilişkili metagenomes 95 içerir. Açıklama içermeyen Bu bilgi birikimi sonuçlandı7 "Biyolojik evrenin karanlık madde" olduğu faj genetik materyal.

Faj genomik karakterizasyonu mevcut nükleik asit ve protein veri tabanları ile karşılaştırmak yoluyla dizi benzerliği belirleme dayanır. Faj kodlanmış genetik bilgi ağırlıklı bilinmediğinden, homoloji dayalı yöntemler etkisizdir. Transkripsiyon ve replikasyon genleri, metabolik genleri ve yapısal genleri: genomları içinde, fajlar tipik olarak üç ana gen tiplerini kodlamak. transkripsiyonuna genleri (sınıf I / II genleri 8) polimerazlar, primases, endo / ekso-nükleazlar ve kinazlar bulunmaktadır. Bu genler çok transkripsiyonu ve faj genetik materyali kopyalayan, faj enfeksiyonu önemleri nedeniyle muhafaza edilir. Faj polimerazlar kolaylıkla nedeniyle küresel koruma 9 geleneksel bir dizi homolojisi yöntemler kullanılarak tespit edilir ve etkili filogenetik işaretleri 10 karşılık vermektedir gösterilmiştir.Aksine, faj metabolik ve yapısal genlerdeki (sınıf II / III genleri 8) giderek farklı ve genellikle varsayımsal genler olarak açıklamalı vardır.

Faj metabolik genler konağın metabolik kapasitesini etkiler ve mutlaka viral replikasyon için gerekli değildir. Genellikle, yardımcı metabolik genlerin 11 (AMGs) olarak geçen bu genler, konakçı metabolizmasını modüle eden ve enfeksiyon ve viryon olgunlaşma başarı uygun ilerlemesini sağlar görünmektedir. AMGs sınırlayıcı besin ya da enerji üretimi yollarındaki kullanımı ve madde alımı ile ilişkilendirilmiştir. Bazı örnekler fotosistem çeşitli cyanophage 12-16 genomları bulunan genleri, genler bağlı olan ve fosfat metabolizması 17,18 ve faj dNTP biyosentezi 18,19 için pentoz fosfat yolunun kullanımı ile düzenlenir bulunmaktadır. Buna karşılık, yapısal genler enfeksiyon sırasında üretilen geç genlere orta arasındadır ve farklı faj-ho arasında farklılıkst sistemleri. yapısal proteinlerin üretimi kendi transkripsiyon, çeviri ve montaj 8 viral dNTP kullanılabilirliği ve enerji havuzları bağlıdır. kapsid ve kuyruk fiber yapısal proteinler tüm viral proteini kodlayan genlerin en farklı olarak kabul edilir ve başarılı viryonu üretimi için gereklidir. Onların sapma tipik olarak virüs konak Birlikte evrimin varlığını 20 şekillenmesinde aktif bir rol oynamak atfedilir. Geleneksel homoloji ve sekans hizalama teknikleri kullanırken Iraksak proteinler, ne olursa olsun gen sınıfı, kolayca göz ardı edilir. Sıkı dizi karşılaştırmalar ile görülen kısıtlamalar düzeltmek için bir çaba gibi yapay sinir ağları 21 olarak dernek belirlemek için dizi özelliklerini kullanma yeteneğine biyoinformatik araçları sonuçlandı. Yapay sinir ağları (YSA) yapısal ve metabolik genlerin tahmini için izin, ancak, doğrudan karakterize etmek için aşağı deneysel doğrulama gerektirenGen işlevi.

Bu yazının amacı, yeni bir faj gen sentezlenmesi sırasında bir konakçı bakteri hem katabolik ve anabolik metabolizma izleme yeteneğine Phenomic protokolleri temin edilmesidir, işlevsel YSA'ların yoluyla tahmin. phenomics alanı, hücresel fenotipleri ile ilişkili biyoloji, iyi bilinmeyen ya da pleiotropik fonksiyonu ile proteinlerin soruşturma yardımcı olmak için sistem biyolojisi kurulmuştur. Phenomic araçlar genotipik bilgilere fenotipik bilgi bağlamak için kullanılır. Biz onların fonksiyonu (ler) faj gen ifadesi sırasında gözlemleyerek konak fizyolojik etkileri yoluyla tespit edilebilir varsayılan faj genlerinin hipotez. Bu hipotezi araştırmak için, iki sayısal yöntemler seçildi. Metabolomik belirli ortamındaki büyüme sırasında ev sahibi metaboliti çeşitliliği ve göreceli bolluk ölçülen ise Multi-fenotip Tahlil Tabaklar (MAP) ana substrat kullanımını ve sonraki biyokütle oluşumunu izlemek için kullanıldıruhsal durumların. Varsayılan yapısal ve metabolik proteinler Escherichia coli aşırı ve her iki deneylerden temsilcisi sonuçları karşılaştırılmıştır. Sayısız görsel teknikler ve yüksek verimli işleme boru hatları deneysel çoğaltma kolaylaştırmak için sunulmuştur. Son olarak, sunulan yöntemlerinin uyarlık ve doğruluğu açıklamalı kapsid proteini ve faj metabolik protein, tiyoredoksin, artı iki varsayılan AMGs için beklenen fizyolojik etkileri bağlamında ele alınmaktadır.

Protocol

Çok fenotip Testi Plate 1. Hazırlık (MAP) Dayanaklar, Bazal Medya, Ön büyüme Medya ve Tampon

  1. % 1.25 substrat stoklarının - 1.0 50 ml olun.
    1. Steril su içinde bir katı alt-tabaka arasında (w / v) (ısı gerekirse)% 1.25 - 1.0 eritin. RT'de 0.22 mikron filtre ünitesi ve mağaza stokları ile çözüm sterilize Filtre. Bu deneylerde kullanılan substratların örnekleri Tablo 2'de temin edilmiştir.
  2. Tüm alt-tabaka sınıflarına (karbon, nitrojen, sülfür ve fosfor) için 3x bazal ortam 250 ml olun. (40 mM MOPS, 10 mM Trişin),% 0.4 gliserol *, 9.5 mM NH4CI *, 0.25 mM nazo 4 *, 1.0 1x MOPS: MOPS (3-morpholinopropane-1-sülfonat) göre bazal ortamı 22 aşağıdakileri içerir mM MgSO 4 *, 1.32 mM K 2 HPO 4 *, 10 mM KCI, 0.5 uM CaCl2, 5 mM NaCl, 6 uM FeCl3, ve% 0.1 (ağırlık / hacim) L-arabinoz ** (Tablo 1 ve 2) .
    Not: Bu bileşikler, bazal ortama bağlı olarak dahil edilmez. Örneğin,% 0.4 gliserol, karbon bazal ortam ve bazal ortamı 1.0 mM MgSO 4 1.0 mM MgCl2 ile ikame edilir kükürt kullanılmaz. **-Arabinoz L, bir ARA dönüştürüldü pBAD promotör vektörü pEMB11, endüksiyonu için spesifiktir - E. coli K-12 suşu (BW 27784) 23.
    1. Steril bir şişeye bazal medya her bileşenini ekleyin ve hacim çözüm getirmek. Iyice karıştırın. 0.22 um filtre birimi ile filtre steril şişe içine her taban ortamı sterilize edin.
  3. MOPS ön büyüme ortamı 500 ml olun. MOPS göre ön büyüme ortamı 22 aşağıdakileri içerir: 1x MOPS (40 mM MOPS, 10 mM trisin),% 0.4 gliserol, 9.5 mM NH4CI, 0.25 mM nazo 4, 1.0 mM MgSO 4, 1.32 mM K 2 HPO 4, 10 mM KCI, 0.5 uM CaCl2, 5 mM NaCI ve 6 uM FeCl3.
    1. Her eklesteril bir şişeye, önceden büyüme ortamı bileşeni ve hacim getirmek. Filtre daha sonra 100 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyonda ampisilin ilave bir 0.22 um filtre birimi ile sterilize edin. 4 ° C'de saklayın çözüm.
  4. 0.5x Luria-Bertani (LB) agar plakaları 500 ml olun. Steril bir şişeye, bir 0.5x konsantrasyonu (1.25 g maya özütü, 2.5 g NaCl, 2.5 g tripton, 7.5 g ağar) yapmak için LB bileşenleri ekleyin. İyice karıştırın ve sterilize otoklav.
    1. Serin ağar, karıştırma antibiyotik ampisilin, 100 ug / ml ekleyin. Gerekli olana kadar, 4 ° C'de, Petri kutularına agar ~ 25 ml dökün ayarlamak için olanak sağlar, ve saklayın.
  5. 10 mM Tris (pH 7.4) artı 10 mM MgSO 4 tampon çözeltisi 250 ml olun. Oda sıcaklığında, bir 0.22 um filtre birimi ve mağaza çözeltisi ile sterilize filtre.

Bakteriyel hücre süspansiyonunun 2. Hazırlık

  1. Taze koloniler hazırlayın. % 12.5 gliserol donmuş stoktan, taze E. plaka coli klon100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB agar üzerine 0.5x es. 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
  2. Sıvı kültürleri hazırlanması:
    1. Pipet kültür tüpleri içinde 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden ön-büyüme ortamı 3 mi. Her bir klon için, biyolojik triplicates kullanın.
    2. Hazırlanan kültür tüplerine bölüm 2.1 bağımsız koloniler inoküle edin. 22 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edilir.
  3. Pelet ve bakteri hücreleri yıkayın:
    1. Aktarım O / 1.7 ml mikrofuge'de tüpler içine N kültürleri. Bir mikrosantrfuj 2 dakika süreyle maksimum hızda (16,900 xg), santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatant boşaltacaktır ve 10 mM Tris / 10 mM MgSO 4 tampon 500 ul içinde yeniden süspansiyon haline getirilerek hücre yıkayın. Tekrarlayın.
    2. Yeniden pelet hücreleri decant yüzer tabakanın ve 10 mM Tris / 10 mM MgSO 4 1 ml tampon hücreleri yeniden askıya.
  4. Hücre yoğunluğu ölçün ve (gerekirse) hücreleri konsantre:
    1. Bölüm 2.3.3 hücreler sulandırmak 10 kat10 mM Tris / 10 mM 4 tampon MgSO ve bir küvet içine bu seyreltme aktarın. Optik yoğunluk, bu seyreltme ve kayıt (OD 600 nm) ölçülür.
    2. MAP'ler 0.07 (OD 600 nm) nihai konsantrasyon (, haritaları eklendiğinde hücrelerin, bu nedenle hücre OD 600 nm = 1.05 arasında bir başlangıç ​​konsantrasyonunda olması gerekir, 15 kat seyreltilmiş olacaktır) elde etmek için hücrelerin konsantre edilir. Bir rezervuar içine konsantre hücre süspansiyonu aktarın ve MAP hazırlık aşamasında 3.5 kadar (oda sıcaklığında) kaydedin.

Çok fenotip Testi Tabaklar 3. Hazırlama (MAP)

  1. MAP etiketleyin. E ile etiket steril 96 oyuklu mikro-titre plakaları coli klon kimlik numarası ve şematik türü HARİTA.
  2. MAP'ler içine kısım steril su. Bir sıvı rezervuar içine aseptik aktarımı steril su içermektedir. Pipet, bir çok kanallı pipet kullanarak mikro-titre plakasının her bir oyuğuna 60 ul.
  3. Kısım bazal ortamı into MAP. Bir sıvı rezervuar içine bazal ortam 3x aseptik aktarımı. Pipet, bir çok kanallı pipet kullanarak mikro-titre plakasının her bir oyuğuna 50 ul. Tekrarlama MAP şemada kullanılan her bazal ortam için 3.2 ve 3.3 adımları.
  4. MAP'ler içine kısım yüzeyler. MAP'ler uygun kuyuya her substrat 30 ul aktarın.
  5. MAP'ler bakteriyel süspansiyon ekleyin. Aktarım, bir çok kanallı pipet kullanılarak MAP her kuyuya bölüm 2.4.2 gelen bakteri hücreleri 10 ul. Geri kültür stokunun içine yeniden tanıtan pipet önce ipuçlarını değiştirin.
  6. Yapışkan film ile Kapak MAP. Tek bir yapışkan levha film ile her plaka örtün. Sıkıca eşit ve sıkı bir mühür oluşturmak için plaka kuyu üstüne ve kenarlarında filmi basın. Steril bir jilet ile mikro titre plaka kenarlarına aşırı filmi çıkarın.
  7. MAP'ler optik yoğunluğunu ölçün:
    1. Bir çok plakalı spektrfotometrik ve "Giriş" kovan hazırlanan MAP yerleştirinfotometre plaka okuyucu. Açık plaka okuyucu yazılımı ve okur arasındaki sallayarak 60 sn, 32 saat olmak üzere toplam absorbansı (OD 600 nm) her 30 dakika, ölçen bir protokol oluşturmak.
    2. 37 ° C'ye kadar aygıt içinde yer alan sıcaklığı. MAP sıcaklığını ayarlamak için dengelenmiş sonra protokol başlatın.
    3. 32 saat sonra, plaka okuyucu "Çıkış" kovanından MAP kaldırın. Dahil etmek için her bir veri metin dosyasını etiketle: E. coli klon kimlik numarası, MAP koştu tarihi ve MAP şematik türü.

4. Çok fenotip Tahlil Tabaklar (MAP) işlenmesi ve Parameterization

  1. Otomatik QA süreci, örneğin, PMAnalyzer 24 ile büyüme eğrileri değerlendirin.
    1. Doğrulayın büyüme eğrileri OD 600 nm <ilk 2 saat içinde 0.20 var. Nedeniyle tipik olarak çözmek yoğunlaşma eserler, filtrenin ilk zaman noktasında (t 0) absorbans kullanmayınt, 1 (30 dakika).
    2. QA filtresi ihlal büyüme eğrileri çıkarın. Eğri bilgilerini kaydetme (örnek isim, iyi numarası ve OD 600 nm değerleri) ileride başvurmak için ayrı bir çıkış dosyasında. Büyüme eğrisi QA filtresi geçerse analizi ile devam edin.
  2. Medyan büyüme eğrileri hesaplayın. Kuyu başına, verileri çoğaltmak kullanarak, her zaman noktasında ortalama optik yoğunluk (OD 600 nm) değeri alarak medyan büyüme eğrisini hesaplar. Ileride kullanmak için ayrı bir çıktı dosyası medyan büyüme eğrileri ortaya çıkan Tutanak.
  3. Zwietering 25 tarafından önerilen denklemin bir uyarlamasını kullanarak her büyüme eğrisi için en uygun lojistik model hesaplayın. gecikme süresi, λ (saat), büyüme maksimum hızı, μ max (OD 600 nm 100 -1), ve son biyokütle verimi, α (OD 600 nm): lojistik denklem bakteri üremesini açıklayan üç parametre içerir. Olarak zaman = 30 dakika (y 1) veri kullanın nedeniyle yoğunlaşma eserler ilk değer.
    Denklem 1 [1]
    1. Doğrudan arama kullanarak maksimum büyüme oranını hesaplayınız. Veri içinde bir 90 dakika aralığı boyunca değişim büyük oranda kaydedin.
      Denklem 2 [2]
    2. Bir 90 dakika penceresi üzerinde büyük hareketli ortalamanın üst asimptotik değeri arayarak son biyokütle verimi tahmin edin. Özellikle, büyüme eğrisinin asimptot olarak tanımlar.
      Denklem 3 [3]
    3. Μ max ve 4.3.1 ve 4.3.2 A değerleri kullanarak, tüm değerler λ deneyerek λ değeri bulmak:
      Denklem 4 [4]
      1. Squared hata (SSE) bir toplamı hesaplamak için her λ değerini kullanın. En SSE SSE (λS) olduğunu kullanın:
        /files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]

MAP'ler 5. Fenotip Analizi

  1. Substrat başına klon başına genel büyüme değerlendirmek için her büyüme eğrisi büyüme seviyesini (GL) hesaplayın. Kaymıştır lojistik takılan değerlerin harmonik ortalama olarak GL tanımlayın:
    Denklem 6 [6]
  2. GL değerlerine dayalı her büyüme eğrisi bir fenotip atayın. Burada kullanılan dört fenotipleri şunlardır: beklenen büyüme, hiçbir büyüme, fonksiyon kazanç ve fonksiyon kaybı.
    1. Uzakta ortalamadan standart sapma anlamında belirli bir substrat üzerindeki tüm klonlar arasında büyümeyi karşılaştırarak fenotipleri belirleyin. Büyüme eğrisi (Şekil 1A, B). Şekil 1C fenotip atama örnekleri sağlar tarafından sunulan fenotip belirlemek için bu istatistik ve asgari bir büyüme eşiği kullanın.
    2. GL ≥ 0.4 (Figür olarak büyümeyi tanımlayıne 1A, B). Bir GL sahip olarak Fonksiyon Kazanç (yeşil Şekil 1C) tanımlayın> ortalama ve ortalama> büyüme eşiğinin üzerinde iki standart sapma. Fonksiyonu (kırmızı Şekil 1C) kaybı bir GL <iki standart ortalamanın altında sapmalar ve ortalama> büyüme eşiği sahip olarak tanımlanmaktadır.
  3. Fenotipleri ve büyüme eğrilerine göre veri setinin görsel temsillerini oluşturun.
    1. Renk olarak OD 600 nm değerleri tasvir Görünüm büyüme dinamikleri hızla çoklu klonlar (Şekil 2) arasındaki büyüme eğrileri karşılaştırmak.
    2. Büyüme koşulları (Şekil 3) dayalı tüm klonlar arasında fenotipik dağılımları görüntüleyin.

6. Sürekli Kültür Aparatı Bina

  1. Reaktör liman inşaatı (Şekil 4A, B). Üç 1/4. Delik delin, içinde 3/4 aralıklı. Ayrı, sürekli kültür reaktörün kap içinde.
    1. For noktası α: Bir dişi luer iplik tarzı paneli içinde 1/16 monte vida çengel diken kapağının üzerinden, yukarı bakacak şekilde kapağın altından.. 1/4 yılında. Panel ile Güvenli diken kilit somunu.
    2. Port β için: dişi luer iplik tarzı paneli içinde 1/16 monte vida çengel diken kapağının üzerinden yukarı bakacak şekilde.. 1/4 yılında. Panel ile Güvenli diken kilit somunu.
    3. Port γ için:. Diken kapağının üzerinden yukarı bakacak şekilde bir dişi luer iplik tarzı paneli kapağının altından diken içinde 1/16 monte vida. Güvenli diken içinde 4/1 ile. Panel kilitleme somununu monte edin. 1/8 ayrılmaz kilit halkası ile bir erkek luer vidalayın. Geniş delik hortumu başlığın iç uydurma diken için.
    4. Çıkış noktası için: Bir 16/05 matkap sürekli kültür reaktörün 75 ml işaretine delik.. Içinde 4/3 kesin. Içinde 1/4 somun ucunda. Dikenli bölme uydurma. 1/4 in vidalayın. Dikenli bölme uydurma (conta şişenin dış ve iç fındık, F üzerindeŞEKIL 4B).
  2. Biberon liman inşaatı (Şekil 4C). Matkap iki 1/4. Delik 1 ile aralıklı. Ayrı biberonun kap içinde.
    1. Port δ için: dişi luer iplik tarzı paneli 1/8 monte vida çengel diken kapağının üzerinden yukarı bakacak şekilde.. 1/4 yılında. Panel ile Güvenli diken kilit somunu.
    2. Port ε için: dişi luer iplik tarzı paneli içinde 1/16 monte vida çengel diken kapağının üzerinden yukarı bakacak şekilde.. 1/4 yılında. Panel ile Güvenli diken kilit somunu.
      1. 1/8 ayrılmaz kilit halkası ile bir erkek luer vidalayın. Geniş delik hortumu uydurma dikenin için, başlığın iç.
  3. Tüpleri ve tüp uzantıları Besleme:
    1. Hortumun iki 1. Parçaları kesin (1/8. Dış çap (OD) içinde 1/16 x. Iç çapı (ID)). Portları üzerine Fit parçalar α ve sürekli kültür reaktörün γ bölümünde 5.2 yapılmış.
    2. Tek 1 kesin. T parça(1/4 inç.. ID OD x 1/8) ubing. Sürekli kültür reaktörün liman Β üzerine Fit parçası.
    3. Içinde. Hortumun parçası, tek bir 3.5 Cut (1/8. OD x 16/01. ID). 1/8 ayrılmaz kilit halkası ile erkek luer üzerine, liman γ içine bu parça takın. Geniş delik hortumu. Liman γ sürekli kültür reaktörün örnekleme limanıdır.
    4. Içinde. Hortumun parça (1/4 inç. OD x 1/8. ID) tek bir 1 kesti. Biberonun δ portuna bu parçayı takın.
    5. (Içinde 1/16. OD x 1/8. ID). Boru parçası tek 11'e kesin. 1/8 ayrılmaz kilit halkası ile erkek luer üzerine, biberonun liman ε içine bu parça takın. Geniş delik hortumu.
    6. (1/8. OD x 16/01. ID) boru iki 18. Parçaları kesin. Biberonun ε limanına tek parça takın. Bölüm 7 diğer parça kaydedin.

7. metabolomik için sürekli Kültürler Koşu

  1. Malzemeleri sterilize:
    1. Autocla30 dakika boyunca, kuru malzeme ve. Alüminyum folyo 5. bölümünde yapılan biberonun kapağını sarmak için emin olun. Ekli boru düz tutun.
      1. Alüminyum folyo 5. bölümünde yapılan sürekli kültür reaktörün kapağını, sarın. Ekli boru düz tutun. 18'e sarın. Bölüm 6.3.5 yılında boru kesme ve alüminyum folyo en küçük peristaltik pompa hortumu adaptörü. Boru düz tutun. 30 dakika süreyle otoklavlanmaktadır.
    2. 0.5x LB suyu 2 L sağlayın. Biberona olarak, 0.5x LB suyu yapmak. Folyo ile şişeyi besleme örtün. 1 saat süre ile Otoklav.
    3. 0.5x LB suyu 70 mi sağlayın. Sürekli kültür reaktöre suyu dökün. Sürekli bir kültür reaktör içinde bir karıştırma çubuğu yerleştirin. 30 dakika boyunca folyo ve otoklav ile reaktör kapatılır.
  2. Sürekli kültür set-up:
    1. Bakteriyel hücre süspansiyonu.
      1. % 12.5 gliserol donmuş stoktan, taze E. plaka 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB agar üzerine 0.5x E. coli klonları. Tasarlamak24 saat boyunca 37 ° C'de.
      2. 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB suyu 0.5x 3 ml tek bir koloni inoküle edin. Her bir klon için, biyolojik triplicates kullanın. 22 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edilir.
    2. Parçaları bir araya bağlayın.
      1. Biyolojik güvenlik kabini içine tüm malzemeleri koyun otoklavlanmış ve medya soğurken üzerine ultraviyole ışığı açın. Ortam soğuduktan sonra, tüm 0.5x LB suyu% 0.1, L-arabinoz, 100 ug / ml ampisilin ilave edin.
      2. Sürekli kültür reaktör kapağını açınız ve reaktörün üzerine vida. Örnekleme tüpü dokunmaktan kaçının. Besleme şişe kapağı paketini ve biberona üzerine vida. Örnekleme tüpü dokunmaktan kaçının.
      3. 18'e tutun. Port ε steril bağlı boru. 18. Boru ve peristaltik pompa hortumu adaptörü Un sarın.
      4. 18 serbest ucunu takınız. Peristaltik pompa hortumu adaptörü bir ucuna boru. Peristaltik pompa hortumu adaptörünün diğer ucunu sığdır18. Boru biberon kapağının ε portuna bağlı.
      5. Limanlar β üzerine 0.22 mikron filtre vidalı tesisler ve sürekli kültür reaktörün δ. Liman α ve adaptör üzerindeki bir 0.22 mikron filtre ünitesi vidalayın. 0.22 mikron filtre ünitesine. Tüp içinde 18 boştaki ucunu.
    3. Sürekli kültür başlatın.
      1. Biyo-güvenlik kaput, bölüm 7.2.1.1 yapılan O / N kültür, 100 ul ile sürekli bir kültür reaktörü inoküle.
      2. 37 ° C inkübatör içine sürekli kültürü taşımadan önce kapatın sistemi. Inkübatör Manyetik bir karıştırma plakası mini peristaltik pompa kurdunuz.
      3. Peristaltik pompa içine peristaltik pompa hortumu adaptörü takın. Biberona Boru başlar yan ve reaktöre giden boru "Out" tarafında başlar "In".
      4. "FAST": peristaltik pompa ayarlayın. R geçerek peristaltik pompa başlayın20; İLERİ ". Medya boru akmaya başlar olmadığını kontrol edin.
      5. Manyetik karıştırıcı plaka üzerinde reaktör yerleştirin ve karıştırma başlar. Sürekli kültür reaktör örnekleme önce 24 saat dengelenmesi gerekir.
    4. Sürekli kültürünün Örnekleme. Liman γ üzerine 5 ml luer lok şırınga Vida ve yukarı 4.5 ml kültür çekin.
      1. Yoğunluk (OD 600 nm) ölçmek için kültür, 500 ul kullanın. OD 600 nm'de, 4 x 1 mi kültür = 0.35 yapmak için hücreler ile seyreltilir.
      2. Kısım 1.7 mi mikrofüj tüplerine kültürleri seyreltilmiştir. 4 gün boyunca her 12 saat örnekleme tekrarlayın.
    5. GC-TOFMS için numune hazırlanması:
      1. 2 dakika boyunca maksimum hızda (16.900 xg) santrifüj yoluyla Pelet hücreleri. Decant süpernatant. Fosfat tamponlu tuzlu su içinde 500 ul (PBS) hücreleri yıkayın. Bu adımı yineleyin.
      2. Son bir kez süpernatanlarına Durusu ve sonra durur köpüren kadar sıvı nitrojen içinde pelet hücreleri ile mikrofuge'de tüpleri daldırın. S° C derin dondurucuda -80 örnekleri parçaladı.

8. metabolomik için seri Passage Toplu Kültürler Koşu

  1. Bakteriyel hücre süspansiyonunun hazırlanması. % 12.5 gliserol donmuş stoktan, taze E. plaka E. coli 100 ug / ml ihtiva eden 0.5x LB agara klonlar amfisilin. 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
    1. Tek tek koloniler inoküle 3 100 ug / ml ihtiva eden 0.5x LB suyu mi amfisilin. Her bir klon için, biyolojik triplicates kullanın.
  2. Seri geçiş toplu kültürleri.
    1. 50 ug / ml ampisilin ve% 0.1, L-arabinoz ihtiva eden LB et suyu, 3 ml bir 500-kat seyreltme yoluyla 8.1.1 gelen Alt kültür O / N. Altkültür bir OD 600 nm <0.005 olmalıdır. Çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edilir.
    2. 2 ve 2.5 saat sonra optik yoğunluk (OD 600 nm) kontrol edin. OD 600 nm = 0.35 elde etmek için hücreleri büyütün.
      1. 500-kat di yoluyla Alt kültür50 ug / ml ampisilin ve% 0.1, L-arabinoz ihtiva eden LB et suyu 3 ml dökülmesinden. Altkültür bir OD 600 nm <0.005 olmalıdır.
    3. 2 ve 2.5 saat sonra optik yoğunluk (OD 600 nm) kontrol edin. OD 600 nm = 0.35 elde etmek için hücreleri büyütün.
  3. Seri geçiş toplu kültürleri Örnekleme.
    1. Steril forseps kullanılarak, bir filtre manifoldu ve üst 0.22 um membran filtre yerleştirin. Kısım 1 filtre kağıdı üzerinde fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır ve daha sonra vakumlu pompa açın.
    2. 1 ml PBS ilave tekrarlayın. Filtre kağıdı üzerine bölüm 8.2.3 den altkültürünün 1 ml aktarın. Buradan hemen sıvı azot içine örnekleri almak için hızlı bir şekilde hareket ettirin. 1 dakika içinde bu tamamlayın.
    3. Filtre kağıdı üzerine PBS kısım 1 ml numuneyi yıkamak için. Filtre kağıdının kenarlarına üzerinde örnek dökmeden hızla çalkalayın. Tekrarlayın.
    4. Dikkatle fi katlayarak 1,7 ml mikrofuge'de tüp içine steril forseps yer filtresi kullanmaltresi. Durur köpüren kadar sıvı azot içinde mikrofuge'ye tüp Batmak. -80 ° C derin dondurucuda saklayın örneği.

9. metabolit Analizi ve İşleme

  1. Gemi örnek işleme, analiz ve GC-TOFMS normalleşmesi için bir metabolomiks çekirdek tesisine kuru buz üzerinde klon başına 3 örnekleri.
  2. Her numune için tekrarlanan verileri kullanarak, metabolitleri arasında varyasyon ortalama, medyan, standart sapma ve katsayısını belirler.
  3. İstatistiksel analiz için, elle tanımlanan koşulları uymayan metabolitleri kaldırmak için koşullu ifadeleri ve tekrarlayan infaz 26 kullanarak bir QA boru hattı kod.
    1. Durum 1 için, 2'den fazla numune sıfır bolluk var hangi metabolitleri kaldırın. Metabolomic profil iç standartlar çıkarın.
    2. Durum 2 için, ilgi hücrelerde bulunmayan bu metabolitler kaldırın. Burada, şu metabolitleri kaldırın: indol 3 asetat, dihydroabiet acıd, nonadekanoik asit, salisilik asit, salisilaldehid, kolesterol, fenol, 1-monostearin, oktadekanol, 1-monopalmitin, dodekan, dodekanol, 1-heksadekanol, 5-metoksitriptamin, benzoik asit, pentadekanoik asit, fosforik asit, pelargonik asit, palmitik asit, kaprik asit, hidroksilamin, stearik asit, miristik asit, maleimid, levoglucosan ve 4-hidroksibütirik asidi içerir.
    3. Durum 3 için, değişim katsayısı 1'den büyük olan bu metabolitleri kaldırın.
  4. Metaboliti göreceli bolluğu bakarak küresel metabolomik etkileri yakalayın.
    1. Her metaboliti (Şekil 6) için klon başına medyan metaboliti bolluk görsel temsilini oluşturun.
  5. Klon-metaboliti çifti frekansları gözlemleyerek aykırı tanımlayın.
    1. Bir klon her metabolitin her medyan değeri için Z skoru hesaplayın. Aşağıdaki denklem kullanılarak z puanları hesaplayın:
      /52854/52854eq7.jpg "/> [7]
      Not: Dönem X MC, belirli bir klon için özel bir metaboliti bolluğu düzeyini temsil eder. Terim μ belirli bir metabolit için, tüm klonların ortalamasını temsil eder. Dönem σ C ilişkili standart sapmadır.
    2. Aykırı ortaya koyan verilerin görsel bir temsilini oluşturma (veri verilmez).

Representative Results

Bu çalışma için seçilen açık okuma çerçevelerini (ORF) belirlemek için kullanılan bütün numuneler Starbuck Island, Alanı 7 (STAR7) ve Caroline Atolü'nde Güney Hat Islands Alanı 9 (CAR9) toplanmıştır. Daha önce 5 açıklandığı gibi bu sitelerden deniz suyu yaklaşık 100 L, mercan sınır tabakası kullanarak sintine pompaları aşağıda toplanmıştır. Pompaların içeriği küçük ökaryotlarda kaldırmak için büyük gözenekli filtreler aracılığıyla fractionalization maruz kaldığını ve daha sonra sadece mikropları ve parçacıklar (VLP'ler) gibi viral bırakarak 100 kDa teğetsel akış filtreleri kullanarak konsantre. VLP'leri ayırmak için, kalan deniz suyu virome sonuçlanan 0.45 um filtre içinden geçirildi. Kloroform kalan hücrelerin büyümesini durdurmak için, bu viral fraksiyonuna kişiye edildi ve 4 ° C'de saklandı.

VLPler yoğunluk gradyanları santrifüjleme yoluyla ayrılması ve Vir geri kazanımı için izin veren sezyum klorür yöntemi kullanılarak saflaştırılmıştıriyonlar ~ 1.35 ug / ml 1.5 ug / ml 3. Viral DNA, bir CTAB / fenol kullanılarak ekstre edilmiştir: kloroform protokolü ve Phi29 reaktifler kullanılarak birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu ile amplifiye edilmiştir. Virome dizilenmesi ticari olarak temin edilebilen, piro tekniği ile yapıldı.

Aşağıdaki gibi bu çalışma için işlenmesi ve viral ORF seçiminde kullanılan Biyoinformatik vardır. Üç ön işleme adımları CAR9 ve STAR7 viral metagenomes kullanılmıştır. İlk olarak, açık yazılım sekanslama 27 önce viral DNA'nın amplifikasyonu sonucu etiketi sekanslarını çıkarmak için kullanıldı. İkincisi, bu tür dizi çiftleri ve düşük kopya sayısı gibi ortak sıralama eserler ek biyoinformatik programı 28 üzerinden veri kümesi dışarı süzüldü. Son olarak, yabancı sekansı kirlenme 29 çıkarılması ≥% 90 kapsama aşağıdaki veri tabanlarına göre sekanslarla ≥% 94 kimliğe sahip sekanslar için gerçekleştirilmiştir: RefSeq hacirus genomları; İnsan - Referans GRCh37; İnsan - Celera Genomics; İnsan - Craig Venter (HuRef); İnsan - Seong-Jin Kim (Kore); İnsan - Kromozom 7 sürüm 2 (TCAG); ve İnsan - James Watson, Yanhuang (YH; Asya), Yoruba (NA18507; Afrika) başvuru dizileri 21. Bu işlemlerin ardından, CAR9 örneklerinden sekansları 591.600 seviyesinde ve STAR7 sekansları 939.311 ulaştı. Bu diziler MGRAST üzerine yüklenen ve varsayılan ayarları kullanarak montajcı yazılımı üzerinden monte edilmiştir. Daha önce açıklandığı gibi 21 contigler, 6 okuma çerçeveleri ve farazi açık okuma çerçeveleri (pORFs) komut dosyalarını kullanarak belirlendi çevrilmiştir.

Benzerlik tabanlı aramaların bir dizi fonksiyonu bilinen ORF kaldırmak için yapılmıştır bilinmeyen ORF tespit etmek. Kısaca, aşağıdaki aramalar karşılık gelen arama kriterlerine 21 ile yapıldı:

  1. ≥ fazla ≥% 95 kimlik önemli bir benzerlik40 baz çift M5NR veri tabanında MGRAST blat ile (bp).
  2. Benim Metagenome Veritabanı Kaynak tüm kamu metagenomes karşı TBLASTN tarafından önemli benzerlik (0.001 ≤ e-değer).
  3. NR veritabanına karşı önemli BLASTP tarafından benzerliği (0.001 ≤ e-değeri) ve TBLASTN.
  4. Önemli benzerlik Korunmuş Domain Veritabanı karşı RPS-BLAST tarafından (0.001 ≤ e-değer).
  5. Protein Bilgi Bankası çözülen protein yapılarına karşı karşılaştırıldığında her veri kümesi seçkin bir fraksiyonu Protein çevirileri.
  6. Dinükleotit İmzalar paketini kullanarak dinükleotid frekanslarının hesaplanması.

Elde edilen pORFs E. ekspresyon için tasarlanan coli kamuya açık gen tasarım yazılımı kullanarak. E. koli içinde ifadeye karşılamak için tasarlanmış üniversal kodon kullanım tablosu kullanılan amino-asit sekanslarının arka için 2 en az% kullanım eşik coli. Kısıtlama enzimi tanıma sekansıBamHI ve HindIII s klonlamayı kolaylaştırmak için sekanslar alınmadı. Standart klonlama sınırlama enzimi ile, bir dış işletme işlenmiş gen 30 dizileri sentezlenir ve daha sonra ORF'ler orta kopya sayısı pBAD promotör vektörü pEMB11 klonlanmıştır. Tüm klonlar, E. dönüştürülmüştür coli K-12 suşu BW 27784 23.

Çok fenotip Tahlil Tabaklar (MAP)

Bir yüksek verimlilik ve sağlam yazılım boru hattı MAP'ler, PMAnalyzer 24 analizi için kaldıraçlı edildi. okunabilir metin dosyaları, kalite güvencesi için büyüme eğrileri (QA) ve ön işleme ve büyüme eğrileri analiz matematiksel modelleme tekniklerini performans verileri biçimlendirme, optik yoğunluk dosyalarının ayrıştırma: Boru dahil olmak üzere çeşitli adımlar Linux sunucu ortamında geliştirilmiş ve gerçekleştirir edildi . Birincil modelleme komut PyLab modülünün kullanımı için Python sürüm 2.7.5 geliştirilmiştir.

(Şekil 2A) için standart hata (SE) kullanılarak değerlendirildi. Ham büyüme eğrileri deney sırasında program PMAnalyzer doğru parametreli ve modellenen klon büyümesi (veriler gösterilmemiştir) olup olmadığını belirlemek için lojistik büyüme eğrileri karşılaştırıldı. MAP'ler ve PMAnalyzer doğruluğu ve geçerliliği hakkında daha fazla bilgi için ark. 24 Cuevas bakınız

Yöntemin geçerliliği ardından MAP veri işleme boru hattı tarafından sağlanan bu tür maksimum büyüme oranı (μ max) ve büyüme seviyesinin (GL) gibi birden çok parametre, kullanılarak analiz edildi. Büyüme eğrilerinin Karşılaştırmalı görselleştirme sıklıkla büyüme verileri yorumlama için kullanılır; Bununla birlikte karşılaştırma için bir seferde görselleştirilebilir eğrileri sayısı sınırlamaları vardır. Aynı anda çok sayıda büyüme eğrilerini analiz etmek, ısı haritası türetilmiş araziler tek substrat üzerinde yetiştirilen klonların onlarca karşılaştırmak yalvardı edildiBu koşullar ortalama yanıt (Şekil 2B) karşı e. yeni bir faj proteinin aşırı ifadesi ile yerleştirilen etkisi özellikle eğri parametrelerindeki değişiklikler yoluyla gözlenmektedir: fazı, üstel faz ve maksimum biyokütle verimi (asymptote) lag. Bir örnek olarak, kapsid proteini (Şekil 2A) için büyüme eğrisi modellenmiş üslü faza gecikme fazı dik tırmanmaya Şekil 2B dinamik arsa aynı klonu için Siyahtan beyaza renk yoğunluğunda hızlı bir değişiklik ile yeniden üretilir .

Yüzeylerde genelinde klon dağılımının küresel resmini elde etmek için, GL türetilen fenotipik sınıflandırmalar (Şekil 3) kullanılmıştır. Burada dört fenotipleri her çubuğun yüksekliği, belirli bir substrat için bu fenotip sergileyen klonların sayısını gösterir dört çizelgeleri içine ayrıdır. Verilerdeki Aykırı fu "kazanç düşen klonlar olarak kabul edilirnction "ya da" işlev "kategorisinde kaybı. Aykırı sonra bireysel olarak aranmalıdır ve deneysel daha yakından incelenmiştir yapabilirsiniz. Buna ek olarak, global analiz deneyde substrat sapmaları tanır. Örneğin fenilalanin, malik asit, ve glisin gibi Substratlar bir "büyüme" sınıflandırması ile sonuçlanmıştır. Tutarlı tüm klonlar arasında, hiçbir büyüme sınıflandırması düşmek Malzameler, ağır aşağı fonksiyonel karakterizasyonu ağırlıklı değildir.

Metabolomik

bilinmiyor faj genleri eksprese eden klonlardan katabolik metabolitler ürünler kullanılarak belirlendi. Kısaca, klonlar öncesinde metabolomiks çekirdek imkan GC-TOFMS analiz için gönderilmeden küme kültür ortamında sürekli bir kültür ya da seri geçit ya da altında yetiştirilir. Seçilen çekirdek tesis tarafından uygulanan GC-TOFMS için örnek işleme, analiz ve normalleşmesi ile ilgili detaylar için Fiehn ark. 31 Bri bakınızefly soğuk özütleme çözücüsü ile 1 ml 'lik numuneler girdaplanmış ve 5 dakika boyunca soğuk bir banyoda sonike edilmiştir, bundan sonra, her numune, ilave edilir. Örnekler Son olarak santrifüjlenir ve numunenin yarısı dökülmüş ve analiz için kurutulur. Özler, saflaştırılmış ve gaz kromatografisiyle üzerine yüklendi ve daha sonra daha sonra kütle spektrometresi nakledilmeden önce dahili tutucu göstergesi işaretleri ile çivili. Her bir örnek için kromatogramdaki tüm tespit sinyaller için sinyal yoğunlukları bildirilmiştir şekilde analiz edilir. Normalleştirilmesi için, her bir numune için tepe bolluğu toplanır ve toplam pik bolluk kümedeki tüm numuneler arasında ortalama edilir. Numune başına Metabolit bolluğu numunenin tepe bolluğu bölü ve sonra örnek setinin ortalama pik bolluğu ile çarpılır. Elde edilen veriler araştırma metabolitler analizi için kullanılır.

Metabolomik tekrarlanabilirliği Doğrulama için gerekliHer kültürleme yöntemi için uygun numune boyutunu belirler. Numune içinde görülür hassasiyet ve numune arasında görülen değişimini belirlemek için, her iki, n = 3 ve n = 6 veri setleri incelendi (Şekil 5B) için ortalama (S M) standart hata boyutları. Ne olursa olsun, sürekli kültür (CC) örneklem büyüklüğü, veri% 1'den az 1.5 ≤ S M vardı. Medyan S M s 221 ve 300 idi ve değerler, 0 5 ila 10 x 7.55 ve 3.74 x 10 5 n = 3 ve n = 6, sırasıyla arasında değişmektedir. S M s de numunenin her set için hesaplandı seri kültürü (SC) yönteminde çoğaltır. Yine, veri% 1'den az 1.5 ≤ S M, 137 medyan S M ve 0 x 3.51 10 5 Bir dizi vardı. S M her numune seti arasındaki dağılımları (CC n = 3 vs karşılaştırmak SC vs. CC, n = 6, CC, n = 3 genel SC, n = 3 ve CC n = 6, n = 3) bir permütasyon testi yapıldı. distribya sürekli kültür S M veri kümesi değerleri ve Katkı seri kültürü S M değerleri (p-değeri = 0.0) dağılımı önemli ölçüde farklı değildi. Ancak, sürekli kültür n = 3 veri S M değerlerinin dağılımı (1,908804 x 10 -49 = p-değeri) S M sürekli kültür değerleri n = 6 verilerin bu önemli ölçüde farklı oldu. Son olarak, metabolitin başına varyasyon katsayısı ve kalite güvence (QA) aşama uygulanmasından sonra (Şekil 5C) önce karşılaştırılmıştır. Toplamda, 210 metabolitleri QA boru hattının (veri% 40) uygulanmasından sonra çıkarıldı. Kaldırıldı verilerin% 1'den azı% 2 ~% 5 metabolitleri verileri daha önce E. gözlenen asla, iç standart verileri ~, sıfır metaboliti bolluk vardı E. coli ve diğer metabolitlerinin (>% 30), 1 'den daha büyük bir farklılaşma katsayısı vardı.

MAP analizi ile, küresel observatio gibins bilgi metabolomik tekliflerin derinliği bir başlangıç ​​anlayış sağladı. Küresel bir resim elde etmek için, klonlar hiyerarşik klon-metabolit profilleri, ilgili fonksiyonları ile potansiyel klonlar ve klon-metabolit aykırı (Şekil 6) hakkında bilgi veren göreceli metabolit miktarlara göre kümelenmiş bulundu. Protein fonksiyonları vurgulamak için, metabolitler ayrılmış ve ortak metabolik yollar dayalı gruplandırılmıştır. Ön sonuçlar, bu analiz kullanılarak, (klonlar vurgulanır, Şekil 6) metabolomiks farklı sınıflardan genleri ayırma yeteneğine sahip olduğu açıktı. Buna ek olarak, metabolomiks verilerle aykırı kimlik, her klon-metaboliti çifti için standart puanlar (z skorları) hesaplanarak belirlendi. İstatistiksel önem sağlamak için, aykırı verilerin sadece 5 paya, 2 bir Z skoru değeri olan bir klon-metabolit çifti olarak tanımlandı (veriler gösterilmemiştir).

ether.within-page = "always"> Şekil 1
Şekil fenotip sınıflandırmaların 1. Tanımlar. Büyüme seviyesine (GL) ve maksimum büyüme oranı arasındaki (A) ilişki. Kırmızı çember veri noktaları yok substrat kullanımına çok az gösteren büyüme eğrileri temsil etmektedir. (B) Boxplot gösterimi minimal büyüme oranı (<0.15 OD / saat) ile büyüme eğrilerinin dağılımına göre büyüme eşiği tanımlayan. (C) GL varyans ve standart sapma alt tabaka D-galaktoz için hesaplanır. Kısa kesikli çizgiler, iki standart sapma uzakta ortalamadan temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

highres.jpg "/>
Hassasiyet ve farklılaşma yoluyla Şekil 2. MAP doğrulama. (A) açıklamalı yapısal (Kapsid) ve metabolik klonlar için büyüme eğrileri (Tiyoredoksin), iki yeni metabolik klon (EDT2440, EDT2441) ve klonların ortalama yanıt sakaroz, D- üzerinde yetiştirilen galaktoz ve D-mannoz MAP'ler içinde. Mavi çizgiler tekrarlanan veriler arasında görülen standart hata gösterir (n = 3). (B) 47 farklı klonlar için büyüme eğrileri sükroz, D-galaktoz ve D-mannoz ısı haritaları olarak temsil edilir. açıklamalı yapısal (yeşil daire) ve metabolik klonlar (turuncu daire), iki yeni metabolik klon (koyu ve açık mavi daireler) ve ortalama yanıt (kırmızı daire) vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

pload / 52854 / 52854fig3highres.jpg "width =" 700 "/>
Birden yüzeylerde genelinde her fenotip için Şekil 3. Klon dağılımı. Fenotip-klon 72 karbon özgü büyüme koşulları karşısında 47 klon için saymak. Tablo her fenotip doğrudan sayıları sağlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Sürekli kültür aparatının yapımını ayrıntılı Şekil 4. diyagramı. (A) α-γ sürekli kültür reaktörün limanlarını inşa etmek için kullanılan adımlar, (B) adımlar (C dışarı akış sürekli kültür reaktörünün liman ve oluşturmak için kullanılan ) portları δ ve sürekli kültür biberonun ε inşa adımlar. = "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Sunulan Phenomic yöntemlerin Şekil 5. karşılaştırması. Çoklu fenotipik tahlil plakaları (MAP), sürekli kültürleri ve seri kültürlerin hazırlanması için (A) iş akışı. (B) ortalama standart hatası (S M) yüzdesi sayar ikisi n = 3 ve n = metabolitler sürekli kültürü (CC) ve seri kültürü (SC) hazırlama yöntemleri için 6 örnek boyutları. Y-ekseni, bir log ölçeğinde üzerindedir. (C) metaboliti başına varyasyon (CV) katsayılarının dağılımları, öncesi ve sürekli kültür (CC) yöntemi için QA boru hattının uygulanmasından sonra.g5highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Sürekli kültür içinde büyütülebilir klonlann Şekil 6. metabolomic profilleri. Metabolitlerin kümesi için ortalama metabolit bolluk Sürekli kültür içinde yetiştirilir 84 klon için çizilir. Açıklamalı (Kapsid) yapısal ve metabolik klonlar (Tiyoredoksin), iki yeni metabolik klonlar (EDT2440, EDT2441) ve ortalama metabolik yanıt metabolit profilleri kırmızı vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bileşik Karbon Azot Kükürt Fosfor
Gliserin - 0.40% 0.40% 0.40%
Amonyum klorid 9.5 mM - 9.5 mM 9.5 mM
Sodyum sülfat 0.250 mM 0.250 mM - 0.250 mM
Magnezyum sülfat 1.0 mM 1.0 mM - 1.0 mM
Potasyum fosfat 1.32 mM 1.32 mM 1.32 mM -
Magnezyum klorür - - * -
Potasyum klorür 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM
Kalsiyum klorür 0.5 uM 0.5 uM 0.5 uM
Sodyum klorit 5 mM 5 mM 5 mM 5 mM
Ferrik klorit, 6 uM 6 uM 6 uM 6 uM
L arabinoz % 0.10 % 0.10 % 0.10 % 0.10
MOPS pH 7.4 1x 1x 1x 1x

Tablo 1. bileşikler ve MAP'ler kullanılan farklı bazal ortam konsantrasyonları. * Magnezyum klorid, 1.0 mM ikame edilir. 1x MOPS = 40 mM MOPS, 4 mM Trişin.

L-lisin
Karbon substratlar Azot yüzeyler Kükürt yüzeyler Phosphorus yüzeyler
2-deoksi-D-riboz 2-deoksi-D-riboz 1-buten-sülfonik asit adenosin-5-monofosfatı
4-hidroksi-fenil asetik asit asetamid asetil sistein beta-gliserofosfat
asetik asit adenin D-sistein Creatine
adenosin-5-monofosfat adenozin D-metiyonin D-glukoz-6-fosfat
adonitol allantoin dietil-ditiofosfat dietil-ditiofosfat
alfa-D-glükoz p-feniletilamin DL-etionin DL-alfa-gliserofosfat
alfa-D-laktoz Biüre glutatyon potasyum fosfat
alfa-D-melebiose sitidin izetionik asit sodyum pirofosfat
sitrik asit sitozin L-sisteik asit sodyum tiyofosfat
D-alanin D-alanin L-sistein
D-arabinoz D-asparagin L-djenkolic asit
D-arabitoldür D-aspartat L-metionin
D-asparagin D-sistein Magnezyum sülfat
D-aspartat D-glukosamin metan sülfonik asit
D-cellubiose D-glutamik asit N-asetil-DL-metionin
D-sistein Dl-alfa-amino-N-bütirik asit N-asetil-L-sistein
D-fruktoz D-metiyonin Potasyum-tetra-thionate D-galaktoz D-serin sodyum tiosülfat
D-glukosamin D-valin sulfanic asit
D-glükoz gama-amino-N-bütirik asit boğa
D-glukoz-6-fosfat glisin taurokolik asit
D-glutamat guanidine tiyoüre
D-mannoz histamin
D-rafinoz inozin
D-riboz L-alanin
D-şalisin L-arginin
D-serin L-asparagin
D-trehaloz L-sitrulin
D-ksiloz L-sistein
dulsitol L-glutamik asit
gliserin L-glutamin
glisin L-glutatyon
i-eritritol L-histidin
inozin L-izolösin
L-alanin L-lösin
L-arabinoz L-lisin
L-arabitoldür L-metionin
L-asparagin L-ornitin
L-aspartat L-fenil-alanin
L-sisteik asit L-prolin
L-sistein L-piro-glutamik asit
L-fukoz L-serin; L-treonin
L-glutamik asit L-triptofan
L-glutamin L-valin
L-izolösin N-asetil-D-glukosamin
L-lösin putrescine
tiyoüre
L-metionin timidin
L-fenilalanin timin
L-piro-glutamik asit tyramine
L-ramnoz tirozin
L-serin uridin
L-sorboz
L-treonin
L-triptofan
L-valin
L-ksiloz
laktat
laktuloz
malat
miyo-inositol
oksalik asit
potasyum sorbat
propiyonik asit
putrescine
kinik asit
sodyum piruvat
sodyum sukkinat
sakaroz
timidin
ksilitol

MAP Deneylerde kullanılan substratların Tablo 2. listesi.

Discussion

Burada, biz varsayılan faj genlerinin fonksiyonel karakterizasyonu için Phenomic yaklaşımlar sunuyoruz. Izleme teknikleri ana anabolik metabolizmasının sahip gelişmiş bir tahlil içerir, Çok-fenotip tahlil plakaları (MAP), katabolik metabolizmanın efekt ölçebilen metabolitler kurulan yöntemi, ilave olarak. Biz yüksek verimli işleme ve analiz 24 için izin bu teknolojilerden kaynaklanan büyük veri kümelerini yönetmek için ek araçlar sağladı. Son olarak, açıklamalı bir faj kapsid proteini, faj tiyoredoksin, iki farazi metabolik faj genlerinin ve ortalama deneysel yanıt karşılaştırılması yoluyla biz fenotipik eğilimler ve aykırı değerlerin belirlenmesi belirlenmesi üzerinde durularak, veri setleri ve gen sınıfları hem yorumlamak için çeşitli stratejiler öneriyorum.

Belirtildiği gibi, her iki yaklaşım kantitatif ev sahibi metabolizması sadece yarısını ölçün. Herhangi bir göreli fonksiyonu yorumlamaksoruşturması kapsamında yeni proteinler, her iki yöntemle elde edilen veriler fonksiyonu kanıt sunmaları gerekmektedir. Bu mevcut yazının bir odak olmasa da, her Phenomic yönteminden veri çıkışları gibi rasgele orman ve temel bileşen analizi gibi kümeleme teknikleri odaklanmak kombinatoriyel analizlerle alınır. Ayrıca, kombine analiz kaynaklanan hipotezler sonra geleneksel genetik metodolojiler tarafından onaylanmalıdır.

Son olarak, yöntemler ağır bakteriyel fizyoloji etkilenir ve bu nedenle aynı standartları izler sundu. Her iki yöntem yapılırken, düşünceler ile denediği bağımsız, klonal gruplar sağlamak için yapılması gereken; kirlenme önlenir; tek bir değişken test ediliyor; ve uygun kontroller aynı anda koştu ediliyor. Bu noktalar hesaba takdirde herhangi bir fizyolojik deneyinde benzer sonuçlar açık, neden olur.

Çoklu fenotipik tahlil plakaları(MAP)

MAP'ler geliştirilmesi büyük bir geçiş miktarının ve mevcut teknolojilerde (Şekil 5A ve Tablo 1,2) göre adapte deneyi sağlar. Tahlil tüm mikrobiyoloji laboratuarları mevcut malzemeleri, teçhizat, ve temel teknikleri kullanır. sonraki veri işleme ve analiz için bir hesaplama boru hattının eklenmesi, PMAnalyzer 24, hızlı veri yorumlama sağlar. Buna ek olarak, yaklaşım, hem deneysel ve analitik açıdan kolayca ayarlanabilir ya da özel amaçlar için ayarlanmış. Veri büyük bir kısmı bölümünde 4 özetlenen filtreleme geçmek başarısız olursa, örneğin, bir el sorunları tanımlamak için büyüme eğrileri aracılığıyla elemek yapabilirsiniz. Sorun sıkı filtre parametreleri nedeniyle ortaya çıkarsa, senaryoya ayarlamalar yapılabilir. Alternatif olarak, sorunları deneysel işlemle ilişkili ise (yani, uzun süreli yoğuşma, uygunsuz bakteriyel cel transferils, vs.) sonra ek çoğaltır kolayca tekrar edilebilir.

Cuevas et al., 24 de açıklandığı gibi, PMAnalyzer tutarlı bir otomatik boru hattı olarak ayrıştırma ve analiz komut yürüten bir sarıcı komut dosyası olarak yazılmış tek bir bash programıdır. Tüm komut üçlü verileri arasında her zaman noktası için medyan değerini alarak 25 ° C'de Git deposundan serbestçe erişilebilir ve daha sonra gecikme süresini elde etmek için lojistik eğri, maksimum büyüme oranı, asimptotunu ve yeni bir terim, Büyüme Seviye parameterizes. medyan değeri büyük aykırı etkisini azaltmak için Çalışmamızda ortalama üzerinde seçildi, ancak komut dosyası kolayca çoğaltmak verilerin ortalamasını hesaplamak için adapte edilebilir. Azaltılmış varyasyon verileri çoğaltmak (Şekil 2A) boyunca görülen (SE) nedeniyle bir lojistik eğrisi için PMAnalyzer medyan kullanımını sürdürmüştür. Buna ek olarak, bu çalışmada büyüme için kesilir (GL ≥ 0.4) dete olduveri Büyüme Düzeyi ve maksimum büyüme oranı karşısında nasıl ayırdığını karşılaştırarak rmined (Şekil 1A, B). Bu yeniden tanımlanmasını gerektiren bu terim değişebilir kullanılan alet ve model sistemine bağlı olarak değer kesti.

Bizim tahlil önemli bir avantajı biz Büyüme Düzeyi (GL) olarak tanımlayan genel mikrobiyal büyümeyi, karakterize tek bir parametre kullanarak fenotipleri karşılaştırmak için yeteneğidir. GL harmonik ortalama olduğunu ve bu nedenle verilerin büyük aykırı etkilerini azaltır. kaymıştır lojistik takılan değerlere sahip bir harmonik ortalama kullanımının büyüme özet deneme yanılma yoluyla geldi edildi sağlamak. Diğer yöntemler büyüme dahil ayırt çalıştı: Bu geçen süre, belirli eğri parametreleri (yarım μ max μ max ve taşıma kapasitesi), tayini (R2) katsayısına ve belirli eğrisi parametreleri ile çarpılır R2 kombinasyonlarını ulaşmak için. Kaydırılmış bir harmonik ortalama kullanmaGL lojistik-fit değerleri böylece seçim yöntemi oldu büyümeyi değerlendirirken en büyük aralığı sağladı. Unutulmaması gereken bir husus dinamik büyüme eğrisi desenleri tek bir parametre veya bir monte modeli kullanırken kaybolmuş potansiyeline sahip olmasıdır. Örneğin, lojistik eğri ve GL bireysel eğri parametreleri bifazik büyümeyi temsil aciz. Tek bir karbon ortamda, bir büyüme bu etki, alt-tabaka, alt-tabaka kullanım veya vardiya her iki dönüşüm, viral protein arabuluculuk eder. Birden fazla büyüme parametreleri dikkate değilken potansiyel kayıp Ek etkileri şunlardır: uzun süreli gecikme süresi, viral makine veya ürün artan yükü öneren; Hızla enerji üretim yolları barındırmak için birleştiğinde viral proteinleri düşündüren, üstel fazı hızlandırılması; ana besin alımı ve anabolizma viral desteğe ima biyokütle oluşumu ya da daha yüksek seviyelerinin, (veriler gösterilmemiştir). Böylece, (doğmakta olan büyüme eğrilerini komplo

MAP'ler yapısal ve metabolik genler tarafından katkıda farklı tepkiler göz önüne alındığında, söz konusu farklı alt tabaka sınıfları protein fonksiyonu için en büyük kanıt olduğu görülmektedir. Örneğin, metabolik proteinler genellikle merkezi metabolizma 16,32 barındırmak için spesifik olan sınırlayıcı besin, edinimi ile ilişkilidir. Ön MAP deneyleri merkezi metabolizma karbon kaynakları (Şekil 2A) üzerinde büyüdüğü zaman varsayılan metabolik faj genleri barındıran klonlar artmış bir lag fazı olduğunu ortaya koymaktadır. Tersine, konakçı enerji ve dNTP havuzları büyük boyutlara gerektiren olası yapısal genleri taşıyan klonlar, yüzde ilişkin büyüme üzerinde yanlış pozitif tepki nedenral ve amino asit metabolizması, karbon yüzeyler. (Gösterilmemiş olan Şekil 2A ve veri) mikroskopi ile gözlemlenen Bu durum, ana ipliklenmenin ve / veya inklüzyon cisimcikleri ile sonuçlanan çözünmeyen proteinlerin birikmesi muhtemeldir. Daha fazla analiz, bu ön sonuçlarını doğrulamak için gerekli iken, MAP belirli faj gen sınıflarının fonksiyonlarını hipotez için ilişkili fenotipik yanıtları almak yeteneğine sahiptir.

Bilinmeyen viral proteinlerin aydınlatılması ek olarak, MAP bireysel bakterinin fonksiyonel ve metabolik çeşitlilik ya da bakteri topluluğu araştırmak için yeni bir kaynaktır. MAP bileşenleri bakterilerin bir dizi büyümeyi desteklemek kolay değiştirilmesi için tasarlanmıştır; deniz, Okzotrofik ve anaerobik mikroplar da dahil olmak üzere. Farklı bakteriyel cinsi MAP'ler üzerinde desteklenebilir daha önce tanımlandığı bazal ön büyüme ortamı ilave veya ayarlanmış kimyasal türleri gerektiren bu çabalar kolaylaştırmak.MAP'ler bu kullanım bir not gibi tripton, maya özütü ve pepton olarak katkı maddelerinin kullanımını yasaklayan, belirlenen medyayı muhafaza etmektir.

Metabolomik

metabolitler alan kütle spektrometresi ile tespit izole edilen metabolitler dahil metabolit veri tabanları, bağlıdır. Burada seçilen çekirdek tesisi büyük metabolomiks veritabanlarından birine sahiptir. Diğerleri daha önce bizim ana kaydedilmiştir asla ederken İlginçtir, bizim denemelerle ortaya çıkan metabolitlerin yarıdan fazlası (~% 65) tanımlanamayan idi, Escherichia coli (örnekler şunlardır: İndol 3 asetik asit 33, salisilik asit 34, ve dihidroreçine asit 35). Bu durum bitki metabolitleri veya soruşturma altında belirli proteinlerin doğru veritabanının güçlü bir önyargı ya isnat edilebilir. Ne olursa olsun, sonuç, veri sunumunun ve analiz için bilinen metabolitlerin sınırlı bir sayıdır. FuTure, çeşitli veri tabanları kullanılarak birden metabolomik yöntemleri daha metaboliti kapsama sağlayacak.

Halen, hem bilinen hem de karşılaştırma ve bizim yeni viral proteinleri zıt yaparken bilinmeyen metabolitleri kullanılır. Bu yaklaşımı kullanarak, işlevsel olarak benzer proteinleri barındıran klonlar, eksiksiz metabolomic profilinde artan benzerliği paylaşacak varsayımında. Ön metabolomik analiz yapısal ve metabolik genler açıkça birbirinden ayrı yok ederken (Şekil 6) korelasyon yapmak aşırı eksprese zaman, bu genlerin konak üzerinde benzer etkiler gösteren ortaya koydu. Örneğin, yakından varsayılan metabolik genlerle açıklamalı kapsid gen kümeleri Bu çalışmada, EDT2440 ve EDT2441 vurgulanan. Bir kamuya açık transmembran topoloji ve sinyal peptid belirleyicisi programı kullanarak araştırmalar hem farazi metabolik genler tek bir transmembran liman kanıt gösterdi. İlginçtir 5 inci dışarı(En dendrogram kısmını sol) Birinci küme grubunda e 9 klon aynı topoloji programı kullanarak transmembran etki tahmin. Başka araştırmalar da ihtiyaç vardır, bununla birlikte, bu klonlar aşırı ekspresyonu sırasında mevcut metabolitler zar ya da yapısal yük kaynaklanan selüler gerginlik tepkisi ile ilişkili olduğu görünmektedir. Bu kanıt metabolomiks veriler gürültü artan bir miktarda sahip ise, yöntem içinde ve bir gen sınıfı arasında, her iki genin genel etkileri, farklı sinyal vurgulama yeteneğine sahip olduğunu desteklemektedir. Yöntem, gen fonksiyonu belirli bir bilgi çıkarma yeteneğine sahip olup olmadığını belirlemek için, metabolitleri özellikle metabolik yolların gruba ayrıldı. Bir klon, tek bir yola özgü metabolitleri etkiliyorsa hipotezi varlık, ardından aşırı eksprese edilen gen bu yol aktiftir. Bizim metabolomiks kalite güvence boru hattının kurulması öncesinde, ön veriler bir yere ortayad underrepresented metabolitler ilişkili oldukları yollar üzerinde küçük bilgi veren, genellikle "bilinmeyen" vardı (veriler gösterilmemiştir). Önceden işlenmiş metabolomiks Ancak veriler, metabolit profilleri çoğunluğu benzer ve sadece bilinmeyen ve bilinen metabolit bolluk belirli bir sayıda, örneğin putreskin ve urasil (Şekil 6) için, klonlar arasında farklılık olduğunu ortaya koymaktadır. Protein fonksiyonu çabalarının daha yüksek çözünürlük sağlamak deneysel karakterizasyonu fonksiyonel bazlı metabolitin "delikleri" doldurmak için kullanılabilir bilinen faj genlerinin karşı yeni faj genleri karşılaştırmak için yapılıyor. Bu tekniği kullanarak, bilinen viral genlerin tahsis işlevi bilinmemektedir genlerinin işlevi için bir referans içerir. Bununla birlikte, metabolomic analiz sınırlayıcı faktör veritabanının boyutu ve alaka olduğunu. Bu araştırmaya ilişkilendirilebilir metabolomic veritabanları geliştirilmesi gereken bu sınırlamalar, düzeltmek için; böyleE. ASKA koleksiyonuna özgü bir metabolitlerin veritabanı ve bolluk olarak E. coli klonları olan tek ORF 36 aşırı ifade edilir. Lawerence Berkeley Ulusal Laboratuvarı'nda araştırmacılar modeli bakteri 37 tüm mutant kütüphaneleri özel metabolitlerin ilk kapsamlı bir veritabanı derlenmiş bu tür veritabanları ihtiyacı için kanıtlar 2013 yılında sağlandı. Bu araştırma fenotip ve genotip arasındaki açık bağlantıyı açığa belirli metabolitlerin kullanımı için gerekli olan genlerin içine yeni görmemizi sağladı.

Bir araç olarak metabolomik göz önüne alındığında, bu işleme rejimi çekirdek tesisinde izlenen tanımlamak önemlidir. En deneysel prosedürlerin bir dışlayıcı kullanım araçlara ilişkin gün-gün varyans olduğunu. Bugüne kadar tüm GC-MS analizi her bir analitik çalışma dahildir iç standartların kullanımı uygular; Ancak, projeye özel iç örneklerin eklenmesi </ Em> deney her gün ilave varyans kaldırır koştu. Bu hususlar normalleştirme sorunları ve önyargıları önlemek için erken ele alınmalıdır. Başka bir çözüm, aynı makine üzerinde bir çekirdek tesiste ve tek bir toplu, herhangi bir nüve imkan mevcut bir seçenek olarak tüm örneklerin işlemektir.

çeşitli araçlar hem tanıttı ve yeni ekran ve işlevsel bilinmeyen faj genleri karakterize etmek anlamına gelir sağlayan bu yazının yeniden araştırdı. hesaplamalı boru hatlarının düzene kullanımı ile deneysel tekniklerin sadelik ve uyum bu yöntemlerin araştırma çabaları ve alanlarda geniş bir yelpazede için geçerlidir sağlar. Amacımız burada sunulan Phenomic yaklaşımlar eşit işlevsel tanımsız sistemlerine ek olarak yeni faj proteinlerinin daha fazla araştırma yardımcı olacaktır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Sterivex Filter Fisher Scientific SVGP01050 Millipore
0.22 µm Millex Filters Fisher Scientific SLGV033RS Millipore
0.22 µm SteriCap Filter Fisher Scientific SCGPS02RE Millipore
0.22 µm Omnipore membrane filters Millipore JHWP02500 Millipore
96-well micro-titer plates VWR 82050-764 Standard F-Bottom 96 well Microplates
2 ml 96-well plate Fisher Scientific
Adhesive seal plate film Sigma-Aldrich Z369667
2 L Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-70
125 ml Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-50
1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon Cole Parmer EW-45509-04
Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. Cole Parmer EW-45500-30
Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. Cole Parmer EW-45500-34
Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing Cole Parmer EW-45505-31
Male Luer with lock ring x female Luer coupler Cole Parmer T-45508-80
Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD Fisher Scientific 6149-0002
Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD SaniPure AR400002
Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID SaniPure AR400007
Variable flow mini pump (peristaltic pump) Fisher Scientific 13-876-1
Magnetic stirrer Velp Scientifica F203A0160
Forceps Fisher Scientific 14-512-141 Millipore* Filter Forceps
Multi-plate spectrophotometer plate reader Molecular Devices Analyst GT
Filter manifold Fisher Scientific XX10 025 02
Software:
Python version 2.7.5 http://www.python.org/
PyLab module http://wiki.scipy.org/PyLab
R version 3.0.1 http://www.r-project.org/
reshape2 library http://had.co.nz/reshape
ggplot2 library http://ggplot2.org/
Gene Composer PSI Tech Portal http://www.genecomposer.net
Services:
West Coast Metabolomics Center UC Davis http://metabolomics.ucdavis.edu
DNA 2.0 https://www.dna20.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, (1), 69-114 (2000).
  2. Hendrix, R. W. Recoding in Bacteriophages. Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).
  3. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (22), 14250-14255 (2002).
  4. Breitbart, M., et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271, (1539), 565-574 (2004).
  5. Dinsdale, E. A., et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature. 452, (7187), 629-632 (2008).
  6. Vega Thurber, R. L., et al. Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (47), 18413-18418 (2008).
  7. Pedulla, M. L., et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell. 113, (2), 171-182 (2003).
  8. Calendar, R., Abedon, S. T. The bacteriophages. Oxford Univeresity Press. (2006).
  9. Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS microbiology letters. 236, (2), 249-256 (2004).
  10. Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules. Systematic and Applied Microbiology. 16, (4), 638-647 (1993).
  11. Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses. Oceanography. 20, (2), 135-139 (2007).
  12. Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature. 424, (6950), 741 (2003).
  13. Mann, N. H., et al. The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains. Journal of bacteriology. 187, (9), 3188-3200 (2005).
  14. Lindell, D., et al. Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (30), 11013-11018 (2004).
  15. Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (30), 11007-11012 (2004).
  16. Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations. PLoS biology. 3, (5), e144 (2005).
  17. Rohwer, F., et al. The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages. Limnology and Oceanography. 45, (2), 408-418 (2000).
  18. Miller, E. S., et al. Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage. Journal of bacteriology. 185, (17), 5220-5233 (2003).
  19. Thompson, L. R., et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (39), E757-E764 (2011).
  20. Paterson, S., et al. Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution. Nature. 464, (7286), 275-278 (2010).
  21. Seguritan, V., et al. Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins. PLoS computational biology. 8, (8), e1002657 (2012).
  22. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture Medium for Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119, (3), 736-747 (1974).
  23. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology (Reading, England). 147, (Pt 2), 3241-3247 (2001).
  24. Cuevas, D. A., et al. Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles. F1000Research. (2014).
  25. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and environmental microbiology. 56, (6), 1875-1881 (1990).
  26. Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. Available from: http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf (2014).
  27. Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).
  28. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics (Oxford, England). 27, (6), 863-864 (2011).
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PloS One. 6, (3), e17288 (2011).
  30. Welch, M., et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS One. 4, (9), e7002 (2009).
  31. Fiehn, O., et al. Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies. The Plant journal: for cell and molecular biology. 53, (4), 691-704 (2008).
  32. Zeng, Q., Chisholm, S. W. Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation. Current biology: CB. 22, (2), 124-128 (2012).
  33. Shindy, W. W., Smith, O. E. Identification of plant hormones from cotton ovules. Plant physiology. 55, (3), 550-554 (1975).
  34. Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (10), 4076-4079 (1995).
  35. Chappell, J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology. 107, (1), 1-6 (1995).
  36. Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12, (5), 291-299 (2005).
  37. Baran, R., et al. Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype. ACS chemical biology. 8, (1), 189-199 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics