लर्निंग के असतत चरणों के दौरान कृन्तकों में दूर से मुंह बंद तंत्रिका गतिविधि के लिए एक विधि

Behavior

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Robinson, S., Adelman, J. S. A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning. J. Vis. Exp. (100), e52859, doi:10.3791/52859 (2015).

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Abstract

इस प्रोटोकॉल जानवरों सीखने और स्मृति कार्यों में लगे हुए हैं, जबकि अस्थायी रूप से और दूर से असतत मस्तिष्क क्षेत्रों में neuronal गतिविधि चुप्पी के लिए कैसे करें। दृष्टिकोण को जोड़ती है pharmacogenetics (डिजाइनर रिसेप्टर्स-विशेष रूप से सक्रिय-दर-डिजाइनर-ड्रग्स) एक व्यवहार प्रतिमान (संवेदी शर्त) के साथ सीखने के विभिन्न रूपों के बीच भेद करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। विशेष रूप से, वायरल की मध्यस्थता वितरण एक आनुवंशिक रूप से संशोधित निरोधात्मक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर कृंतक में एक असतत मस्तिष्क क्षेत्र में (डिजाइनर रिसेप्टर) को व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। डिजाइनर रिसेप्टर अभिव्यक्ति का स्तर ऊँचा है जब तीन हफ्ते बाद, एक औषधीय एजेंट (डिजाइनर दवा) से पहले एक विशिष्ट व्यवहार सत्र के लिए प्रणालीबद्ध 30 मिनट दिलाई है। दवा डिजाइनर रिसेप्टर के लिए संबंध है और इस तरह के डिजाइनर रिसेप्टर व्यक्त कि न्यूरॉन्स के निषेध में परिणाम है, लेकिन अन्यथा जैविक रूप से निष्क्रिय है। मस्तिष्क क्षेत्र (2-5 घंटे के लिए खामोश निर्भरता बनी हुई हैडिंग) खुराक और प्रशासन के मार्ग पर। व्यवहार प्रतिमान के पूरा होने पर, मस्तिष्क के ऊतकों सही स्थान और रिसेप्टर अभिव्यक्ति के लिए मूल्यांकन किया है। इस दृष्टिकोण के व्यवहार की विशिष्ट घटकों को अलग-अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के योगदान को निर्धारित करने और व्यवहार मानदंड के किसी भी संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

Introduction

व्यवहार तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र के भीतर एक रोमांचक चुनौती जटिल व्यवहार के तंत्रिका substrates के निर्धारित करने के लिए है। इस तरह के स्थायी घावों, cannulae प्रत्यारोपण के माध्यम से अस्थायी मस्तिष्क निष्क्रियता और optogenetics के रूप में कई तकनीकें जटिल व्यवहार के subcomponents को असतत मस्तिष्क क्षेत्रों के योगदान की पहचान करने के लिए नियोजित किया गया है। इन तरीकों को सीखने के दौरान क्षेत्रीय विशिष्टता के बारे में हमारी समझ को सूचित करते हैं, प्रत्येक तकनीक सीमाओं के बिना नहीं है। विशेष रूप से, स्थायी घावों आमतौर पर इस तरह उनके प्रभाव प्रतिमान की अवधि के दौरान मौजूद हैं, व्यवहार परीक्षण करने से पहले आयोजित की जाती हैं। मस्तिष्क के ऊतकों को काफी नुकसान उत्पादन कर सकते हैं एक अल्पकालिक तंत्रिका inactivator (जैसे, tetrodotoxin) की प्रस्तुति शामिल है और सिर्फ पूर्व व्यवहार परीक्षण करने के लिए विषयों में तनाव पैदा कर सकते हैं कि केन्युलेशन अध्ययन करता है। इसके अलावा, केन्युलेशन के माध्यम से निष्क्रियता है कि चारों ओर ऊतक के क्षेत्र तक ही सीमित हैcannulae की नोक। Optogenetics विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में गतिविधि के अस्थायी नियंत्रण के लिए लचीलेपन की एक सीमा प्रदान करता है, जबकि अन्त में, यह लागत निषेधात्मक और तकनीकी रूप से मांग कर रहा है।

इन सीमाओं को फार्माकोजेनेटिक दृष्टिकोण (डिजाइनर रिसेप्टर्स-विशेष रूप से सक्रिय-दर-डिजाइनर-औषध, DREADDs) 1,2 का उपयोग कर surmounted किया जा सकता है। Pharmacogenetics की अवधारणा को परिष्कृत है, जबकि महत्वपूर्ण बात, तकनीक के निष्पादन सीधा है। एक संशोधित निरोधात्मक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर के लिए एक डीएनए टुकड़ा होता है कि विष (जैसे, NMDA, ibotenic एसिड) असतत मस्तिष्क क्षेत्रों में, इस तकनीक को एक एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) के निवेश शामिल है के अर्क शामिल है कि पारंपरिक stereotaxic शल्य चिकित्सा पद्धतियों के लिए इसी प्रकार (hM4Di; डिजाइनर रिसेप्टर) मानक प्रयोगशाला कृन्तकों के हित के क्षेत्र में (चित्रा 1 देखें)। वायरल वेक्टर भी एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (mcitrine) शामिल हैं। में शामिल एक बारकोशिकाओं के लिए, डिजाइनर रिसेप्टर (और रिपोर्टर प्रोटीन) ज़्यादा से ज़्यादा ~ 3 सप्ताह के बाद आसव व्यक्त कर रहे हैं और चुनिंदा अन्यथा जैविक रूप से निष्क्रिय डिजाइनर दवा के प्रणालीगत प्रशासन, clozapine-एन-ऑक्साइड से 2-5 घंटे के लिए सक्रिय किया जा सकता है (CNO) 1 3। प्रयोगकर्ता के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका गतिविधि पर सटीक है, फिर भी दूरदराज के अस्थायी नियंत्रण के साथ संपन्न होता है, क्योंकि pharmacogenetics कई चरणों में आयोजित की जाती हैं कि व्यवहार मानदंड के साथ विशेष रूप से अच्छी तरह से जोड़ती है। इस उदाहरण में, retrosplenial कॉर्टेक्स के योगदान (आरएससी) उत्तेजना प्रोत्साहन करने के लिए सीखने Pavlovian सीखने में अपनी भूमिका की तुलना में है, लेकिन दृष्टिकोण के इस संयोजन मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए योगदान कैसे विशिष्ट पहचान करने के लिए चाहते हैं कि किसी भी सवाल का नंबर करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जटिल व्यवहार।

वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है, जबकि इसके अलावा, वायरल और ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण सेल प्रकार विशिष्ट DREADD अभिव्यक्ति 2 को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जैसा कि मैंDREADD दृष्टिकोण को रोजगार जब निहित प्रयोगात्मक जोड़तोड़, प्रयोगात्मक डिजाइन और बाद में मात्रात्मक विश्लेषण की सावधानी से विचार के औषधीय और / या अन्य प्रकार के शामिल है कि व्यवहार मानदंड में आवश्यक है। DREADD दृष्टिकोण करने के लिए नए प्रयोगकर्ता वर्तमान DREADD प्रौद्योगिकी 2 की व्यापक समीक्षा करने के लिए भेजा जाता है।

प्रत्येक दिन, जीवों नई उत्तेजनाओं और घटनाओं और एक दूसरे से अपने संबंधों के बारे में जानने के लिए। यहां तक ​​कि एक परिचित वातावरण में, इस तरह के घर के रूप में, एक इन परिवर्तनों को सार्थक घटनाओं की भविष्यवाणी हो सकता है क्योंकि उत्तेजनाओं के बीच रिश्तों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए जल्दी है। इस तरह के प्रोत्साहन प्रोत्साहन (यानी, रिलेशनल) सीखने के लिए कई उत्तेजनाओं की conjoining शामिल है और पारंपरिक रूप से औसत दर्जे का टेम्पोरल लोब 4 के भीतर केन्द्र रहता है जो हिप्पोकैम्पस के साथ संबद्ध किया गया है। हालांकि, हिप्पोकैम्पस मौजूद है और न ही अलगाव में कार्य नहीं करता है; के भीतर और बाहर दोनों cortical क्षेत्रोंऔसत दर्जे का टेम्पोरल लोब के पक्ष हिप्पोकैम्पस गठन 5-7 के लिए महत्वपूर्ण संवेदी जानकारी प्रदान करते हैं। पारंपरिक स्थायी घाव के अध्ययन हिप्पोकैम्पस-निर्भर सीखने में cortical क्षेत्रों (उदाहरण के लिए, retrosplenial postrhinal और entorhinal cortices) के एक नंबर की भागीदारी के लिए मजबूर सबूत उपलब्ध कराने पर असतत चरणों के दौरान एक विशेष क्षेत्र की भूमिका को विचार करने के लिए अपनी क्षमता में सीमित कर रहे हैं 8-10 सीखने।

वर्तमान प्रोटोकॉल आरएससी एक 3-चरण संवेदी शर्त प्रतिमान 11,12 के एक एकल चरण के दौरान आरएससी मुंह बंद करने से प्रोत्साहन प्रोत्साहन सीखने के लिए आवश्यक है कि परिकल्पना परीक्षण। संक्षेप में, चूहों डिजाइनर रिसेप्टर होते हैं और ~ 3 हफ्ते बाद व्यवहार परीक्षण की शुरुआत करने से पहले डिजाइनर दवा (CNO) 30 मिनट प्रशासित रहे हैं कि एक एएवी की सुई लेनी प्राप्त करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, प्रयोगात्मक चूहों परीक्षण के पहले चरण (जब प्रोत्साहन प्रोत्साहन लेअर दौरान CNO प्राप्तनिंग होता है) और वे परीक्षण के अगले 2 चरणों के दौरान वाहन प्राप्त करते हैं। व्यवहार पर CNO के अनजाने प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए, डिजाइनर रिसेप्टर (hM4Di) के साथ चूहों को बढ़ावा और बजाय CNO के वाहन के साथ इंजेक्षन। वायरल अर्क और रिसेप्टर अभिव्यक्ति के सामान्य प्रभाव के लिए खाते में करने के लिए, डिजाइनर रिसेप्टर होते हैं और CNO प्रशासन नहीं करता है कि एक नियंत्रण वायरस दिखे।

एएवी के विभिन्न सीरमप्रकारों की एक संख्या आनुवंशिक सामग्री वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है। संयोजक या सिंथेटिक अणु शामिल अनुसंधान के लिए वर्तमान एनआईएच दिशानिर्देश transgene एक संभावित tumorigenic जीन उत्पाद या एक विष अणु या तो सांकेतिक शब्दों में बदलना नहीं करता है और एक के अभाव में उत्पादन किया जाता है, जिसमें कि एएवी (सभी सीरमप्रकारों) और पुनः संयोजक या सिंथेटिक एएवी निर्माणों का कहना है, सहायक वायरस, बीएसएल -1 सावधानियों (परिशिष्ट बी -1। जोखिम समूह 1 (Rg1) एजेंटों) 13 की आवश्यकता है। एएवी संरचना, उपयोगिता और सुरक्षा से संबंधित समीक्षा की एक संख्या 14,15 उपलब्ध हैं। विशेष रूप से, यद्यपिएएवी के साथ काम करते हैं, कृन्तकों में संभव प्रजनन 16,17 और संभावित कासीनजन तंत्र 18-20 से संबंधित चिंताओं के कारण, कुछ संस्थाओं बीएसएल 2 सावधानियों के उपयोग की आवश्यकता है। अनुसंधान रोग नियंत्रण और संयुक्त राज्य अमेरिका में जीन की हेरफेर के लिए वायरल वैक्टर का उपयोग करते समय पुनः संयोजक डीएनए अणु 13 शामिल अनुसंधान के लिए एनआईएच दिशा निर्देशों के लिए, केंद्र से आयोजित किया जाएगा, जहां अलग-अलग संस्थानों में निरीक्षण समितियों के साथ परामर्श करके उपयोग करने से पहले उचित बीएसएल की जाँच करें। व्यक्तिगत सुरक्षा, अन्वेषक प्रशिक्षण, वेक्टर नियंत्रण, परिशोधन, decontaminated सामग्री के निपटान, और बाद इंजेक्शन पशु आवास की आवश्यकताओं को इन दिशा निर्देशों के द्वारा निर्दिष्ट कर रहे हैं। इसके अलावा, परामर्श और उपयुक्त संस्थागत पशु की देखभाल का पालन करें और सुरक्षित हैंडलिंग, प्रशासन और एएवी के निपटान सुनिश्चित करने के लिए समिति के दिशा निर्देशों या समकक्ष संस्थागत निगरानी समिति के दिशा निर्देशों का प्रयोग करें।

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Protocol

जानवरों के इस्तेमाल ऑबेर्लिन कॉलेज संस्थागत पशु की देखभाल के द्वारा अनुमोदित और समिति का प्रयोग करें और प्रयोगशाला पशु 21 की देखभाल के लिए गाइड के अनुसार और उपयोग में हैं कर रहे हैं।

वायरल आसव के लिए 1. तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल बीएसएल 1 सावधानियों का उपयोग करता है। बीएसएल 2 सावधानियों, एक डिस्पोजेबल लैब कोट, दस्ताने, जूते शामिल हैं, नेत्र सुरक्षा और एक कण श्वासयंत्र (N95 के टाइप) को रोजगार जब आवश्यक हैं। बीएसएल 2 यौगिकों से निपटने के सभी व्यक्तियों को एक स्थानीय सार्वजनिक स्वास्थ्य एजेंसी द्वारा एक कण श्वासयंत्र के लिए परीक्षण फिट किया जाना चाहिए। हैंडलिंग और वायरल वाहक के भंडारण पर अतिरिक्त जानकारी के लिए Lowery और Majewska (2010) 22 का संदर्भ लें।

  1. 20 μl microcentrifuge ट्यूब में पहला प्रयोग, विभाज्य और दुकान अप्रयुक्त वायरस होने पर दोहराया ठंड और विगलन से बचने के लिए।
  2. किसी भी अनावश्यक वस्तुओं को दूर करने और 70% इथेनॉल के साथ सतह स्टरलाइज़ द्वारा काम की सतह तैयार करें। एक 1 की तैयारीएएवी अपशिष्ट decontaminating के लिए 0% ब्लीच समाधान। काम की सतह पर ब्लीच समाधान और एक बाँझ 10 μl सिरिंज से भरा बीकर रखें। सेट अप के दौरान कुचल बर्फ के साथ एक कंटेनर में एएवी साथ microcentrifuge ट्यूब रखें।
  3. एक मानक बेंच उपाध्यक्ष में वायरस के साथ microcentrifuge ट्यूब रखें। एएवी के कम से कम 4 μl के साथ एक 10 μl सिरिंज लोड करें। लोड करने के दौरान microcentrifuge ट्यूब के नीचे के खिलाफ सिरिंज की नोक मोड़ करने के लिए नहीं ख्याल रखना। सिरिंज में एएवी समाधान के 4 μl में कोई हवाई बुलबुले हैं कि सुनिश्चित करें।
  4. 10% ब्लीच युक्त बीकर में खाली वायरस ट्यूब के निपटान के। सप्लायर द्वारा निर्दिष्ट के रूप में वायरस का अप्रयुक्त भाग स्टोर।
  5. अपशिष्ट कंटेनर के लिए अतिरिक्त 10% ब्लीच जोड़ें, और अपशिष्ट decontaminated तरल अपशिष्ट निपटान से पहले 30 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं।
  6. संस्थागत दिशा निर्देशों के निर्देशानुसार एक biohazard कंटेनर में सभी सुरक्षा उपकरण और प्लास्टिक कचरे के निपटान। डेको10% ब्लीच का उपयोग वायरस के संपर्क में आया है कि किसी भी उपकरण या सतहों ntaminate।

2. सर्जरी

  1. Stereotaxic तंत्र के तहत और एक समर्पित वायरस से निपटने के क्षेत्र के रूप में नामित एक बगल अंतरिक्ष पर शोषक बेंच कागज रखकर शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करें।
    1. शल्य तंत्र के पास समर्पित वायरस से निपटने के क्षेत्र में एक 10% ब्लीच बर्बाद कंटेनर में रखें।
  2. संज्ञाहरण के एक स्थिर स्तर प्रेरित और शल्य चिकित्सा के लिए चूहा तैयार करते हैं।
    1. चेतना और सकल उद्देश्यपूर्ण आंदोलन की कमी का एक नुकसान होता है जब तक isoflurane गैस (1 से 3% की सीमा) और ऑक्सीजन (100% पर लगभग 1 एल / मिनट) का मिश्रण होता है कि एक प्रेरण कक्ष में चूहा रखें। शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान isoflurane संज्ञाहरण बनाए रखें।
    2. 6 गहरी संज्ञाहरण प्राप्त कर ली है, के बाद से थोड़ा कान के पीछे करने के लिए आंखों के बीच से चूहे दाढ़ी।
    3. एक के लिए प्रेरण कक्ष में वापस चूहे रखेंअतिरिक्त 1-3 मिनट।
    4. Isoflurane संज्ञाहरण प्रणाली stereotaxic सर्जरी की नाक शंकु से जुड़ा है सुनिश्चित करें। Stereotax को isoflurane के प्रवाह शुरू करने के लिए isoflurane ट्यूबिंग पर पानी निकलने की टोंटी खोलें। ऊपर निर्दिष्ट स्तरों पर isoflurane और ऑक्सीजन बनाए रखें।
    5. काटने पट्टी पर मुंह हासिल करने और कान सलाखों हासिल करने से एक stereotaxic तंत्र में चूहे रखें।
    6. चीरा करने से पहले शल्य साइट के लिए आंख आँखों के लिए स्नेहक और betadine लागू करें।
  3. आंखों को दुम लगभग 2 मिमी शुरू कर खोपड़ी के पृष्ठीय सतह पर त्वचा के एक 2.4 सेमी midline चीरा। खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए त्वचा वापस लेना। समय-समय पर सूखने से ऊतकों को रोकने के लिए शल्य साइट के हाशिये पर बाँझ 0.9% बाँझ खारा टपकाना।
  4. शीर्षस्थान और लैम्ब्डा जब तक खोपड़ी से साफ़ झिल्लीदार ऊतक स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं।
  5. खोपड़ी पर पृष्ठीय उदर निर्देशांक को मापने के द्वारा स्तर है कि यह सुनिश्चित करेंशीर्षस्थान और लैम्ब्डा पर। शीर्षस्थान और लैम्ब्डा पर पृष्ठीय उदर निर्देशांक कोई अधिक से अधिक 0.04 मिमी से भिन्न होते हैं जब तक तदनुसार stereotaxic डिवाइस को समायोजित करें।
  6. इस समय,% 2 के बीच और 2.5 isoflurane गैस को कम।
  7. निर्देशांक rezero, पर्वबिन्दु को ड्रिल लौटें और फिर वांछित औसत दर्जे का पार्श्व करने के लिए ड्रिल के लिए कदम और पूर्वकाल-पीछे समन्वय।
  8. पर एक छेद ड्रिल यह एक 28 जी जान फूंकना सिरिंज के लिए एक उपयुक्त आकार छेद का उत्पादन के रूप में एक 0.9 मिमी ड्रिल बिट का उपयोग समन्वय।
  9. 0.2 μl / मिनट की दर से वायरस देने के लिए आसव पम्प सेट करें। Stereotaxic डिवाइस के अर्क बांह में सिरिंज प्लेस और समन्वय वांछित में सिरिंज कम है। वायरस के वांछित राशि वितरित (0.1 μl 0.8 रेंज)। उदाहरण के लिए, 4 मिनट से अधिक एएवी के 0.8 μl देने के लिए।
    नोट: आदर्श अर्क मात्रा और ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र में वायरस के विशिष्ट फैल निर्धारित करने के लिए पायलट अध्ययन का संचालन।
    1. वायरस का वितरण सह रहा है के बाद10 मिनट सुई पथ में backflow को रोकने के लिए mplete जगह में सिरिंज छोड़ दें। धीरे धीरे बारे में 5 मिमी / मिनट की दर से सिरिंज बढ़ा। सभी निर्देशांक एएवी के साथ संचार किया गया है जब तक दोहराएँ।
  10. शल्य स्टेपल और कोट सामयिक एंटीबायोटिक मलहम के साथ घाव का उपयोग कर घाव को बंद करें।
  11. पोस्ट ऑपरेटिव दर्द प्रबंधन के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें।
  12. बिस्तर, एक ढक्कन और उचित signage के साथ एक पिंजरे में चूहे प्लेस और जानवरों की सुविधा के लिए चूहे वापसी।
    1. बीएसएल 2 सावधानियों के तहत काम कर रहे हैं, संस्थागत दिशा निर्देशों के द्वारा निर्दिष्ट समय की राशि (आमतौर पर 48-72 एचआर) के लिए बिस्तर इकट्ठा। एक biohazard अपशिष्ट कंटेनर में बिस्तर रखें।
    2. उनकी सुरक्षित निपटान के लिए दिशा निर्देशों के द्वारा निर्दिष्ट के रूप में सभी एएवी दूषित सामग्री के निपटान के।

3. व्यवहार उपकरण

नोट: संवेदी शर्त तंत्र एक मानक कंडीशनिंग चाम के होते हैंबेर एक स्टेनलेस स्टील ग्रिड फर्श के साथ (12 "एल एक्स 9.5" डब्ल्यू एक्स 11.5 "एच), 2 Plexiglas sidewalls और 2 धातु दीवारों।

  1. 2 हर्ट्ज पर लगीं जब दृश्य उत्तेजना घर में प्रकाश के रूप में सेवा करने के लिए एल्यूमीनियम दीवारों में से एक पर और के रूप में एक 2.8 डब्ल्यू प्रकाश माउंट। श्रवण उत्तेजनाओं देने के लिए कक्ष पर एक वक्ता माउंट (एक 10 सेकंड, 1500 हर्ट्ज, 78 डीबी शुद्ध स्वर और एक 10 सेकंड 78 डीबी सफेद शोर)।
    1. खाद्य कप में 45 मिलीग्राम खाना छर्रों वितरित करने के लिए एक खाद्य हॉपर का प्रयोग करें। खाद्य कप के भीतर, अवरक्त photocells के दौरान और उत्तेजनाओं और खाद्य पुरस्कार की प्रस्तुतियों के बाद, पहले भोजन कप में खर्च की गई कुल समय का पता लगाने।
    2. हाउस निकास प्रशंसकों के साथ outfitted ध्वनि attenuating मंत्रिमंडल में कक्षों (22 "डब्ल्यू एक्स 22" एच x 16 "डी) (~ 68 DB)।
    3. डेटा स्फूर्त कक्ष को नियंत्रित करने और प्राप्त करने के लिए मेड एसोसिएट्स सॉफ्टवेयर के साथ एक पीसी कंप्यूटर का उपयोग करें। कंडीशनिंग सत्र के दौरान, presenta के दौरान खाद्य कप में सिर के साथ बिताए कुल समय पर डेटा इकट्ठाप्रकाश प्रोत्साहन (5 सेकंड युग) की tion और खाद्य इनाम (5 सेकंड युग) की प्रस्तुति के दौरान। परीक्षण सत्र के दौरान, (श्रवण उत्तेजनाओं समाप्त कर रहे हैं जब 10 सेकंड युग शुरुआत) श्रवण उत्तेजनाओं की प्रस्तुतियों के जवाब में खाद्य कप में खर्च की गई कुल समय पर डेटा इकट्ठा।

संवेदी शर्त प्रतिमान के 4. अवलोकन

  1. सर्जरी से वसूली के बाद धीरे-धीरे खाना उनके मुक्त खिला शरीर के वजन के 85% करने के लिए चूहों को प्रतिबंधित। एक उपयुक्त खाद्य प्रतिबंध प्रतिमान के लिए पशु चिकित्सा स्टाफ से परामर्श करें।
    नोट: 3 चरण संवेदी शर्त प्रतिमान चित्रा 2 में सचित्र है।
  2. शर्त सत्र (चरण 1; रोज़ 64 मिनट प्रशिक्षण सत्र 4 लगातार दिन भर में आयोजित):
    1. श्रवण और दृश्य उत्तेजनाओं के वितरण से मिलकर बनता है कि 12 intermixed परीक्षणों के साथ मौजूद चूहों। अंतर परीक्षण अंतराल में शामिल प्रत्येक एक के बाद औसत 4.5 मिनट (रेंज 4.0 मिनट 5.0) किuditory प्रस्तुति।
    2. 10 सेकंड के लिए परीक्षण, वर्तमान एक स्वर (preconditioned उत्तेजना) के 6 पर, चमकती रोशनी प्रोत्साहन के 5 सेकंड प्रस्तुति से तुरंत पीछा किया।
    3. अन्य 6 परीक्षणों पर, 10 सेकंड के लिए अकेले सफेद शोर (अयुगल प्रोत्साहन) प्रस्तुत करते हैं।
  3. कंडीशनिंग सत्र (चरण 2; लगातार 5 दिनों आयोजित भर रोज़ 64 मिनट प्रशिक्षण सत्र):
    1. 5 सेकंड के लिए दृश्य उत्तेजना (चमकती रोशनी उत्तेजना) की डिलीवरी से मिलकर बनता है कि 8 परीक्षणों के साथ मौजूद चूहों दो 45 मिलीग्राम खाना छर्रों के वितरण के द्वारा तुरंत पीछा किया। अंतर परीक्षण अंतराल में शामिल है कि प्रत्येक परीक्षण के बाद औसत 7 मिनट (सीमा 6.0 मिनट 8.0 करने के लिए)। कभी-कभी चूहों हल्का खाना एसोसिएशन जानने के लिए अधिक से अधिक 5 कंडीशनिंग सत्र की आवश्यकता होती है।
  4. परीक्षण सत्र (चरण 3; एक एकल 78 मिनट सत्र):
    1. अकेले श्रवण उत्तेजनाओं की डिलीवरी से मिलकर बनता है कि 12 intermixed परीक्षण के साथ चूहों वर्तमान। एवेन्यू कि अंतर परीक्षण अंतराल में शामिलक्रोध 4.5 मिनट (रेंज 4.0 मिनट 5.0) प्रत्येक श्रवण प्रस्तुति के बाद।
    2. परीक्षण के 6, 10 सेकंड के लिए अकेले स्वर प्रोत्साहन (preconditioned प्रोत्साहन) प्रस्तुत करते हैं।
    3. अन्य 6 परीक्षणों पर, 10 सेकंड के लिए अकेले सफेद शोर (अयुगल प्रोत्साहन) प्रस्तुत करते हैं।
  5. Preconditioned प्रोत्साहन के रूप में सफेद शोर और अयुगल प्रोत्साहन के रूप में स्वर प्राप्त करने वाले चूहों की एक दूसरे सेट के साथ अध्ययन पूरा करके उत्तेजनाओं counterbalance।

5. औषधीय और व्यवहार प्रक्रिया

  1. व्यवहार तंत्र को सत्ता पर बारी और उचित व्यवहार सत्र के लिए मेड-पीसी कोड को लोड। वायर और कार्यक्रम के व्यवहार तंत्र ध्वनि attenuating अलमारियाँ पर बढ़ रहे हैं कि प्रशंसकों सत्ता पर बंद है पर जब बारी है कि इस तरह के।
  2. Clozapine एन-ऑक्साइड (CNO) के एक 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में CNO की 5.0 मिलीग्राम वजन और बाँझ 0.9% साली के 5 बाँझ पानी की मिलीलीटर या 5 मिलीलीटर जोड़ेंNE। समाधान जब तक भंवर स्पष्ट है।
    1. CNO समाधान में भंग नहीं करता है या CNO का अधिक ध्यान केंद्रित समाधान ऐसे DMSO के रूप में 23, एक solubilizing एजेंट जोड़ने वांछित हैं। विशेष रूप से, 0.5% DMSO के साथ CNO के 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार CNO की 5.0 मिलीग्राम वजन और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब DMSO के 25 μl जोड़ने के लिए। झाड़ धीरे सामग्री को ट्यूब के आधार पर बने हुए हैं कि यह सुनिश्चित करने। समाधान स्पष्ट हो जाता है, बाँझ पानी के 5 मिलीलीटर या बाँझ 0.9% खारा के 5 मिलीलीटर जोड़ें। CNO का समाधान तैयार करने के लिए आगे के निर्देश DREADD विकी संसाधन पृष्ठ 25 पर उपलब्ध हैं।
    2. यह प्रशासित किया जाता है कि प्रत्येक दिन एक नया CNO समाधान तैयार है।
  3. 1 मिलीग्राम की एक खुराक पर intraperitoneally CNO इंजेक्षन / लगभग 30 मिनट पूर्व व्यवहार परीक्षण किलो। उदाहरण के लिए, 1 मिलीग्राम / एमएल CNO समाधान के 0.2 मिलीलीटर के साथ एक 200 ग्राम चूहा इंजेक्षन। CNO प्रशासन की खुराक और समय के पाठ्यक्रम पहले से प्रकाशित रिपोर्ट 2,12 के आधार पर चयन किया गया था।
    1. (चरण 1; इंजेक्शन की 4 दिनों की कुल) प्रत्येक शर्त सत्र के लिए पहले CNO 30 मिनट इंजेक्षन लेकिन बाद के सभी व्यवहार सत्र के लिए पहले वाहन प्रशासन।
  4. 30 मिनट के बाद, व्यवहार परीक्षण कक्षों में चूहों जगह है और उचित व्यवहार सत्र के लिए कंप्यूटर कोड आरंभ करें।
  5. व्यवहार कार्य के पूरा होने पर तुरंत कक्षों से चूहों को हटाने और जानवरों की कॉलोनी के लिए चूहों वापसी।

व्यवहार आंकड़ों के 6. विश्लेषण

नोट: सभी व्यवहार सत्र के लिए निर्भर चर भोजन कप में अवरक्त photocells की रुकावट से पता चला के रूप में चूहे का सिर खाद्य कप के अंदर है कि समय की राशि है। (एसईसी में) डेटा एकत्र की है और कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के द्वारा दर्ज की गई हैं।

  1. आचरण नहीं करते शर्त चरण के दौरान उत्पन्न डेटा पर विश्लेषण करती है।
  2. कंडीशनिंग सत्र के लिए: प्रत्येक चूहों 'एक विश्लेषणसाख 5 व्यवहार सत्र के पार दृश्य उत्तेजना की प्रस्तुति के दौरान खाद्य कप व्यवहार की तुलना द्वारा हल्का खाना एसोसिएशन जानने के लिए। विशेष रूप से, / सत्र 8 परीक्षणों में से प्रत्येक के लिए 5 सेकंड प्रकाश युग के दौरान खाद्य कप में खर्च की औसत समय की गणना (यानी, अवधि / चूहे में प्रत्येक 5 सेकंड रहे हैं कि 8 परीक्षणों की एक औसत)। औसत नियंत्रण और 5 दैनिक सत्र से प्रत्येक के लिए प्रयोगात्मक मूल्यों (चित्रा 3A देखें) की तुलना करें।
    1. ऊपर 5 सेकंड प्रकाश युग के लिए निर्दिष्ट के रूप में ही गणना का उपयोग 5 व्यवहार सत्र के पार भोजन इनाम (5 सेकंड युग) की डिलीवरी के दौरान खाद्य कप व्यवहार की तुलना द्वारा भोजन इनाम प्राप्त करने के लिए चूहों 'प्रेरणा का विश्लेषण करें। ये मान दृश्य उत्तेजना की प्रस्तुति के दौरान अर्जित उन लोगों की तुलना में लगातार अधिक हो जाएगा (3B चित्रा देखें)।
  3. परीक्षण सत्र के लिए: दबाव के जवाब में 'चूहों भोजन कप व्यवहार का वर्णन करता है कि एक भेदभाव अनुपात की गणनाप्रत्येक श्रवण उत्तेजना के entations।
    1. विशेष रूप से, प्रत्येक चूहे के लिए, के 6 प्रस्तुतियों में से प्रत्येक निम्नलिखित खाद्य कप में खर्च की औसत समय का योग द्वारा संवेदी preconditioned प्रोत्साहन के 6 प्रस्तुतियों (यानी, टोन) में से प्रत्येक निम्नलिखित खाद्य कप में खर्च की औसत समय का विभाजन संवेदी preconditioned प्रोत्साहन (यानी, स्वर प्रोत्साहन) प्लस अयुगल प्रोत्साहन (यानी, सफेद शोर उत्तेजना) के 6 प्रस्तुतियों में से प्रत्येक निम्नलिखित खाद्य कप में खर्च की गई कुल समय का औसत। प्रत्येक युग की अवधि में 10 सेकंड है।
      नोट: 0.5 या अधिक की एक भेदभाव स्कोर चूहों संवेदी शर्त प्रतिमान में निहित संघों सीखा कि यह दर्शाता है।

एएवी प्लेसमेंट और अभिव्यक्ति की 7. सत्यापन

  1. Anesthetize और transcardially 4% paraformaldehyde का उपयोग कर चूहों छिड़कना। कारण फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करने के लिए, न्यूनतम करने के लिए 2 घंटे की एक के बाद निर्धारण समय से अधिक नहीं हैimize नुकसान प्रतिजनकता की और फ्लोरोसेंट संकेत संरक्षित करने के लिए।
  2. 2 दिनों की एक न्यूनतम के लिए या मस्तिष्क मस्तिष्क जार की तह तक डूब तक फॉस्फेट बफर खारा (1x) में 20% sucrose के समाधान के 30 मिलीग्राम से युक्त एक मस्तिष्क जार में उन्हें स्थानांतरित कर perfused दिमाग निर्जलीकरण।
  3. ब्याज के क्षेत्र के पूरे rostrocaudal हद तक भर राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों (20-40 माइक्रोन) बनाने के लिए एक ठंड रपट सूक्ष्म प्रयोग करें।
  4. डिजाइनर रिसेप्टर और / या रिपोर्टर 12 के स्थान और अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए टैग रिसेप्टर या रिपोर्टर प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित immunohistochemistry के आचरण। एक immunohistochemistry धुंधला प्रोटोकॉल DREADD विकी संसाधन पृष्ठ 25 पर प्रदान की जाती है।
  5. एक जलीय बढ़ते मध्यम के 100-200 μl का उपयोग कर Superfrost से अधिक स्लाइड और coverslip पर वर्गों माउंट।
  6. एएवी प्लेसमेंट और प्रोटीन अभिव्यक्ति 12,24 सत्यापित करने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन।

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Representative Results

व्यवहार परिणाम

प्रयोग के पूरा होने पर, क्षेत्र विशेष अस्थायी निष्क्रियता की प्रभावशीलता मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन किया जाना चाहिए। वर्तमान उदाहरण CNO आरएससी तटस्थ उत्तेजनाओं 12 के बीच संघों के गठन के लिए आवश्यक है कि परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए शर्त सत्र के दौरान आरएससी में तंत्रिका गतिविधि attenuate को दिलाई गई थी, जिसमें एक 3-चरण व्यवहार प्रतिमान (संवेदी शर्त), शामिल है। महत्वपूर्ण बात है, प्रयोगकर्ताओं व्यवहार प्रतिमान या फार्माकोजेनेटिक दृष्टिकोण सबसे अधिक व्यवहार मानदंड के साथ मिलकर किया जा सकता के रूप में यहाँ बताया प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए सीमित नहीं हैं।

विश्लेषण आम तौर पर शर्त सत्र (1 चरण) के दौरान उत्पन्न डेटा पर प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं जबकि, यह चूहों कंडीशनिंग सत्र (2 चरण) के दौरान हल्का खाना एसोसिएशन सीखा है कि क्या यों के लिए महत्वपूर्ण है। फाई में दिखाया गया हैgure 3 ए, दोनों प्रयोगात्मक (expt) और नियंत्रण (Ctrl) चूहों चूहों दृश्य उत्तेजना (प्रकाश) और खाद्य इनाम के बीच एक Pavlovian एसोसिएशन का अधिग्रहण का संकेत है कि प्रकाश प्रोत्साहन (चित्रा 3) की प्रस्तुतियों के दौरान खाद्य कप व्यवहार में वृद्धि प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, दोनों समूहों इनाम प्राप्त करने के लिए बराबर प्रेरणा का संकेत भोजन इनाम (3B चित्रा) की प्रस्तुति के दौरान खाद्य कप व्यवहार में वृद्धि प्रदर्शित करता है। श्रवण उत्तेजनाओं अन्य उत्तेजनाओं के अभाव में प्रस्तुत कर रहे हैं जब महत्वपूर्ण परीक्षण सत्र के दौरान, नियंत्रण चूहों प्रयोगात्मक चूहों (चित्रा -3 सी) से काफी अलग है कि एक भेदभाव स्कोर है। ग्राफ के दृश्य निरीक्षण नियंत्रण चूहों की औसत भेदभाव अनुपात उनके भोजन कप की तुलना में (शर्त) के दौरान प्रकाश के साथ रखा गया था कि श्रवण उत्तेजना की प्रस्तुतियों के जवाब में, अधिक से अधिक भोजन कप व्यवहार का सूचक अधिक से अधिक से अधिक 0.5 है कि पता चलता है(शर्त के दौरान) अयुगल गया था कि श्रवण उत्तेजना की प्रस्तुतियों के जवाब में व्यवहार। इसके विपरीत, प्रयोगात्मक चूहों मौका ऊपर है कि एक फर्क स्कोर प्रदर्शित करने के लिए असफल। इस प्रकार, चित्रा -3 सी नियंत्रण नहीं बल्कि प्रयोगात्मक चूहों संवेदी शर्त प्रभाव से पता चला कि यह दर्शाता है।

एएवी प्लेसमेंट का सत्यापन

व्यवहार परीक्षण के पूरा होने पर, सही स्थान और डिजाइनर रिसेप्टर की अभिव्यक्ति के लिए चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों का विश्लेषण। आचार immunohistochemistry के एक रिसेप्टर टैग (जैसे, एक विरोधी हा प्राथमिक एंटीबॉडी) या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के खिलाफ निर्देशित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग 12,25 (इस उदाहरण में, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए एक एंटीबॉडी ने पता लगाया है जो mcitrine)। चूहे के मस्तिष्क के माध्यम से एक राज्याभिषेक अनुभाग का एक योजनाबद्ध चित्रा -4 ए में दिखाया गया है। 4B चित्रा संवाददाता prot की मजबूत फ्लोरोसेंट immunodetection दिखाता है। के आसपास के क्षेत्रों में पाया कोई फ्लोरोसेंट लेबल के साथ एक प्रतिनिधि प्रयोगात्मक चूहे में आरएससी में Ein आंकड़े 4C - डी प्रयोगात्मक (expt में संवाददाता प्रोटीन के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट लेबलिंग उदाहरण देकर स्पष्ट करना; चूहों डिजाइनर रिसेप्टर जीन से युक्त एक एएवी निर्माण और mcitrine जीन के साथ संचार कर रहे थे ) और नियंत्रण (Ctrl; चूहों क्रमशः GFP के जीन लेकिन डिजाइनर रिसेप्टर के लिए कोई अनुक्रम) चूहों, जिसमें एक समान एएवी निर्माण के साथ संचार कर रहे थे। रिसेप्टर के स्तर को भी कम से कम, प्रतिनिधि और अधिक से अधिक अभिव्यक्ति 24 के रूप में प्रदर्शित किया जा सकता है। लेबलिंग हित के क्षेत्र के बाहर के क्षेत्रों में पाया जाता है, व्यवहार विश्लेषण से उन आंकड़ों को छोड़ दें।

चित्र 1
चित्रा 1:। एएवी निर्माण के योजनाबद्ध आरेख hSyn-हा-hM4D (जीआई) का एक चित्र एएवी विस्तार के लिए इस्तेमाल किया-mCitrine -IRESress आरएससी न्यूरॉन्स में एक neuronal विशिष्ट synapsin प्रमोटर (hSyn) के तहत निरोधात्मक डिजाइनर रिसेप्टर (hM4Di)। Immunofluorescent संवाददाताओं (हा-टैग और / या mcitrine) क्रमशः, प्रोटीन और रिपोर्टर की अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। hSyn, मानव synapsin प्रमोटर; न्यूरॉन्स में अभिव्यक्ति निर्दिष्ट करता है। हा, hemagluttinin टैग; इस टैग डिजाइनर रिसेप्टर के लिए जुड़े हुए हैं और रिसेप्टर अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए सक्षम करने के लिए एक मिलान टैग के रूप में कार्य करता है। hM4Di, डिजाइनर निरोधात्मक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर के लिए जीन। IRES, आंतरिक राइबोसोम प्रविष्टि साइट; रिपोर्टर (mcitrine) अनुवाद करने की अनुमति देता है। mcitrine, GFP के एक संस्करण है लेकिन photobleaching के लिए प्रतिरोधी है कि एक फ्लोरोसेंट संवाददाता।

चित्र 2
चित्रा 2: संवेदी शर्त प्रतिमान के योजनाबद्ध आरेख (ए) शर्त सेक्स के दौरान।आयनों, 12 intermixed परीक्षणों प्रस्तुत कर रहे हैं। 10 सेकंड के एक चमकती घर प्रकाश प्रोत्साहन (5 सेकंड के लिए 2 हर्ट्ज) द्वारा तुरंत पालन के लिए परीक्षण के 6 के दौरान, एक श्रवण उत्तेजना प्रस्तुत किया है। अन्य 6 परीक्षणों के दौरान, एक दूसरे श्रवण उत्तेजना एक दृश्य उत्तेजना के बिना प्रस्तुत किया है। कंडीशनिंग सत्र के दौरान (बी), पहले से बनती दृश्य उत्तेजना भोजन इनाम के साथ जोड़ा जाता है। परीक्षण सत्र के दौरान (सी), दृश्य उत्तेजनाओं या भोजन के अभाव में दो श्रवण उत्तेजनाओं के 12 intermixed प्रस्तुतियों कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। (ए) के दौरान प्रतिसाद व्यवहार परिणामों औसत खाद्य कप लाइट और (बी) खाद्य युगों डुकंडीशनिंग सत्र (2 चरण) अंगूठी। डाटा दोहराया उपायों विचरण के विश्लेषण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। टेस्ट सत्र (3 चरण) के दौरान (सी) भेदभाव अनुपात। बिंदीदार रेखा प्रत्येक श्रवण उत्तेजना का जवाब देने के वातानुकूलित भोजन कप के बराबर मात्रा में (यानी, कोई संवेदी शर्त) डाटा स्वतंत्र नमूने टी परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया इंगित करता है। Expt; प्रयोगात्मक चूहों (एन = 17) निरोधात्मक जी प्रोटीन युग्मित डिजाइनर रिसेप्टर (hM4Di) और एक फ्लोरोसेंट संवाददाता (mcitrine) के लिए डीएनए अनुक्रम के लिए डीएनए अनुक्रम युक्त एएवी निर्माण के साथ संचार। Ctrl; नियंत्रण चूहों (एन = 6) hM4Di के साथ संचार और प्रशासित वाहन नियंत्रण चूहों के साथ संयुक्त (एन = 4) डिजाइनर रिसेप्टर को शामिल नहीं करता है कि एक एएवी वायरस के साथ संचार और कहा कि CNO दिलाई गई। नियंत्रण समूहों में काफी एक दूसरे को (P> 0.05) से अलग नहीं किया था। त्रुटि सलाखों ± SEM के निरूपित करते हैं।

चित्रा 4 चित्रा 4: प्रोटीन अभिव्यक्ति के histological सत्यापन (ए) चूहे के मस्तिष्क के माध्यम से एक राज्याभिषेक अनुभाग में आरएससी के स्थान को दर्शाता हुआ एक योजनाबद्ध।। (बी) निरोधात्मक जी प्रोटीन युग्मित डिजाइनर रिसेप्टर के लिए डीएनए अनुक्रम (hM4Di) और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए डीएनए अनुक्रम (युक्त एएवी निर्माण के साथ संचार किया गया था कि एक प्रयोगात्मक चूहे (expt) से immunohistochemically लेबल वाले चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों के प्रतिनिधि छवियाँ mcitrine)। mcitrine हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक बेहद फीका प्रतिरोधी संस्करण है। (सी) फ्लोरोसेंट संवाददाता लेबल (mcitrine) के स्थान को दर्शाता हुआ एक प्रयोगात्मक चूहे से प्रतिनिधि छवि। (डी) एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए डीएनए अनुक्रम युक्त एएवी निर्माण के साथ संचार के लिए एक नियंत्रण चूहा (Ctrl) से प्रतिनिधि छवि (GFP बढ़ाया)। स्केल सलाखों: बी, 500 माइक्रोन; सी और डी, 10081, एम। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र एक बहु चरण जटिल शिक्षण कार्य के लिए योगदान कैसे की जांच के लिए एक फार्माकोजेनेटिक दृष्टिकोण (DREADD) लागू करने के लिए कैसे करें। अस्थायी रूप से और दूर शिक्षा के चरणों में असतत मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका गतिविधि चुप्पी करने की क्षमता के साथ, दृष्टिकोण के इस संयोजन को सीखने के अधिक सूक्ष्म या नकाबपोश रूपों सहित व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला, जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित उदाहरण में, retrosplenial कॉर्टेक्स (आरएससी) में डिजाइनर रिसेप्टर व्यक्त कि चूहों और चूहों एक 3-चरण व्यवहार कार्य 12 में परीक्षण किया गया नियंत्रित करते हैं। कार्य के पहले चरण में उत्तेजनाओं दोनों के बीच एक प्रेरणा-प्रोत्साहन एसोसिएशन अधिग्रहण करेगा चूहों पर नियंत्रण है कि इस धारणा के साथ कई तटस्थ उत्तेजनाओं की प्रस्तुति शामिल किया गया। काम कर परिकल्पना आरएससी 30 मिनट पूर्व व्यवहार परीक्षण के शुरू करने के लिए 4 कंडीशनिंग दिनों में से प्रत्येक पर, इस प्रकार, प्रोत्साहन प्रोत्साहन सीखने के लिए आवश्यक है कि हैआईएनजी, नियंत्रण और प्रयोगात्मक चूहों डिजाइनर दवा (CNO) या वाहन या तो के प्रणालीगत प्रशासन दिए गए थे। डिजाइनर रिसेप्टर के लिए बाध्य करते हैं, CNO कि रिसेप्टर व्यक्त की है जिसमें न्यूरॉन्स की गतिविधियों को कम कर देता। आरएससी सीखने को प्रभावित करने की धारणा नहीं है जब व्यवहार कंडीशनिंग और परीक्षण के शेष चरणों के दौरान, CNO प्रशासित नहीं किया गया है और इस तरह तंत्रिका गतिविधि परेशान नहीं किया गया था।

प्रोटोकॉल के भीतर गंभीर कदम

एएवी यौगिकों के सुरक्षित हैंडलिंग: फार्माकोजेनेटिक दृष्टिकोण में शामिल सर्जिकल प्रक्रियाओं के लिए कोई और अधिक तकनीकी रूप से मांग एक साधारण stereotaxic निषेचन की तुलना में कर रहे हैं, हालांकि, कुछ संस्थानों में एएवी के प्रयोग के प्रयोगकर्ताओं बीएसएल 2 सावधानियों का पालन करने की आवश्यकता है। यह जांचकर्ताओं रोग नियंत्रण के लिए केंद्र, आर्थिक सहायता एजेंसियों, घर संस्थाओं और उनके अनुसंधान कार्यक्रम के लिए विशिष्ट अन्य निरीक्षण समितियों द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों का पालन कि महत्वपूर्ण है। वें पर सूचनाAAVs की ई सुरक्षित हैंडलिंग 13 आसानी से उपलब्ध है।

डिजाइनर दवा की तैयारी और प्रशासन: CNO, डिजाइनर दवा, डिजाइनर रिसेप्टर को बांधता है और तंत्रिका गतिविधि चुप्पी लेकिन अन्यथा जैविक रूप से 1,3 निष्क्रिय है। आपूर्तिकर्ताओं से CNO का लदान संगति में अलग-अलग हो सकते हैं। यौगिक कंटेनर के पक्ष का पालन नहीं कर रहा है कि एक पाउडर के रूप में आ जाना चाहिए।

, पूर्व व्यवहार परीक्षण करने के लिए, डिजाइनर दवा की गैर विशिष्ट प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए प्रयोगात्मक चूहों का एक अलग सेट को बढ़ावा (यानी, डिजाइनर रिसेप्टर व्यक्त कि उन) के बजाय CNO के वाहन इंजेक्शन के साथ: महत्वपूर्ण नियंत्रण समूहों पर विचार करने के लिए। इसके अलावा, डिजाइनर रिसेप्टर की गैर विशिष्ट प्रभाव के लिए एक फ्लोरोसेंट संवाददाता, लेकिन नहीं संशोधित डिजाइनर रिसेप्टर में शामिल है कि एक नियंत्रण वायरस के साथ संचार कर रहे हैं कि चूहों के एक समूह में शामिल नियंत्रित करने के लिए और डिजाइनर दवा के साथ इन चूहों इंजेक्षन (यानी, CNO) । Ensuसमूहों में counterbalancing द्वारा पर्याप्त प्रयोगात्मक डिजाइन कर रहे हैं।

निर्माण की अभिव्यक्ति का सत्यापन करना: डिजाइनर रिसेप्टर की अभिव्यक्ति और पहचान को अधिकतम करने के तरीके के एक नंबर रहे हैं। अर्क से पहले, वायरल अनुमापांक 10 से 12 कणों / मिलीलीटर के पास है, यह सत्यापित। अक्सर फ्लोरोसेंट संवाददाता के दृश्य कम है और इस प्रकार, यह immunohistochemistry के रिपोर्टर (एस) के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग हित के क्षेत्र पर प्रदर्शन किया जा सिफारिश की है कि वायरल का निर्माण 25 में शामिल है। इस उदाहरण में, विरोधी GFP immunoreactivity के एक मजबूत संकेत देता है (आंकड़े 4 बी - डी)। महत्वपूर्ण बात है, क्योंकि फ्लोरोसेंट लेबल की प्रकृति के कारण, 2 घंटा करने के निर्धारण के समय की लंबाई की सीमा।

तकनीकों का लाभ

वायरल का निर्माण stereotaxic सर्जरी के माध्यम से मस्तिष्क के लिए दिया गया है, फार्माकोजेनेटिक दृष्टिकोण अस्थायी inacti के लिए अनुमति देता हैडिजाइनर दवा की एक न्यूनतम इनवेसिव प्रणालीगत इंजेक्शन के माध्यम से असतत क्षेत्रों में मस्तिष्क की गतिविधियों का छुपा। औषध प्रशासन लगातार कई दिनों या हफ्तों 12,24,26 भर में पाए जाते हैं कि व्यवहार कार्यों के लिए फायदेमंद है, जो बार-बार हो सकता है। इसके अलावा, सबूत डिजाइनर दवा (CNO) हरकत व्यवहार या भूख 27,28 के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि इंगित करता है। इस प्रकार, विधि अस्थायी निष्क्रियता के अन्य तरीकों में निहित तनाव से परहेज करते हुए, समय (2-5 घंटा) की एक छोटी अवधि के लिए तंत्रिका गतिविधि attenuate करने का अवसर प्रदान करता है। विशेष रूप से, केन्युलेशन अध्ययन में, अस्थायी निष्क्रियता स्थायी रूप से खोपड़ी से चिपका रहे हैं कि cannulae के माध्यम से न्यूरोटोक्सिन के वितरण के द्वारा हासिल की है। इस दृष्टिकोण के मलबे के स्पष्ट और संरक्षित प्रवेशनी रखते हुए चुनौती दे रहा है कि में सीमित है। इसके अलावा, निष्क्रियता प्रेरित करने के लिए है, पशुओं के व्यवहार का परीक्षण करने के लिए बस से पहले (cannulae के माध्यम से विष प्रशासन के लिए) बड़े पैमाने पर नियंत्रित किया जाता है, whiचर्चा जानवर पर तनाव लगाता है और यह भी cannulae खोपड़ी से बेदखल हो सकता है कि संभावना बढ़ जाती है। CNO का प्रभाव अपेक्षाकृत कम अवधि के होते हैं, क्योंकि (जैसे स्थायी घावों निम्नलिखित मनाया उन लोगों के रूप में या अनुवांशिक इंजीनियर चूहों में) दीर्घकालिक प्रतिपूरक तंत्र की संभावना 29,30 कम कर रहे हैं।

तकनीकों की सीमाएं

DREADD गैर invasively neuronal गतिविधि attenuating की एक अपेक्षाकृत नया तरीका है। इस तरह के प्रयोगकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से सत्यापित करने के लिए इच्छुक हो सकता है जैसा कि न्यूरोनल मुंह बंद उनकी तैयारी में होता है। सत्यापन electrophysiological दृष्टिकोण का उपयोग किया है, लेकिन इन प्रयोगों महंगा, समय लेने वाली होती हैं और विशिष्ट विशेषज्ञता की आवश्यकता होती जा सकता है। Chemogenetic तकनीक optogenetics की तुलना में कम महंगे हैं, जबकि इसके अलावा, दृष्टिकोण ऐसे TTX के रूप में औषधीय एजेंटों के साथ परंपरागत निष्क्रियता से ज्यादा महंगा है। DREADD दृष्टिकोण की एक और सीमा कि infus हैवायरल निर्माणों के आयन हित के क्षेत्र में न्यूरॉन्स की 100% संक्रमण में परिणाम है, और न ही neuronal गतिविधि के लिए 100% की कमी करने के लिए CNO नेतृत्व के माध्यम से निष्क्रियता नहीं करता। अंत में, कुछ एएवी सीरमप्रकारों प्रतिगमनपूर्वक प्रयोगात्मक परिणामों 2 की व्याख्या जटिल हो सकता है जो जाया जा सकता है।

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Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल आंशिक रूप से ली गई है जिसमें से पांडुलिपि के लिए उनके योगदान के लिए रॉबिन्सन एट अल। 12 के लेखकों को धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Male, Long Evans Rats, 55-60 days old Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
rAAV8/hSyn-GFP Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
Clozapine-N-oxide R&D Systems 4936-10 Designer drug
Rat Cage lid (polycarbonate) Alternative Design  FT 8XL-PC Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion
Filter paper (replacement) Alternative Design FP-R-1018XAD Filter paper that goes with cage lids
Table top vise JETS 2201-265 For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood
Biohazard trash bags Staples 113444 Medline biohazard liners
Biohazard trash can Amazon.com United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle
Isoflurane, 100 ml Patterson Veterinary Supply Inc. 07-890-8540 Anesthetic
Dual small animal stereotaxic with digital display readout console David Kopf Model 942 Surgical equipment
Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) David Kopf Model 955 Surgical equipment
Anesthesia mask (rat) David Kopf Model 906 Surgical equipment
High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder David Kopf Model 1474 Surgical equipment
Microdrill burrs, 0.9 mm Fine Science Tools Inc 19007-09 Surgical supply
Automated syringe pump with micro4 controller David Kopf Model UMP3-1 Surgical equipment
Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit Ahdis 21420 Surgical supply
Betadine skin cleanser Perdue Products L.P 67618-149-04 Surgical supply
Triple antiobiotic ointment Medline Supply 53329-087-01 Surgical supply
Puralube vet ointment Only Veterinary Supply 17033-211-38 Surgical supply
Dino-lite Microscope AD7013MTL An alternative to the traditional disection scope
Dino-lite rigid table-top boom stand Microscope MS36B Surgical equipment
28 G 10 μl syringe Hamilton 80308-701SN Surgical equipment
Extra tall MDF sound attenuating cubicle Med Associates, Inc ENV-018MD 22' W x 22" H x 16" D
Extra tall modular test chamber Med Associates, Inc ENV-007 Behavioral equipment
Stainless steel grid floor Med Associates, Inc ENV-005 Behavioral equipment
House light Med Associates, Inc ENV-215M Used as the house light and stimulus light
Modular pellet dispenser Med Associates, Inc ENV-203M-45 Behavioral equipment
Pellet receptacle, cup type Med Associates, Inc ENV-200R1M Behavioral equipment
Head entry detector for rat Med Associates, Inc ENV-254-CB Behavioral equipment
Dustless precision food pellets, 45 mg Bio-Serv F0165 Behavioral supply
Cage speaker for rat chamber Med Associates, Inc ENV-224AM Behavioral equipment
Programmable audio generator Med Associates, Inc ANL-926 Behavioral equipment
Smart ctrl 8 input/16 output package Med Associates, Inc DIG-716P2 Behavioral equipment
Large table-top cabinet and power supply Med Associates, Inc SG-6510D Behavioral equipment
PCI interface package Med Associates, Inc DIG-700P2-R2 Behavioral equipment
MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor Med Associates, Inc COM-103V Behavioral equipment
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg Electron Microsopy Sciences 19210 Hazard: carcinogen, weigh in hood
Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) Cell Signaling Technologies 3724S Histology reagent
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) Cell Signaling Technologies 2956S Histology reagent
Anti-rabbit IgG Cell Signaling Technologies 4412S Histology supplies
Superfrost plus slides VWR international 483111-703 Histology supplies

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References

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