Ein Verfahren zum Fern Silencing neuronale Aktivität in Nagetiere Während diskreter Phasen des Lernens

Behavior

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Robinson, S., Adelman, J. S. A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning. J. Vis. Exp. (100), e52859, doi:10.3791/52859 (2015).

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Abstract

Dieses Protokoll beschreibt, wie vorübergehend zum Schweigen zu bringen und aus der Ferne die neuronale Aktivität in einzelnen Gehirnregionen, während die Tiere in Lern- und Gedächtnisaufgaben beschäftigt. Der Ansatz kombiniert Pharmakogenetik (Designer-Rezeptoren-Exklusiv-Activated-by-Designer-Drogen) mit einem Verhaltensparadigma (sensorischen Präkonditionierung) dazu bestimmt ist, zwischen verschiedenen Lernformen zu unterscheiden. Insbesondere wird viral-vermittelte Abgabe verwendet werden, um eine genetisch modifizierte inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor (der Designer Receptor) in einer diskreten Region des Gehirns im Nagetier auszudrücken. Drei Wochen später, als Designer-Rezeptor-Expressionsniveaus hoch sind, ein pharmakologisches Mittel (der Designer Drug) wird systemisch 30 Minuten vor einem bestimmten Verhaltens Sitzung verabreicht. Das Arzneimittel besitzt eine Affinität für den Designer-Rezeptor und damit zu einer Hemmung der Neuronen, die den Designer-Rezeptor exprimieren, ist ansonsten biologisch inert. Die Hirnregion bleibt für 2-5 Stunden zum Schweigen (DEPENDing von der Dosis und dem Weg der Verabreichung). Nach Beendigung der Verhaltensparadigma wird Hirngewebe für die korrekte Platzierung und Rezeptor-Expression bewertet. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Bestimmung der Anteile der einzelnen Gehirnregionen bestimmte Komponenten von Verhalten und kann über eine beliebige Anzahl von Verhaltensparadigmen verwendet werden.

Introduction

Eine spannende Herausforderung auf dem Gebiet der Behavioral Neuroscience ist es, die neuronalen Substrate komplexe Verhaltensweisen zu bestimmen. Eine Anzahl von Techniken, wie beispielsweise Dauer Läsionen, temporäre Gehirn Inaktivierung über Kanülenimplantate und Optogenetik verwendet worden sind, um die Beiträge der einzelnen Gehirnregionen zu Subkomponenten komplexe Verhaltensweisen zu identifizieren. Während diese Ansätze informieren unser Verständnis der regionalen Spezifität beim Lernen, ist jede Technik nicht ohne Einschränkungen. Insbesondere werden Läsionen typischerweise permanent durchgeführt vor der Verhaltenstests, wodurch ihre Wirkung während der gesamten Dauer des Paradigmas vorliegen. Kanülierung Studien, die die Vorlage eines kurzfristigen neuronalen Inaktivator (zB Tetrodotoxin) beinhalten können erhebliche Schäden an Hirngewebe zu produzieren und können Stress bei Patienten kurz vor der Verhaltenstests zu induzieren. Weiterhin wird die Inaktivierung durch Kanülierung in die Region des Gewebes, die die Umgebung begrenztSpitze der Kanülen. Schließlich, während Optogenetik bietet eine Reihe von Flexibilität für die zeitliche Steuerung der Aktivität in bestimmten Hirnregionen, ist es kostspielig und technisch anspruchsvoll.

Diese Einschränkungen können mit einer pharmakogenetischen Ansatz (Designer-Rezeptoren-Exklusiv-Activated-by-Designer-Drogen, DREADDs) 1,2 überwunden werden. Wichtig ist, dass, während das Konzept der Pharmakogenetik ist anspruchsvoll, ist die Ausführung der Technik unkompliziert. Ähnlich herkömmlichen stereotaktischen chirurgischen Methoden, die Infusion von Toxin (zB NMDA, Ibotensäure) in diskreten Gehirnbereichen beinhaltet diese Technik das Infundieren eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), die ein DNA-Fragment für ein modifiziertes inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor enthält beinhalten (hM4Di; der Designer-Rezeptor) in dem interessierenden Bereich von Standard-Labornagern (siehe Abbildung 1). Der virale Vektor enthält auch einen fluoreszierenden Reporter (mcitrine). Einmal in eingeauf Zellen, die Designer-Rezeptor (und Reporterprotein) maximal exprimiert ~ 3 Wochen nach der Infusion und selektiv für 2-5 Stunden nach der systemischen Verabreichung des ansonsten biologisch inert Designerdroge, Clozapin-N-oxid aktiviert werden (CNO) 1 , 3. Weil der Experimentator mit präziser, noch remote zeitliche Kontrolle über neuronale Aktivität in bestimmten Hirnregionen ausgestattet, kombiniert Pharmakogenetik besonders gut mit Verhaltensparadigmen, die in mehreren Phasen durchgeführt werden. In diesem Beispiel ist der Beitrag der retrosplenialen Cortex (RSC) auf einen Reiz-Stimulus Lernen wird zu seiner Rolle bei Pavlovian Lernens verglichen jedoch Kombination dieser beiden Ansätze ist gut geeignet, um eine beliebige Anzahl von Fragen, die zu ermitteln, wie bestimmte Hirnregionen tragen zu suchen komplexes Verhalten.

Darüber hinaus, während in dem vorliegenden Protokoll beschrieben, können virale und transgene Ansätze verwendet werden, um Zelltyp-spezifische Expression DREADD 2 zu erzielen. Da ichs eigen Verhaltensparadigmen, die pharmakologischen und / oder andere Arten von experimentellen Manipulationen, sorgfältige Prüfung der Versuchsaufbau und die anschließende quantitative Analyse beteiligt ist erforderlich, wenn unter Verwendung der DREADD Ansatz. Experimentatoren neu in der DREADD Ansatz sind, um eine umfassende Überprüfung der derzeitigen DREADD Technik 2 bezeichnet.

Jeden Tag Organismen lernen Sie neue Impulse und Ereignisse und ihre Beziehungen untereinander. Selbst in einer vertrauten Umgebung, wie zu Hause, ist eine schnell zu Veränderungen in den Beziehungen zwischen Reizen zu erkennen, weil diese Änderungen können prädiktiv für sinnvolle Veranstaltungen. Solche Stimulus-Stimulus (dh relational) beinhaltet die Lernzusammengehen mehrerer Reize und ist traditionell mit dem Hippocampus, die zentral innerhalb des medialen Temporallappens 4 wohnt in Verbindung gebracht. Allerdings ist der Hippocampus nicht vorhanden, noch isoliert handeln; kortikalen Regionen innerhalb und außerhalbSeite der medialen Temporallappen liefern wichtige sensorische Information an den Hippokampus 5-7. Traditionelle Permanent Läsion Studien liefern überzeugende Beweise für die Beteiligung einer Reihe von kortikalen Regionen (zB die retrosplenialen, postrhinal und entorhinalen Kortex) in hippocampalen abhängigen Lern sind jedoch in ihrer Fähigkeit, die Rolle eines bestimmten Bereichs bei diskreten Phasen unterscheiden begrenzt Lernen 8-10.

Das vorliegende Protokoll testet die Hypothese, dass die RSC ist für Stimulus-Stimulus Lernen erforderlich, durch Schweigen den RSC während einer einzelnen Phase einer 3-Phasen-sensorische Präkonditionierung Paradigma 11,12. Kurz gesagt, erhalten Ratten Infusionen eines AAV, die die Designer-Rezeptor umfasst und ca. 3 Wochen später sind die Designer-Droge (CNO) 30 Minuten vor dem Beginn der Verhaltenstests verabreicht. In dem vorliegenden Protokoll zu empfangen Versuchsratten CNO während der ersten Phase der Prüfung (wenn Stimulus-Stimulus learning auftritt), und sie Fahrzeugs während der nächsten 2 Phasen des Tests unterzogen. Um unbeabsichtigte Auswirkungen der CNO auf Verhalten zu steuern, ziehen Ratten mit dem Designer-Rezeptor (hM4Di) und spritzen mit Fahrzeug statt CNO. Um die für die allgemeine Wirkung von viralen Infusion und Rezeptorexpression Konto, ziehen ein Steuer Virus, das nicht enthält den Designer-Rezeptor und verwalten CNO.

Eine Anzahl von verschiedenen Serotypen von AAV verwendet werden, um genetisches Material zu liefern. Die aktuellen NIH Richtlinien für die Forschung an rekombinante oder synthetische Moleküle behält diese AAV (alle Serotypen) und rekombinante oder synthetische AAV-Konstrukte, in denen das Transgen nicht entweder eine potentiell tumorigenen Genprodukt oder ein Toxinmolekül kodieren, und werden in der Abwesenheit eines erzeugten Helfervirus erfordert BSL-1 Vorsichtsmaßnahmen (Anhang B-1. Risikogruppe 1 (RG1) Agents) 13. A Anzahl der Bewertungen im Zusammenhang mit AAV-Struktur, Nutzen und Sicherheit sind 14,15. Bemerkenswert ist, wenn, Aufgrund von Bedenken in Bezug auf mögliche Fortpflanzungs 16,17 und potenziellen karzinogenen Mechanismen 18-20 in Nagetieren, einige Institutionen erfordern die Verwendung von BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen bei der Arbeit mit AAV. Überprüfen Sie die entsprechende BSL vor durch Rücksprache mit Aufsichtsgremien bei einzelnen Institutionen in denen die Forschung, die Centers for Disease Control und den NIH-Richtlinien für die Forschung an rekombinanten DNA-Moleküle 13 bei der Verwendung von viralen Vektoren für die Gen-Manipulation in den Vereinigten Staaten durchgeführt werden, zu nutzen. Personenschutz, Ermittler Ausbildung, Vektor-Containment, Dekontamination, Entsorgung dekontaminiert Materialien und Nacheinspritzung Tierhaltung Anforderungen werden von diesen Leitlinien festgelegt. Darüber hinaus beraten und folgen geeigneten Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Richtlinien oder gleichwertig institutionellen Aufsichtsgremium Richtlinien, um die sichere Handhabung, Verwaltung und Veräußerung von AAV zu gewährleisten.

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Protocol

Die Verwendung von Tieren werden durch das Oberlin College Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Ausschuss und sind in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren 21.

1. Vorbereitung für Viral Infusion

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet BSL-1 Vorsichtsmaßnahmen. Beim Einsatz BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen, eine Einweg-Kittel, Handschuhe, Überschuhe, Augenschutz und soll ein Beatmungsgerät (Typ N95) erforderlich. Alle Individuen Umgang BSL-2-Verbindungen müssen fit für ein Beatmungsgerät getestet von einer lokalen Einrichtung des Gesundheitswesens werden. Siehe Lowery & Majewska (2010) 22 für weitere Informationen zur Handhabung und Lagerung von viralen Vektoren.

  1. Beim ersten Gebrauch aliquoten und speichern nicht verwendete Virus in 20 ul Reaktionsgefäße zu wiederholtem Einfrieren und Auftauen vermeiden.
  2. Bereiten Sie die Arbeitsfläche, indem Sie alle nicht benötigten Objekte und Sterilisieren der Oberfläche mit 70% Ethanol. Bereiten Sie eine 10% Bleichlösung zur Dekontamination von AAV Abfall. Legen Sie einen Becher voll von der Bleichlösung und einer sterilen 10 & mgr; l-Spritze auf die Arbeitsfläche. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit dem AAV in einen Behälter mit Crushed Ice im Aufbau.
  3. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Virus in eine Standard-Schraubstock. Laden Sie eine 10 & mgr; l-Spritze mit mindestens 4 ul AAV. Darauf achten, dass die Spitze der Spritze gegen den Boden der Mikrozentrifugenröhrchen während des Ladens zu biegen. Sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den 4 ul AAV Lösung in der Spritze.
  4. Entsorgen Sie das leere Virusrohr in das Becherglas, das 10% Bleichmittel. Bewahren Sie unbenutzte Teile des Virus, wie vom Hersteller angegeben.
  5. Fügen Sie zusätzliche 10% Bleichmittel auf den Abfallbehälter und lassen Abfälle zu 30 Minuten vor der Entsorgung der dekontaminierten flüssigen Abfall zu sitzen.
  6. Entsorgen Sie die Schutzausrüstung und Kunststoffabfälle in einem Behälter für biologischen wie von den Richtlinien des Instituts beauftragt. Decontaminate jedes Gerät oder Oberflächen, die in Kontakt mit dem Virus mit 10% Bleich kam.

2. Chirurgie

  1. Bereiten Sie den OP-Bereich, indem absorbierenden Papierbank unter der stereotaktischen Apparat und auf einer als dedizierte Virenhandhabungsbereich bezeichnet angrenzenden Raum.
    1. Legen Sie eine 10% Bleichabfallbehälter in den dedizierten Virus Handhabungsbereich in der Nähe der Operationsvorrichtung.
  2. Induzieren einen stetigen Niveau der Anästhesie und bereiten die Ratte für die Chirurgie.
    1. Zeigen die Ratte in einer Induktionskammer, die eine Mischung von Isofluran Gas (im Bereich von 1 bis 3%) und Sauerstoff (100% auf etwa 1 l / min) enthält, bis es zu einem Verlust des Bewusstseins und Fehlens des Brutto gezielte Bewegung. Aufrechtzuerhalten Isoflurananästhesie gesamten chirurgischen Prozedur.
    2. Nach 6 tiefe Narkose erreicht ist, rasieren die Ratte aus zwischen den Augen bis leicht hinter den Ohren.
    3. Legen Sie die Ratte zurück in die Induktionskammer für einweitere 1-3 min.
    4. Sicherzustellen, dass der Isoflurananästhesie System ist mit dem Nasenkonus des stereotaktischen Chirurgie verbunden sind. Öffnen des Hahnes auf das Isofluran Schlauch, um den Fluss von Isofluran zum stereotax beginnen. Aufrechterhaltung der Isofluran und Sauerstoff bei den oben genannten Ebenen.
    5. Legen Sie die Ratte in einem stereotaktischen Apparat durch die Sicherung der Mund auf den Biss Bar und der Sicherung der Ohr-Bars.
    6. Gelten Augensalbe für die Augen und Betadin zum Operationsort vor Einschnitt.
  3. Machen Sie eine 2,4 cm Mittellinienschnitt der Haut auf der dorsalen Oberfläche des Schädels ab ca. 2 mm kaudal auf die Augen. Ziehen Sie die Haut, um den Schädel freizulegen. Von Zeit zu Zeit zu vermitteln steriler 0,9% iger steriler Kochsalzlösung an den Rändern der Operationsstelle zu Geweben vor dem Austrocknen zu verhindern.
  4. Klare membranöse Gewebe vom Schädel bis Bregma und Lambda sind deutlich sichtbar.
  5. Stellen Sie sicher, dass der Schädel ist Ebene durch Messung der dorsal-ventralen Koordinaten anBregma und Lambda. Stellen Sie den stereotaktischen Gerät entsprechend bis dorsal-ventralen Koordinaten Bregma und Lambda um nicht mehr als 0,04 mm.
  6. Zu dieser Zeit reduzieren die Isofluran Gas zwischen 2 und 2,5%.
  7. Bringen Sie den Bohrer zu Bregma, Rezero den Koordinaten und bewegen Sie dann den Bohrer auf die gewünschte medial-lateral und anterior-posterior zu koordinieren.
  8. Bohren Sie ein Loch an der Koordinate mit einem 0,9 mm Bohrer, da sie eine geeignete Größe Loch für eine 28 G Infusionsspritze erzeugt.
  9. Stellen Sie die Infusionspumpe Virus bei einer Rate von 0,2 ml / min zu liefern. Legen Sie die Spritze in die Infusions Arm der stereotaktischen Gerät und senken Sie die Spritze in die gewünschte koordinieren. Geben Sie die gewünschte Menge an Virus (Bereich 0,1 bis 0,8 & mgr; l). Zum Beispiel liefern 0,8 ul von AAV als 4 min.
    Anmerkung: Pilotstudien durchzuführen, um die ideale Infusionsvolumen und die typische Ausbreitung des Virus in jeder Region von Interesse zu bestimmen.
    1. Nach der Lieferung von Virus cosolute Lassen Sie die Spritze in Platz für 10 min zum Rückfluss in den Nadeltrakt zu verhindern. Langsam heben Sie die Spritze mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 mm / min. Wiederholen, bis alle Koordinaten mit AAV infundiert worden.
  10. Schließen Sie die Wunde mit Operationsklammern und Mantel die Wunde mit topischen antibiotischen Salbe.
  11. Folgen Sie den Richtlinien des Instituts für die postoperative Schmerztherapie.
  12. Legen Sie die Ratte in einem Käfig mit Decken und Kissen, einem Deckel und ordnungsgemäße Beschilderung und gibt die Ratte auf die Tierhaltung.
    1. Wenn Arbeiten unter BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen, sammeln Bettwäsche für die Höhe der Zeit (in der Regel 48 bis 72 h) von institutionellen Richtlinien festgelegt. Zeigen Betten in ein biohazard Abfallbehälter.
    2. Entsorgen Sie alle AAV-kontaminierten Materialien wie von Richtlinien für ihre sichere Entsorgung angegeben.

3. Behavioral Vorrichtung

Hinweis: Die sensorischen Präkonditionierung Gerät besteht aus einem Standard-operante Konditionierung Chamber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) mit einem Edelstahl-Gitterboden, 2 Seitenwänden aus Plexiglas und 2 Metallwände.

  1. Montieren Sie eine 2,8 W Licht auf eine der Aluminiumwände, die als Hauslicht dienen und als visueller Reiz, wenn sie bei 2 Hz blinkt. Montieren Sie einen Lautsprecher an der Kammer, um die auditive Reize liefern (10 sec, 1500 Hz, 78 dB und einen reinen Ton dB Rauschen 10 sec 78).
    1. Verwenden Sie eine Futterraufe auf 45 mg Futterpellets in die Nahrungs Tasse zu liefern. In der Lebensmittelbecher, Infrarotlichtschranken erkennen die gesamte Zeit in der Lebensmittel Tasse verbrachte vor, während und nach der Präsentation der Reize und Lebensmittel Belohnungen.
    2. Haus die Kammern in schalldämpfenden Gehäuse (22 "W x 22" H x 16 "D) mit Abluftventilatoren ausgestattet (~ 68 dB).
    3. Verwenden Sie einen PC mit Med Associates-Software, um die operante Kammer zu steuern und erfassen die Daten. Während der Sitzungen Anlage, sammeln Daten über die Gesamtzeit, während presenta mit dem Kopf verbrachte in der Lebensmittel Tassetion der Lichtreiz (5 sec Epoche) und während der Präsentation der Speisen Belohnung (5 sec Epoche). Während der Test-Session, sammeln Daten über die Gesamtzeit, in der Lebensmittel Tasse an Präsentationen der auditive Reize verbrachte in Reaktion (10 sec Epoche Anfang, wenn die akustische Reize werden beendet).

4. Überblick über die Sinnes Präkonditionierung Paradigm

  1. Nach Erholung von der Operation, nach und nach Nahrung zu beschränken, die Ratten zu 85% ihrer freien Fütterung Körpergewicht. Wenden Veterinärpersonal nach einem geeigneten Nahrungsmittelbeschränkung Paradigma.
    Anmerkung: Die 3-Phasen-sensorischen Vorkonditionierung Paradigma ist in Abbildung 2 dargestellt.
  2. Präkonditionierung Sessions (Phase 1; Täglich 64 min Training über 4 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt):
    1. Vorliegenden Ratten mit 12 vermischt Studien, die der Lieferung von auditiven und visuellen Stimuli bestehen. Gehören unter Untersuchungsintervalle, dass durchschnittlich 4,5 min (Bereich 4,0 bis 5,0 min) nach jeder einuditory Präsentation.
    2. Am 6. der Versuche, ein Ton vorhanden (vorkonditioniert Stimulus) für 10 sec, unmittelbar gefolgt von einer 5 s Präsentation der blinkenden Lichtreiz.
    3. An den anderen 6 Studien präsentieren die weiße Rauschen (ungepaarten Stimulus) allein für 10 sec.
  3. Anlage Sitzungen (Phase 2; Täglich 64 min Schulungen über 5 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt):
    1. Vorliegenden Ratten mit 8 Studien, die der Lieferung der visuellen Reiz (die blinkende Lichtreiz) für 5 Sekunden aus, unmittelbar gefolgt von Lieferung von zwei 45 mg Futterpellets. Gehören unter Untersuchungsintervalle, dass durchschnittlich 7 Minuten (Bereich 6,0 bis 8,0 min) nach jedem Versuch. Gelegentlich Ratten benötigen mehr als 5 Anlage Sitzungen, um den Lichtnahrungs Verein zu lernen.
  4. Test Session (Phase 3; eine einzige Sitzung 78 min):
    1. Präsentieren Sie die Ratten, die mit 12 vermischt Studien, die der Lieferung der auditive Reize allein bestehen. Gehören unter Untersuchungsintervalle aveWut 4,5 min (Bereich 4,0 bis 5,0 min) nach jedem Gehör Präsentation.
    2. Am 6. der Versuche stellen den Ton Reiz (Stimulus die vorkonditioniert) allein für 10 sec.
    3. An den anderen 6 Studien präsentieren die weiße Rauschen (das ungepaarte Stimulus) allein für 10 sec.
  5. Gegengewicht zu den Stimuli durch die Vollendung der Studie mit einer zweiten Gruppe von Ratten, die weißes Rauschen als vorkonditioniert Reiz und den Klang wie die ungepaarten Reiz erhalten.

5. Pharmakologische und Verhaltensordnung

  1. Schalten Sie das Gerät an den Verhaltens Gerät und laden Sie die Med-PC-Code für das entsprechende Verhaltens Sitzung. Draht und die Verhaltens-Programm Gerät, so dass die Fans, die auf den Schalldämpfungsschränke montiert sind einzuschalten, wenn der Strom eingeschaltet ist.
  2. Um eine 1 mg / ml-Lösung von Clozapin-N-oxid (CNO) vorzubereiten, wiegen 5,0 mg CNO in einen 15 ml konischen Rohr und 5 ml sterilem Wasser oder 5 ml steriler 0,9% saline. Vortex, bis die Lösung klar ist.
    1. Wenn CNO nicht in Lösung aufzulösen oder wenn konzentriertere Lösungen von CNO gewünscht hinzuzufügen ein Solubilisierungsmittel, wie DMSO 23. Insbesondere, um eine 1 mg / ml-Lösung von CNO mit 0,5% DMSO herzustellen, wiegt 5,0 mg CNO und füge 25 ul DMSO zu einer 15 ml konischen Röhrchen. Flick leicht sichergestellt wird, dass der Inhalt an der Basis der Röhre verbleiben. Wenn die Lösung klar wird, mit 5 ml sterilem Wasser oder 5 ml steriler 0,9% iger Kochsalzlösung. Weitere Anleitungen zur Herstellung von Lösungen von CNO sind auf der DREADD Wiki-Ressourcenseite 25 zur Verfügung.
    2. Bereiten Sie jeden Tag, die es verabreicht wird, eine neue CNO-Lösung.
  3. Spritzen den CNO intraperitoneal in einer Dosis von 1 mg / kg, etwa 30 Minuten vor dem Verhaltenstests. B. spritzen ein 200 g Ratte mit 0,2 ml der 1 mg / ml Lösung CNO. Die Dosis und Zeitverlauf der CNO Verwaltung wurden auf der Grundlage bisher veröffentlichten Berichte 2,12 ausgewählt.
    1. Injizieren CNO 30 Minuten vor jeder Sitzung Präkonditionierung (Phase 1; insgesamt 4 Tagen Injektionen), sondern verwalten das Fahrzeug vor allen nachfolgenden Verhaltens Sitzungen.
  4. Nach 30 Minuten, legen Sie die Ratten in den Verhaltenstests Kammern und starten Sie die Computer-Code für die entsprechende Verhaltens Sitzung.
  5. Nach Abschluss der verhaltens Aufgabe sofort den Ratten aus den Kammern und zurück die Ratten zur Tierkolonie.

6. Analyse der Verhaltensdaten

Hinweis: Die abhängige Variable für alle Verhaltens Sitzungen ist die Zeitdauer, die den Kopf der Ratte ist in der Nahrungsmittelbecher durch Unterbrechung des Infrarot-Lichtschranken in der Lebensmittel Tasse erkannt. Die Daten (in sec) werden gesammelt und von der Computersoftware aufgezeichnet.

  1. Führen Sie keine Analysen auf Daten, die während der Vorkonditionierungsphase erzeugt.
  2. Für die Konditionierung Sitzungen: Analysieren Sie jede Ratten einkeit, die leichte Kost Verein durch den Vergleich Food Tasse Verhalten während der Präsentation der visuellen Reiz über die 5 Verhaltenssitzungen erlernen. Genauer gesagt, die Berechnung der durchschnittlichen Zeit in der Lebensmittel Tasse verbrachte während der 5 sec Licht Epoche für jede 8 Studien / Sitzung (dh durchschnittlich 8 Studien, die jeweils 5 sec Dauer / Ratte sind). Vergleiche zwischen den mittleren Kontroll- und Versuchswerte für jede der 5 täglichen Sitzungen (siehe 3A).
    1. Analysieren Sie die Ratten "Motivation, Futterbelohnung durch Vergleich Food Tasse Verhalten bei Auslieferung des Futterbelohnung (5 sec Epoche) über die 5 Verhaltens Sitzungen mit dem gleichen Berechnung wie für den 5 sec Licht Epoche oben genannten zu erhalten. Diese Werte werden ständig höher als die während der Präsentation der visuellen Stimulus erworben werden (siehe 3B).
  3. Für die Testsitzung: Berechnung eines Unterscheidungsquote, die die Ratten "Food Tasse Verhalten als Reaktion auf pres beschreibttationen jedes auditorischen Reizes.
    1. Insbesondere wird für jede Ratte, unterteilen die durchschnittliche Zeit nach jedem von 6 Darstellungen der sensorischen vorkonditioniert Stimulus (dh der Ton) durch die Summe der durchschnittlichen Zeit, in der Lebensmittelbecher verbracht in der Lebensmittelbecher verbracht folgenden jeweils von 6 Darstellungen der sensorischen vorkonditioniert Stimulus (dh der Ton Anregung) plus dem Durchschnitt der Gesamtzeit in der Lebensmittelbecher verbracht folgenden jeweils von 6 Darstellungen der ungepaarten Stimulus (dh das weiße Rauschen Stimulus). Jede Epoche ist 10 Sekunden in Dauer.
      Hinweis: Eine Diskriminierung Score von 0,5 oder mehr zeigt, dass Ratten gelernt, die Verbände die sich aus der sensorischen Präkonditionierung Paradigma.

7. Überprüfung der AAV Placement und Expression

  1. Betäuben und perfundieren die Ratten transkardial mit 4% Paraformaldehyd. Aufgrund der Verwendung von Fluoreszenzmarkern, keinen post-Fixierungszeit von 2 h nicht überschreiten zu minimize Verlust der Antigenität und um das Fluoreszenzsignal zu erhalten.
  2. Dehydratisieren perfundierten Gehirnen indem sie in einen Gehirn Gefäß mit 30 ml einer 20% Saccharose-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x) für mindestens 2 Tage lang oder bis das Gehirn sinkt auf den Boden des Gehirns Glas.
  3. Verwenden eine Gefrier Schlittenmikrotom koronalen Hirnschnitten (20-40 & mgr; m) über den gesamten Umfang der rostrokaudale dem interessierenden Bereich zu machen.
  4. Zuführen Immunhistochemie gegen den markierten Rezeptor oder dem Reporterprotein gerichtet, um den Ort und die Expression des Designers Rezeptor und / oder Reporter-12 zu ermitteln. Ein Immunhistochemie Färbung Protokoll basiert auf dem DREADD Wiki-Ressourcenseite 25 zur Verfügung gestellt.
  5. Montieren Sie die Schnitte auf Superfrost-plus Folien und Deckglas mit 100-200 & mgr; l einer wässrigen Eindeckmedium.
  6. Führen Fluoreszenzmikroskopie auf Hirngewebe zu AAV Platzierung und Proteinexpression 12,24 überprüfen.

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Representative Results

Behavioral Ergebnisse

Bei Beendigung des Versuchs sollte die Wirksamkeit der regionsspezifischen temporären Inaktivierung quantitativ und qualitativ bewertet werden. Das vorliegende Beispiel beinhaltet eine 3-Phasen-Verhaltensparadigma (sensorischen Präkonditionierung), in dem CNO wurde verabreicht, um die neuronale Aktivität in dem RSC während der Vorkonditionierung Sitzungen zu dämpfen, um die Hypothese, dass die RSC ist notwendig für die Bildung von Assoziationen zwischen neutralen Stimuli 12 zu testen. Wichtig ist, dass Experimentatoren nicht an den Verhaltensparadigma oder hier beschrieben, wie die pharmakogenetischen Ansatz kann mit den meisten Verhaltensparadigmen gekoppelt sein experimentelles Design beschränkt.

Wohingegen Analysen werden in der Regel nicht auf Daten, die während der Vorkonditionierung Sitzungen (Phase 1) erzeugt wird durchgeführt, ist es wichtig, zu quantifizieren, ob Ratten gelernt, das Licht Food Association während der Konditionierung Sitzungen (Phase 2). Wie in Fi gezeigtAbbildung 3A, sowohl experimentell (Expt) und Control (Strg) Ratten demonstrieren Steigerung der Nahrungsmittelbecher Verhalten bei Präsentationen der Lichtreiz (3A), das anzeigt, dass Ratten, erwarb ein Pawlow Assoziation zwischen der visuellen Reiz (Licht) und dem Futterbelohnung. Darüber hinaus beide Gruppen demonstrieren Steigerung der Nahrungsmittelbecher Verhalten während die Präsentation des Essens Belohnung (3B), die Ersatz Motivation, Belohnung zu erhalten. Während der kritischen Testsitzung, wenn die akustische Reize werden in Ermangelung anderer Reize präsentiert, haben Kontrollratten eine Diskriminierung Partitur, die signifikant von Versuchsratten (3C) ist. Sichtkontrolle der Graph zeigt, daß die durchschnittliche Unterscheidungsverhältnis von Kontrollratten größer als 0,5 ist, was auf eine höhere Futternapf Verhalten bei Präsentationen der auditorischen Reizes, die mit dem Licht (während Präkonditionierung) gekoppelt wurde, im Vergleich zu ihren FutternapfVerhalten in Reaktion auf Präsentationen des auditorischen Stimulus, der (bei Präkonditionierung) ungepaarten wurde. Im Gegensatz dazu Versuchsratten versagen, um einen Unterschied Partitur, die oben Chance zu demonstrieren. So 3C zeigt, dass Steuer aber nicht experimentellen Ratten zeigten die sensorische Präkonditionierung Wirkung.

Überprüfung der AAV Placement

Bei der Beendigung der Verhaltenstests, zu analysieren Rattenhirngewebe für die korrekte Anordnung und die Expression des Designers Rezeptors. Verhalten Immunhistochemie 12,25 mit primären Antikörper gegen ein Rezeptor Tag (zum Beispiel ein Anti-HA primärer Antikörper) oder fluoreszierenden Reporter gerichtet (in diesem Beispiel mcitrine welches durch einen Antikörper nach Green Fluorescent Protein (GFP) erfaßt wird). Eine schematische Darstellung einer Frontalschnitt durch das Rattenhirn ist in 4A gezeigt. 4B stellt robuste Immunfluoreszenz des Reporter prot. Ein in der RSC in einer repräsentativen Versuchsratte ohne in umliegenden Regionen erkannt Fluoreszenzmarkierung 4C - D veranschaulichen repräsentative Fluoreszenzmarkierung von Reporter-Proteine ​​in der experimentellen (Expt; Ratten wurden mit einem AAV-Konstrukt, das die Designer-Rezeptor-Gen und das Gen mcitrine infundiert ) und Kontrolle (Ctrl; Ratten wurden mit einer ähnlichen AAV Konstrukt, das die GFP-Gen, aber keine Sequenz für das Designer-Rezeptor) Ratten bzw. infundiert. Rezeptor-Ebenen kann auch als Minimum, Vertreter und maximale Expression 24 angezeigt werden. Bei Etikettierung in Bereichen außerhalb des Bereichs von Interesse erfasst wird, ausgeschlossen sind bestimmte Daten aus den Verhaltensanalysen.

Abbildung 1
Abb. 1: Schematische Darstellung des AAV-Konstrukt Ein Diagramm der HSYN-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrine AAV verwendet zu expDrücken Sie den inhibitorischen Designer-Rezeptor (hM4Di) im Rahmen eines spezifischen neuronalen Synapsin-Promotor (HSYN) in RSC Neuronen. Immunfluoreszenzreporter (HA-Tag und / oder mcitrine) verwendet, um die Expression des Proteins und Reporter jeweils visualisieren werden. HSYN, Menschen Synapsin-Promotor; legt Ausdruck in Neuronen. HA, Hämagglutinin-Tag; dieses Tag, um dem Designer-Rezeptor fusioniert ist und dient als ein Epitop-Tag ermöglicht Detektion von Rezeptor-Expression. hM4Di, dem Gen für den Designer inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor. IRES, interne Ribosomen-Eintrittsstelle; ermöglicht es dem Reporter (mcitrine) übersetzt werden. mcitrine, einem fluoreszierenden Reporter, das eine Variante von GFP ist jedoch widerstandsfähiger gegenüber Photobleichung.

Figur 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der sensorischen Präkonditionierung Paradigma (A) Während der Vorkonditionierung sess.Ionen, 12 vermischt Studien vorgestellt. Während 6 der Versuche wird ein auditorischen Reizes präsentiert 10 Sekunden, unmittelbar gefolgt von einem blinkenden Haus Lichtreiz (2 Hz, für 5 sec). Während der anderen 6 Studien wird eine zweite Hörreiz ohne visuellen Stimulus präsentiert. (B) während der Konditionierung Sitzungen wird das zuvor gepaart visuellen Reiz mit Lebensmitteln Belohnung gepaart. (C) während der Testsitzung gibt es 12 vermischten Präsentationen der beiden auditive Reize in der Abwesenheit von visuellen Reizen oder Essen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abb. 3: Behavioral Ergebnisse Average food cup während der (A) reagiert Licht und (B) Lebensmittel Epochen duRing Der Anlage Sitzungen (Phase 2). Daten wurden unter Verwendung wiederholter Messungen Varianzanalyse analysiert. (C) Discrimination Verhältnisse während der Testsitzung (Phase 3). Die gestrichelte Linie zeigt gleiche Mengen von konditionierten Lebensmittel Tasse Reaktion auf jeden auditorischen Reizes (dh keine sensorischen Präkonditionierung) Die Daten wurden mittels unabhängigen Stichproben t-Test analysiert. Expt; Versuchsratten (n = 17), infundiert mit einem AAV-Konstrukt, das die DNA-Sequenz für das inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Designer (hM4Di) und die DNA-Sequenz für ein fluoreszierendes Reporter (mcitrine). Ctrl; Kontrollratten (n = 6) mit hM4Di infundiert und verwaltet Fahrzeug in Verbindung mit Kontrollratten (n = 4) mit einem AAV-Virus, die nicht den Designer-Rezeptor enthält infundiert und verabreicht wurden CNO. Kontrollgruppen nicht signifikant voneinander (p> 0,05) abweichen. Fehlerbalken bezeichnen ± SEM.

Figur 4 Figur 4: Die histologische Überprüfung der Proteinexpression (A) Eine schematische Darstellung der Lage des RSC in einem Frontalschnitt durch das Rattenhirn.. (B) Repräsentative Bilder der immunhistochemisch markiertem Rattenhirngewebe von einer Versuchsratte (Expt), die mit einem AAV-Konstrukt, das die DNA-Sequenz für das inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Designer (hM4Di) und die DNA-Sequenz für ein fluoreszierendes Reporter (infundiert mcitrine). mcitrine ist ein hochlichtbeständige Variante des grün fluoreszierenden Proteins. (C) repräsentative Bild von einem experimentellen Ratten Veranschaulichung der Lage der fluoreszierenden Reportermarkierung (mcitrine). (D) repräsentative Bild aus einer Kontrollratte (Ctrl) mit einem AAV-Konstrukt, das die DNA-Sequenz für ein fluoreszierendes Reporter infundiert (enhanced GFP). Maßstabsbalken: B, 500 & mgr; m; C und D 10081;. M Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie man einen pharmakogenetischen Ansatz (DREADD) anzuwenden, um zu untersuchen, wie eine bestimmte Hirnregion trägt zu einer Mehrphasen komplexen Lernaufgabe. Mit der Fähigkeit, vorübergehend zum Schweigen zu bringen und aus der Ferne neuronalen Aktivität in Hirnregionen in diskreten Phasen des Lernens, diese Kombination von Ansätzen bietet eine Plattform, um eine breite Palette von Verhaltensweisen, einschließlich differenzierter oder maskiert Lernformen zu untersuchen. Bei dem in diesem Protokoll beschriebenen Beispiel Kontrollratten und Ratten, die die Designer Rezeptor im Kortex retrosplenialen (RSC) exprimieren, wurden in einem 3-Phasen-Verhaltens Aufgabe 12 getestet. Die erste Phase der Aufgabe beteiligt Präsentation von mehreren neutralen Bedingung unter der Annahme, dass Ratten steuern würde ein Stimulus-Stimulus Assoziation zwischen zwei der Stimuli zu erwerben. Die Arbeitshypothese ist, dass RSC für Stimulus-Stimulus Lernen notwendig, wodurch auf jeder der 4 Anlage Tage, 30 min vor dem Beginn der Verhaltenstesting, Kontroll- und Versuchsratten wurden systemische Verabreichung von entweder der Designerdroge (CNO) oder Vehikel gegeben. Bei dem Designer Rezeptor gebunden, CNO reduziert die Aktivität von Neuronen in dem dieser Rezeptor exprimiert wird. Während der übrigen Phasen der Verhaltens Konditionierung und Prüfung, wenn die RSC ist nicht die Hypothese aufgestellt, um das Lernen zu beeinflussen, wurde CNO nicht verabreicht und somit wurde die neuronale Aktivität nicht gestört wird.

Kritische Steps innerhalb des Protokolls

Sicherer Umgang mit AAV-Verbindungen: Die chirurgische Eingriffe in der pharmakogenetischen Ansatz involviert sind nicht mehr technisch anspruchsvoll als eine einfache stereotaktischen Infusion jedoch die Verwendung von AAV in einigen Institutionen verlangt, dass Experimentatoren zu BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten. Es ist entscheidend, dass die Ermittler folgen Sie den von den Centers for Disease Control, Förderorganisationen, zu Hause und andere Institutionen, die auf ihre Forschungsprogramm Aufsichtsgremien festgelegten Richtlinien. Informationen über the sicheren Umgang mit AAVs leicht verfügbar ist 13.

Herstellung und Verabreichung der Designerdroge: CNO, der Designerdroge, bindet an den Rezeptor und Designer zum Schweigen neuronale Aktivität ist aber ansonsten biologisch inert 1,3. Verbringung von CNO von Lieferanten können in Konsistenz variieren. Die Verbindung sollte in Form eines Pulvers, das nicht an den Wänden des Behälters haftet, vor.

Wichtige Kontrollgruppen zu berücksichtigen: Um unspezifische Effekte der Designerdroge zu kontrollieren, vor der Verhaltenstests, ziehen eine andere Gruppe von Versuchsratten (dh diejenigen, die die Designer-Rezeptor exprimieren) mit Fahrzeug Injektionen anstelle von CNO. Darüber hinaus, um nicht-spezifische Effekte der Designer-Rezeptor zu steuern eine Gruppe von Ratten, die mit einem Kontrollvirus, die ein fluoreszierendes Reporter aber nicht die modifizierten Designer Rezeptor enthält infundiert werden und injizieren diese Ratten mit dem Designer-Droge (dh CNO) . Ensure angemessene Versuchsplanung durch ein Gegengewicht in Gruppen.

Verifizieren Expression des Konstrukts: Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, um die Expression und Erkennung des Designers Rezeptor zu maximieren. Vor der Infusion, sicherzustellen, dass der virale Titer ist in der Nähe von 10 12 Partikel / ml. Oft Visualisierung der fluoreszierenden Reporter niedrig ist und daher ist es empfehlenswert, dass die Immunhistochemie auf die Region von Interesse unter Verwendung von Antikörpern gegen das Reporter (n) gerichtet ausgeführt werden, bei dem viralen Konstrukt 25 enthalten. In diesem Beispiel bietet anti-GFP-Immunreaktivität ein zuverlässiges Signal (4B - D). Wichtig ist, dass aufgrund der Natur der fluoreszierenden Markierungen, begrenzen die Länge der Fixierungszeit auf 2 Stunden.

Vorteile der Techniken

Sobald das virale Konstrukt an das Gehirn über stereotaktischen Operation geliefert wurde, kann der pharmakogenetischen Ansatz für die vorübergehende inactivierung der Hirnaktivität in diskreten Regionen durch eine minimal-invasive systemische Injektion des Designers Medikament. Drug Administration kann wiederholt auftreten, die für die Verhaltens Aufgaben, die über aufeinanderfolgende Tage oder Wochen auftreten 12,24,26 vorteilhaft ist. Weiterhin zeigt Beweise, dass der Designer Medikament (CNO) nicht mit der Bewegungsverhalten oder Appetit 27,28 stören. Somit sieht das Verfahren die Möglichkeit, Nervenaktivität für eine kurze Zeitdauer (2-5 h) zu dämpfen, unter Vermeidung der Stressoren inhärent andere Verfahren der temporären Inaktivierung. Insbesondere in Kanülierung Studien temporären Inaktivierung durch Abgabe von Neurotoxinen durch Kanülen, die dauerhaft an dem Schädel befestigt erreicht. Dieser Ansatz ist insofern begrenzt, dass die Beibehaltung der Kanüle frei von Fremdkörpern geschützt ist eine Herausforderung. Außerdem Inaktivität zu induzieren, Tiere werden extensiv kurz vor Verhaltenstests behandelt (um das Toxin durch die Kanülen zu verwalten), which auferlegt Belastung des Tieres und erhöht auch die Wahrscheinlichkeit, dass die Kanüle aus dem Schädel zu entfernen. Da die Wirkungen von CNO sind relativ kurzfristig, sind die Möglichkeit, langfristige Ausgleichsmechanismen (wie jene folgende permanente Läsionen beobachtet oder in gentechnisch veränderten Mäuse) minimiert 29,30.

Grenzen der Techniken

DREADD ist ein relativ neues Verfahren zum nicht-invasiven Abschwächen neuronale Aktivität. Als solche Experimentatoren können geneigt sein, unabhängig zu überprüfen, dass neuronale Silencing tritt in ihrer Herstellung. Überprüfung durchgeführt werden kann unter Verwendung von elektrophysiologischen Methoden, aber diese Versuche sind zeitaufwendig, teuer und erfordern spezifisches Know-how. Darüber hinaus, während chemogenetic Techniken sind weniger kostspielig als Optogenetik ist der Ansatz teurer als herkömmliche Inaktivierung mit pharmakologischen Mitteln, wie TTX. Eine weitere Einschränkung des DREADD Ansatzes ist, dass infusIonen der viralen Konstrukte nicht in 100% Befall der Neuronen in der interessierenden Region aus noch Inaktivierung über CNO führen zu einer 100% Reduktion der neuronalen Aktivität. Schließlich können einige AAV-Serotypen retrograd transportiert werden, die Interpretation der experimentellen Ergebnisse 2 erschweren können.

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Acknowledgments

Wir danken den Autoren von Robinson et al. 12 für ihre Beiträge zu dem Manuskript, aus dem dieses Protokoll teilweise abgeleitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Male, Long Evans Rats, 55-60 days old Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
rAAV8/hSyn-GFP Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
Clozapine-N-oxide R&D Systems 4936-10 Designer drug
Rat Cage lid (polycarbonate) Alternative Design  FT 8XL-PC Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion
Filter paper (replacement) Alternative Design FP-R-1018XAD Filter paper that goes with cage lids
Table top vise JETS 2201-265 For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood
Biohazard trash bags Staples 113444 Medline biohazard liners
Biohazard trash can Amazon.com United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle
Isoflurane, 100 ml Patterson Veterinary Supply Inc. 07-890-8540 Anesthetic
Dual small animal stereotaxic with digital display readout console David Kopf Model 942 Surgical equipment
Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) David Kopf Model 955 Surgical equipment
Anesthesia mask (rat) David Kopf Model 906 Surgical equipment
High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder David Kopf Model 1474 Surgical equipment
Microdrill burrs, 0.9 mm Fine Science Tools Inc 19007-09 Surgical supply
Automated syringe pump with micro4 controller David Kopf Model UMP3-1 Surgical equipment
Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit Ahdis 21420 Surgical supply
Betadine skin cleanser Perdue Products L.P 67618-149-04 Surgical supply
Triple antiobiotic ointment Medline Supply 53329-087-01 Surgical supply
Puralube vet ointment Only Veterinary Supply 17033-211-38 Surgical supply
Dino-lite Microscope AD7013MTL An alternative to the traditional disection scope
Dino-lite rigid table-top boom stand Microscope MS36B Surgical equipment
28 G 10 μl syringe Hamilton 80308-701SN Surgical equipment
Extra tall MDF sound attenuating cubicle Med Associates, Inc ENV-018MD 22' W x 22" H x 16" D
Extra tall modular test chamber Med Associates, Inc ENV-007 Behavioral equipment
Stainless steel grid floor Med Associates, Inc ENV-005 Behavioral equipment
House light Med Associates, Inc ENV-215M Used as the house light and stimulus light
Modular pellet dispenser Med Associates, Inc ENV-203M-45 Behavioral equipment
Pellet receptacle, cup type Med Associates, Inc ENV-200R1M Behavioral equipment
Head entry detector for rat Med Associates, Inc ENV-254-CB Behavioral equipment
Dustless precision food pellets, 45 mg Bio-Serv F0165 Behavioral supply
Cage speaker for rat chamber Med Associates, Inc ENV-224AM Behavioral equipment
Programmable audio generator Med Associates, Inc ANL-926 Behavioral equipment
Smart ctrl 8 input/16 output package Med Associates, Inc DIG-716P2 Behavioral equipment
Large table-top cabinet and power supply Med Associates, Inc SG-6510D Behavioral equipment
PCI interface package Med Associates, Inc DIG-700P2-R2 Behavioral equipment
MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor Med Associates, Inc COM-103V Behavioral equipment
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg Electron Microsopy Sciences 19210 Hazard: carcinogen, weigh in hood
Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) Cell Signaling Technologies 3724S Histology reagent
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) Cell Signaling Technologies 2956S Histology reagent
Anti-rabbit IgG Cell Signaling Technologies 4412S Histology supplies
Superfrost plus slides VWR international 483111-703 Histology supplies

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References

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