Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Atomic force mikroskopi (AFM) genererer et billede af en overflade ved at scanne igennem et område af prøven under anvendelse af en udligger med en meget skarp spids 1. Bevægelsen af ​​cantilever sonder overflade topologi af prøven. AFM har været almindeligt anvendt på biologiske molekyler - herunder proteiner, DNA, og membraner, på grund af sin alsidighed i at analysere faste prøver i luften eller næsten native tilstand i flydende 2-5.

Bortset fra dens høj opløsning billeddannelse kapacitet i nanometerområdet, AFM cantilever virker som en fjeder til at probe interaktion styrker (adhæsions- og frastødning) og mekaniske egenskaber ved prøve 5,6. Dette er kendt som force spektroskopi. I denne tilstand sonden først nærmer prøven og udøver en kraft på det, så trækkes tilbage, indtil den mister kontakt med prøven (figur 1A). De genererede kurver viser kraft som funktion af afstand af cantilever for både appskalle og tilbagetrækning. Adskillige egenskaber, herunder elasticitetsmodulet for at måle stivheden af ​​et materiale, og adhæsionskræfter kan afledes.

Understøttede lipiddobbeltlag er biologiske modelmembraner liggende på toppen af en fast bærer - som regel glimmer, borsilicatglas, smeltet silica, eller oxideret silicium 7. De fremstilles under anvendelse af forskellige teknikker som vesikel deposition, Langmuir-Blodgett fremgangsmåde og spin-coating af 8,9. AFM billeddannelse er blevet anvendt til at følge dannelsen af disse understøttede dobbeltlag 10, og sonde forskellige strukturer dannet af membraner af forskellige sammensætninger 11-15.

Udførelse kraft spektroskopi på understøttede dobbeltlag resulterer i en top i tilgang kurve. Denne top angiver den nødvendige kraft til at gennembore dobbeltlaget, og kaldes gennembrud kraft. Dobbeltlaget Tykkelsen kan også måles ved hjælp af kraft kurve 6. Den typiske gennembrud kraft dobbeltlagområdet mellem 1-50 nN 6. Disse egenskaber afhænger af lipid pakning (flydende eller gel-fase) og struktur (acylkædelængde og grad af umættethed) og ændret af membran-midler 16. Teorien bag brud er blevet forklaret 17 og andre eksperimentelle parametre såsom cantilever blødhed, tip radius og tilgang hastighed påvirker også gennembruddet force 15,16,18. Kraft spektroskopi er blevet anvendt til at analysere egenskaber af forskellige lipidfaser 11,19, sammensætning-afhængige ændringer 12,20, samt virkningerne af andre biomolekyler, lignende peptider, på stabiliteten af membranen 21.

Den flade orientering af understøttede dobbeltlag er fordelagtig til at kombinere AFM med andre metoder såsom overfladeplasmonresonans 22 og fluorescensmikroskopi 11,19 til bedre karakterisere struktur og egenskaber af membraner.

Denne detaljerede video protocol er beregnet til at forberede understøttede lipiddobbeltlag hjælp vesikel deposition og analysere dem med AFM og force spektroskopi. Mens vesikler af forskellige størrelser kan anvendes til fremstilling af dobbeltlag, denne protokol fokuserer på små og store unilamellare vesikler. Understøttede dobbeltlag denne fase adskille i væske bestilt (L o) og flydende uordnede (L d) faser blev karakteriseret 11,15. Membranen består af di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC), sphingomyelin (SM) og cholesterol (Chol) ved 2: 2: 1 forhold. Denne sammensætning modeller lipidklumperne, som foreslås at opføre sig som platforme vigtige for protein handel og sortering, cellesignalering og andre cellulære processer 23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af understøttede lipiddobbeltlag (SLB) 11,12,21

  1. Fremstilling af lipidblanding og Multilamellare vesikel Suspensioner
    1. Fremstille følgende buffere forhånd.
      1. Forbered PBS-puffer ved koncentrationer på 2,7 mM KCI, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4, og 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Forbered SLB (støttet lipiddobbeltlag) buffer ved koncentrationer på 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.
      3. Forbered en opløsning af 1 M CaCl2.
    2. Opløs følgende lipider i chloroform ved en ønsket koncentration: for eksempel di-oleoyl-phosphatidylcholin (DOPC) ved 25 mg / ml, sphingomyelin (SM) ved 25 mg / ml og cholesterol (Chol) ved 10 mg / ml.
    3. Tag 18.38 pi DOPC, 17.10 pi SM og 11.30 pi Chol at lave en opløsning med 1 mg af totale lipider i et 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol molforhold. Varierer mængderne derfor baseret på koncentrations af lipider udarbejdet i 1.1.2. Dog opretholde det molære forhold på 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, som at ændre det molære forhold vil ændre faseegenskaber af membranen 25.
    4. Blande opløsningen fuldstændigt ved hvirvelblanding. Tilføj et fluorescerende farvestof lipid på 0,05 mol%, hvis man ønsker at visualisere dobbeltlaget ved et fluorescensmikroskop.
      Bemærk: Familien af ​​langkædede dialkylcarbocyanines, ligesom gjorde, Dil og DIO spænder over et bredt område af bølgelængder og kan ideelt anvendes til at mærke lipidmembraner. Alternativt kan fluorescerende mærkede lipider, såsom rhodamin-phosphatidylethanolamin eller BODIPY-cholesterol anvendes. Under alle omstændigheder bør koncentrationen af farvestoffet optimeres ifølge mikroskopi indstilling, i betragtning af at høje koncentrationer af fluoroforen bundet til lipidet kan ændre lipid adfærd 19.
    5. Tør chloroform under anvendelse af N 2-gas (eller enhver tilgængelig inert gas såsom Ar og He).
    6. Yderligere tør than lipidblanding under vakuum i mindst 1 time.
      Bemærk: Hvis lagring denne lipidblanding, rense luft med inert gas (N2, Ar eller He) og opbevares ved -20 ° C. Alikvot overskydende lipider-in-chloroform i små brune hætteglas. Tørre dem på en lignende måde som den lipidblanding, fortrænge luft med inert gas (N2, Ar eller He) og opbevares ved -20 ° C.
    7. Opløse de tørrede lipider i PBS-buffer til en koncentration på 10 mg / ml.
    8. Vortex blandingen kraftigt i ca. 20 sek til 1 min at komme en uklar suspension indeholdende multilamellare vesikler. Kontroller, at der ikke er nogen lipidfilm klæber til siderne af hætteglasset.
    9. Distribuere denne suspension i 10 alikvoter pi (1 mg lipid gør 10 portioner).
    10. Opbevar ved -20 ° C indtil videre anvendelse.
  2. Fremstilling af unilamellare vesikler
    Bemærk: Forskellige størrelser af unilamellare vesikler kan fremstilles ved anvendelse af lydbehandling metoden eller ekstruderingsmetoden. Sonikering bruger sound energi til omrøring af blandingen, og lagene adskilles af multilamellære suspension. Dette indikeres ved at rydde op i den uklar suspension. Ekstrudering tvinger multilamellare vesikler til at passere gennem et membranfilter med en bestemt porestørrelse.
    1. Sonikering Metode
      1. Tag 10 pi multilamellære lipidsuspensioner og tilføj 150 pi SLB puffer.
      2. Overfør blandingen i små (2 ml) udjævnede hætteglas og forsegle med Parafilm.
      3. Sonikeres blandingen ved stuetemperatur i et bad-sonikator i 10 minutter eller indtil den bliver klar til opnåelse små unilamellare vesikler (SUV'er, under 50 nm i diameter).
    2. Ekstrudering Metode
      1. Tag 10 pi multilamellære lipidsuspensioner og tilføj 150 pi SLB puffer.
      2. Suspensionen overføres en kryogen rør.
      3. Frys lipidsuspensionen ved at nedsænke den kryogene rør i et par sekunder i flydende nitrogen.
      4. Tølipidsuspension ved at nedsænke den kryogene røret i et vandbad ved stuetemperatur eller 37 ° C i nogle få minutter. Gentag fryse-tø trin mindst 10 gange.
      5. For at ekstrudere lipid suspension, brug en polycarbonatmembran med porestørrelse på 200 nm (andre porestørrelser er tilgængelige lignende, 100 nm eller 400 nm) og en kommerciel ekstrudering apparatet 26.
        Bemærk: I øjeblikket er der to ekstruder enheder kommercielt tilgængelige: en manuel ekstruder er tilgængelig for små volumener (200 pi til nogle få ml). I dette tilfælde er prøven ekstruderes gennem membranen ved manuelt at skubbe suspensionen frem og tilbage mellem to sprøjter. Afhængigt af producenten, vil lipid portioner skal kombineres for at nå minimum volumen af ​​opsætningen. For større mængder (op til 50 ml) anvendes mere sofistikerede udstyr, idet suspensionen tvinges gennem polycarbonat membran ved hjælp af komprimeret gas. Set-up og ekstrudering forhold kan ændre sig i henhold til den model. Se vejledningen fra producenten før brug. Denne protokol henviser til den manuelle ekstruder for små mængder.
      6. Ækvilibrer ekstruderen i vand ved at lede vand gennem ekstruderen. Fordyb membranen i vand.
      7. Placere membranen mellem de to stempler, samle enheden og ækvilibrere i puffer, ved at passere bufferen gennem ekstruderen, fra en sprøjte til den anden. Dette trin tillader desuden teste utætheder i systemet. Hvis det lækker, adskille og samle det igen ændre membranen.
      8. Tag lipidsuspensionen ved hjælp af en sprøjte af ekstruderen ("snavsede side).
      9. Fastgør sprøjten med lipidsuspensionen på én kammer og den tomme sprøjte på modstanderens kammer.
      10. Skub sprøjten i den ene ende. Sendes gennem membranen og ind i den modstående sprøjte. Dette er den 1. pass.
      11. Før den gennem membranen i alt 31 gange sådanneat løsningen ender på modstående sprøjte ("rene side").
        Bemærk: Kontroller membranen efter ekstrudering. Hvis det blev brudt, så ekstruderingsproces var ikke vellykket og skal gentages.
      12. Tøm sprøjten i et lille rør. Store unilamellare vesikler (LUVer) er stabile i 1-2 dage, hvis de opbevares ved 4 ° C.
  3. Udarbejdelse af Mica og Dækglas
    1. Vask Dækglas først i vand og derefter i ethanol. Lufttørre.
    2. Tag glimmer skiver og skrælle ydre lag med tape.
    3. Fastgør glimmer disk dækglasset. Gennemsigtige optiske lim er optimale, så man kan kontrollere dobbeltlag med et fluorescensmikroskop.
    4. Vedhæft plastcylindre (2,5 cm udvendig diameter, 2 cm indvendig diameter og 0,5 cm højde) der bruger optisk lim / fedt. Sørg for, at alt er tæt, og at der ikke er utætheder. Brug fedt, når der ønsker at genbruge flaskerne, da de let kan adskilles fra the dækglas og vasket. Dimensionerne af de plastcylindre afhænger af størrelsen af ​​AFM cantilever indehaveren af ​​og bør justeres i overensstemmelse hermed.
  4. Deposition af unilamelvesikler om Solid Support
    1. Pipetter hele liposomopløsningen direkte på glimmer. Tilføj flere SLB buffer til at nå et volumen på 300 pi.
    2. Tilføj 0,9 pi 1 M calciumchloridopløsning for at nå en endelig koncentration på 3 mM Ca2 +.
    3. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 minutter og derefter ved 65 ° C i mindst 10 min. Altid dække dobbeltlagene med buffer. Kontakt med luft og luftbobler vil ødelægge det. Under inkubering tilsættes mere buffer om nødvendigt, især hvis inkubering ved højere temperaturer.
      Bemærk: Inkubationstemperaturer variere afhængigt af lipidblandinger og faser påkrævet. Inkubationstid på mindst 10 minutter er nødvendig for at danne understøttede dobbeltlag, men det kunne være længere, afhængigt af temperaturen og sammensætningen.
    4. Vaskedobbeltlaget med varmt (65 ° C) SLB buffer 15-20 gange for at fjerne calcium og ikke-fusionerede vesikler. Tage ekstra pleje under vasketrinene at holde dobbeltlaget under buffer og forsigtigt Pipettér vaske- løsning for at undgå at ødelægge dobbeltlaget.
    5. Cool understøttede dobbeltlag til stuetemperatur, før AFM målinger. Dette er nødvendigt for at danne de forskellige faser af membranen samt minimere termisk drift i instrumentet.

2. Atomic force mikroskopi Målinger 11,12

  1. Imaging
    Bemærk: Udfør atomic force mikroskopi billedbehandling i kontakt mode eller trykke mode. Billede understøttede dobbeltlag i opløsning; ikke tillader løsning til at fordampe fuldstændigt, da dette vil ødelægge dobbeltlag. Som man kunne arbejde med buffer, skal du være opmærksom sikkerhedsforanstaltninger i at sikre, at enhver AFM del er beskyttet mod flydende spild.
    1. Vælg en blød cantilever (under 0,2 N / m fjederkonstant anbefales), og montere den til than AFM. Valget af cantilever stivhed er mere kritisk for kraft spektroskopi (og dette vil blive omtalt senere).
    2. Monter prøven på AFM scenen og sørg for, at alle vibrationer-isolation moduler er tændt. Vent i mindst 15 minutter til ækvilibrering og reducere termisk drift af systemet. Afhængigt af AFM opsætning, kan tuning og billedbehandling specifikationer varierer. Rådfør producentens håndbog.
    3. Nærme prøven med AFM spids indtil kontakt.
    4. Da lipiddobbeltlag er normalt 4 nm i højden, skal du bruge Z-serie af instrumentet, der vil give den højeste z-opløsning (f.eks 1,5 um).
    5. Vælg en region til billedet. At få et overblik over lipiddobbeltlaget, en 50 um x 50 um eller 25 um x 25 um regionen vil være et godt udgangspunkt til billedet. Hvis mindre funktioner vises, man kan billede i mindre områder (10 um x 10 um, eller 2 um x 2 um). Valget af den billeddannende område afhænger også af den arbejdende range af den piezoelektriske scanneren. Se venligst instrumentet manual for dette.
    6. Da dobbeltlag er meget skrøbelige, justere indstillede punkt i AFM spids under billedbehandling for at holde kraften ved minimum og korrigere for termisk drift, samtidig med at kontakt med prøven. I kontakt mode, minimere setpunktet. I aflytning tilstand maksimere setpunktet.
    7. Proces billeder ved montering hver scanning linje til polynomiel nivellering funktioner. Udfør line fjernelse for scanninger, der mister kontakt med membranen ved hjælp af proprietære software AFM produktionsvirksomhed.
  2. Kraft spektroskopi
    1. Kalibrer cantilever følge instruktionerne ifølge producentens protokol. Kalibrering tillader omdannelsen af det elektriske signal af fotodioderne til kraft (figur 1B).
      1. Kalibrere spidsen følsomhed til at måle afbøjning som z-piezo bevægelse (i enheder af længde) i stedet for elektrisk signal i volt.
      2. Beregn cantilever fjederkonstant ved hjælp af den termiske støj frekvens metode, inkorporeres sædvanligvis i AFM software. Ved denne fremgangsmåde plotte amplituden af ​​vibrationer fra støj i forhold til hyppigheden af ​​oscillation, hvilket skaber en power spectral density plot. Dette plot viser en top omkring resonansfrekvensen. Frekvensen hvor amplituden ir den største er resonansfrekvensen. Passe en Lorentz-funktion omkring spids til automatisk at beregne fjederkonstanten af ​​softwaren. Nogle nyttige ressourcer til teorien om den termiske støj metoden er givet i referencerne 27-30.
    2. Efter billeddannelse af et område af dobbeltlaget, vælg 5 um x 5 um region i dobbeltlaget at udføre kraft spektroskopi.
    3. Opstil AFM så det tager kraft kurver i en 16 x 16 gitter af denne region. Dette resulterer i 256 kraft kurver per region. Afstanden mellem to tilstødende punkter bør være nok til at undgå, at membranen område, som testes med et point ville falde sammen med det næste punkt. Dette afhænger på spidsen radius. En 100 nm afstanden mellem to punkter ville være ideelt. Opdele 5 um x 5 um regionen i 16 x 16 gitter. Afhængigt af størrelsen af ​​fasen, kan man vælge et mindre eller større område og derefter justere gitterstørrelse tilsvarende.
    4. Sæt z-piezo forskydning til400 nm. Dette bestemmer den maksimale rækkevidde af bevægelse af z-piezo. Det bør være stor nok til at sørge for, at cantilever fuldt ud har trukket væk fra prøven i mellem målingerne.
    5. Indstil tilgang hastighed til 800 nm / s og tilbagetrække hastighed til 200 nm / sek. Bruge en fremgangsmåde hastighed mellem 400 til 6000 nm / sek afhængigt af dobbeltlaget sammensætning og lipidfase, der skal undersøges 6,16.
    6. Efter opsætning af alle parametre, erhverve kraft kurver, ved at trykke på "run" knappen på AFM software.
    7. Spar kraft kurver som kraft vs. højde kurver (et mål for z-piezo bevægelse). Der er ikke taget højde for bøjning af cantilever ved kontakt med prøven. Under trin databehandling, AFM software giver korrektion for cantilever bøjning at få kraft vs. tip-prøve separation kurver (figur 1C), som vil give ordentlige værdier for dobbeltlag tykkelse. De korrektionsværdier er normalt inkorporeret i Kalibrtion, som er gemt med hver kraft kurve. Beregn tip-prøve separation ved at subtrahere den lodrette afbøjning fra piezo bevægelse ved et givet punkt.
      Bemærk: Toppen i tilgangen kraft kurven (den kraft værdi går ned, selv om cantilever bevægelsen er stadig på den fremgangsmåde cyklus) er gennembruddet kraft af membranen, mens forskellen mellem positionen af ​​denne spids og positionen af ​​punktet hvor kraften begynder at stige op igen giver tykkelsen af ​​membranen.
    8. Anskaf mindst 500 kraft kurver for hver betingelse for at få gode statistik. Plotte et histogram af værdierne ved hjælp af programmer som Origin eller MatLab, og passer histogrammerne til en gaussisk fordeling til at få toppen og bredden af ​​fordelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Understøttede lipiddobbeltlag sammensat af DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) blev afbildet i AFM (figur 2 AC). På grund af lipidsammensætningen, blev SM / Chol-rige L o og DOPC-rige Ld faser observeret. Højden profil fra AFM imaging kan give vigtige oplysninger om membranen struktur. Ved at kigge på højden profil, kan måles dobbeltlaget tykkelse i tilstedeværelse af defekter i membranen (figur 2B) eller højdeforskellen mellem L o / Ld faser kan tilvejebringes. Desuden AFM gør det muligt at specifikt vælge regioner repræsenterer disse faser og analysere deres mekaniske egenskaber ved hjælp af kraft spektroskopi (Figur 2 D - F). Kraften kurver afledt af kraft spektroskopi tilstand anvendes til at måle det gennembrud kraft ved at finde den kraft værdi på toppen af den kraft kurve (figur 2D og E), og Membrane tykkelse ved at subtrahere afstanden værdi fra toppen af kraftkurve til værdien afstand når kraften kurven begynder at stige igen (figur 2D og F).

Følsomheden af ​​AFM målinger afhænger af piezoelektrisk materiale og elektroniske feedback-sløjfer. Som sådan før gøre eksperimenter, er det vigtigt at blive fortrolig med AFM oprettet. Der er to fælles instrument oprettet for de piezoelektriske materialer: (1) rør scanner, hvor prøven er placeret på toppen af ​​den piezoelektriske materiale, og prøven scannes på en ubevægelig tip; eller (2) bøjning-fase, hvor spidsen er monteret på det piezoelektriske materiale i stedet for prøven. I sidstnævnte tilfælde er det piezoelektriske materiale og anden elektronik beskyttet mod spild. En masse af AFM modeller for biologiske anvendelser har denne konfiguration.

Under billedbehandling kan AFM spids mister kontakt med prøven og føre til fejlagtige migasurements. Afhængigt af hvor mange scanninger går tabt, kan billedet korrigeres ved at fjerne de skannelinier og anvendelse af en gennemsnitlig intensitet filter til at udlede de nye værdier fra omgivelserne (figur 3). Men i de fleste tilfælde er dette ikke give et godt image, og det anbefales at blot kassere billedet. Der er andre artefakter, der skal overvåges. Disse opstår fra stumpe / beskadigede / dirty tips samt diffraktion af laser spot bag cantilever 31. I disse tilfælde bør billeder kasseres og AFM spids skal udskiftes.

Under kraft spektroskopi målinger, kan opstå flere udfordringer: (1) fravær af toppe (figur 4A), (2) tilstedeværelse af skuldrene i stedet for veldefinerede toppe (figur 4B), (3) en lille stigning og efterfølgende plateau ved meget lav kræfter (figur 4C - D). Fraværet af en top kan tilskrives måling i en region uden en bilbetingelser Ayer eller køb ikke bliver optimeret. Det anbefales, at en AFM billede er erhvervet før gør kraft spektroskopi til at sørge for, at dobbeltlaget faktisk bliver målt. Erhvervelse forhold samt tip / cantilever specifikationer påvirker sandsynligheden for et gennembrud begivenhed 17. En skarpere spids kan nemt punktere et dobbeltlag, som sådan, kan gennembruddet kraft synes lav eller ikke ud på alle, fordi det er under støjniveauet. . Forøgelse af tilgang hastighed øger også gennembruddet kraft 16. Som dobbeltlaget presses af spidsen, lipidmolekylerne også reagere at sprede denne kraft. Ved en lavere anflyvningshastighed, lipiddobbeltlaget har tid nok til at ækvilibrere før næste trin i kraft, og dette øger sandsynligheden for, at et gennembrud begivenhed kan ske. Ved en højere anflyvningshastighed, kraften ramper hurtigere end omsætningen af ​​lipiderne og, som sådan, er sandsynligheden for et gennembrud begivenhed er lavere ved samme kraft. Det er Eventueltenelig at ved hjælp af høj tilgang hastighed, setpunktet nås før dobbeltlagede pauser resulterer i ingen observerbare toppe. Der er ingen rapporter til at forklare forekomsten af ​​skuldrene på kurven, men vi postulerer, at det kunne skyldes væsentlig komprimering før gennembrud. Endvidere kan et plateau eller brede toppe ved meget lave kræfter indikere tilstedeværelsen af ​​snavs eller løs lipidmateriale i spidsen. Tips kan samle snavs og lipidisk materiale i span af flere målinger. Snavs og materiale fastgjort til spidsen gør det stumpe, hvilket øger gennembrud kraft.

Det anbefales, at force kurver er erhvervet i forskellige områder, hvis der opstår disse udfordringer. En anden anbefaling er at ændre tips (dette vil kræve rekalibrering). Endelig kan anflyvningshastigheden skal justeres eller anvendelse af en spids med forskellige specifikationer (tip radius og stivhed) kan overvejes. Gennembruddet kraft varierer mellem 0-50 nN 6 som sådan, than fjederkonstant af cantilever kan være i intervallet fra 0,05 til 0,7 N / m. De fleste kommercielle cantilevere har en nominel tip radius omkring 20-40 nm. I stedet for at bruge konventionelle tips, kunne spidsfrie køreledningsophæng også købes og kugler af kendte radius (som normalt monodisperse i størrelse distribution) kan knyttes til dem. At få reproducerbare data, altid bruger de samme erhvervelse betingelser og cantilever specifikationer for det samme sæt af eksperimenter.

Figur 1
Figur 1: Principper for Kraft spektroskopi (A) Sekvens af tilgang-tilbagetrækning af cantilever fra prøven.. Den røde linje viser udliggeren afbøjning fra sin ligevægtsstilling (sort linje). (B) Cantilever kalibrering konverterer elektrisk signal (i volt) til at tvinge (i newton). Ved erhvervelse af cantilever sensitivitet og fjederkonstant den lodrette afbøjning (i volt) omdannes til afstand og afstanden i kraft ved hjælp af Hookes lov. (C) Ved kontakt gældende spektroskopi målinger, er z-piezo scan bevægelse ikke hensyn udliggeren bøjning. En korrektion for dette kan gøres ved at trække den lodrette afbøjning, x (i afstand enheder) fra z-piezo bevægelse, z (også i afstand enheder). På denne måde den faktiske spids-prøve separation, i stedet for blot z-piezo bevægelse, kan rapporteres, som er en mere nøjagtig måling af afstande og er vigtig for at måle tykkelsen af ​​prøven.

Figur 2
Figur 2:. AFM af SLBs (A) Scheme of SLBs sammensat af DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) isolerede i væske uorganiseret (L d) og flydende bestilte (L o) faser. (B (C) svarer til den gule firkant i B (10 um x 10 um). L o og L d faser mærket. Under linien profil svarer til den gule linie i billedet. The L o fase vises 1-2 nm højere end L d fase. (D) En prøve kraftkurve viser, hvordan gennembruddet kraft og membrantykkelse er afledt. (E) Gennembrud kraft, og (F) membrantykkelse fordeling for L D og L o faser med Gauss fitting til kvantificering.

Figur 3
Figur 3: Tab af kontakt under billedbehandling fører til. scanne linjer, der ikke svarer til resten af billedet Et understøttet dobbeltlag sammensat af DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) med tab af kontakt i nogle liniescanninger. Målestokken 2 um.

Figur 4
Figur 4:. Udfordringer i Kraft spektroskopi (A) Nogle kraft kurver får ingen toppe. (B) Kurven kan have skuldrene i stedet for veldefinerede toppe. (C) Efter en lille stigning et plateau kan forekomme i fravær af toppen. (D) Udseende af et plateau med en veldefineret top.

Membran region Gennembrud Force (NN) Membran Tykkelse (nm)
L d fase 6 ± 1 4.7 &# 177; 0,5
L o fase 8 ± 1 6 ± 1

Tabel 1: Membran egenskaber af DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). SLBs The L d fase har et gennembrud kraft 6 ± 1 nN og en tykkelse på 4,7 ± 0,5 nm. The L o har 8 ± 1 NN og en tykkelse på 6 ± 1 nm. Højdeforskellen mellem de to faser er 2 ± 1,4 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SLBs sammensat af DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) blev dannet på glimmer efter vesikel adsorption og brud induceret af calciumchlorid. Denne lipidsammensætning adskilt i L D og L o faser. L o fase beriges med sphingomyelin og cholesterol og er mindre fluid / mere tyktflydende (figur 1A) end L d fase 11. Adskillelsen af L o fra L d fase manifesterer sig som cirkulære strukturer hævet over det omgivende (figur 1B, C). Platformene er de L o faser omgivet af L d faser. Membrandefekter (eller huller i membranen) er også ses (figur 1B, blå pil) og en højdeprofil over denne defekt viser tykkelsen af dobbeltlaget. L d / l o højdeforskel kan også undersøges ved at se på en AFM højdeprofil (figur 1C).

Fremstillingen af ​​lipidblanding er meget vigtigt, da sammensætningen bestemmer dobbeltlagede egenskaber. Under fremstillingen af ​​den understøttede dobbeltlag, er det vigtigt at arbejde ved de angivne temperaturer for korrekt dannelse af lipid faser (trin 1.4.5). Under billedbehandling, holder lav kraft er meget vigtigt for ikke at ødelægge dobbeltlaget eller til at samle snavs på spidsen.

Efter AFM billeddannelse, er regioner i SLB udvalgt og undersøgt ved hjælp af kraft spektroskopi. Kraft spektroskopi tillader os at undersøge andre egenskaber af membranen, især gennembruddet kraft (figur 1D). L d og L o faser vise forskellige gennembrud kraft, og tykkelsen (figur 1E, F). Ejendommene er opsummeret i tabel 1. Vi bemærker, at i forhold til Chiantia et al. 11, blev lignende værdier for gennembrud kraft i L d fase opnået, men en lavere værdi for L o fase. Dette kunne værepå grund af lavere mængder af kolesterol, der anvendes i vores membraner (vi bruges DOPC: SM: Chol forholdet 2: 2: 1, mens de bruges på 1,5: 1,5: 1). Dette viser også vigtigheden af ​​at blande den rigtige lipid-forhold - en kritisk faktor i reproducerbarhed af resultaterne. Desuden ved hjælp af forskellige lipider (kædelængde og grad af umættethed) ændrer også de dobbeltlagede egenskaber 6,15,18.

Mens plotte fordelingen af banebrydende kræfter er nyttigt og kan allerede vise forskelle i dobbeltlaget egenskaber, kan anvendes yderligere analyse af gennembrud kraftfordeling at udlede andre mekaniske egenskaber, herunder line spænding og spredning tryk 11,17,21. Kort fortalt er den sandsynlighed, P (F) til at måle et bestemt gennembrud kraft, F, beskrevet af kontinuum kernedannelse model 11,15,17:

Ligning 1

hvor A er Resonance frekvens af cantilever, K er fjederkonstanten af ​​cantilever, v er hastigheden af ​​den fremgangsmåde, Γ er den linje spænding (kanten energi, der kræves til at holde et hul i membranen åben), R er radius af AFM tip, k B er Boltzmanns konstant, T er temperaturen, og S er spredningen tryk eller den energi der er forbundet til at lukke hullet (modsatte af membranspænding - den nødvendige energi skal udøves af membranen for at åbne et hul 32). Denne ligning kan integreres og dP / dF kan beregnes som:

Ligning 2

A, K, R er egenskaber ved AFM cantilever / tip, der kan erhverves gennem cantilever kalibrering. T og v er eksperimentelle parametre, der bør holdes konstant gennem eksperimenterne. dP / dF derefter monteret på histogrammet for at erhverve den linje spænding og spredning tryk. Som flere parametre påvirker P (F), erfamentalists rådes til at bruge lignende tips og betingelser erhvervelse at have sammenlignelige værdier for linje spænding og spredning pres. Forurening af AFM spids (herunder snavs og ikke-fusionerede blærer på spidsen erhvervet under billedbehandling) fører til ikke-reproducerbare resultater. Desuden vil valget af støtten påvirker de mekaniske egenskaber af membranen 20.

En anden teknik, der kan karakterisere mekaniske egenskaber af lipid-dobbeltlaget er i mikropipetten aspiration af gigantiske unilamellare vesikler (GUVs) 33. Ved denne teknik er membranspænding beregnet ud fra deformation af GUVs under opsugning. Endvidere ved at øge sugning, kan man beregne den spænding, ved hvilken guv brud (eller lysis spænding) 34, som kunne være knyttet til linjen spænding i kontinuum nukleering model. En ulempe ved denne teknik er kompleksiteten af ​​beregning membran spænding til fase adskille membraner, som de forskellige PHASES har forskellige mekaniske egenskaber 35. Dette er i modsætning til AFM force spektroskopi, hvor individuelle faser kan karakteriseres separat. Desuden, mens der er behov for mange GUVs at producere statistisk relevante resultater, kan AFM producere en fordeling pr SLB. Imidlertid membran remodeling virkninger (f.eks tubulation og invaginationer) lettere visualiseret med GUVs, hvilket gør dem bedre systemer til at karakterisere disse shape-relaterede effekter sammen med mekaniske egenskaber.

I yderligere anvendelser til at undersøge konsekvenserne af membranproteiner på dobbeltlagede egenskaber kan oprensede proteiner inkorporeres i disse vesikler til at gøre proteoliposomer. En teknik til at gøre dette bruger rengøringsmidler til at hjælpe de proteiner, for at stabilisere og indsætte i membranen. Efterfølgende rensning via dialyse eller gelpermeationskromatografi fjerner gratis proteiner og rengøringsmiddel i opløsning 36. En anden tilgang kræver mærkning afde oprensede proteiner (for eksempel histidin eller Streptavidin tags) og inkorporerer affinitetspartnere for dette mærke i liposomerne (med nikkel-nitriloeddikesyre (Ni-NTA) eller biotinylerede lipider).

Sammenfattende beskrev vi en metode til at analysere lipiddobbeltlag. På grund af sin høje opløsning, kan AFM afsløre sub-mikrometer strukturer i membranen, som omfatter lipidfaser blandt andre. Kraft spektroskopi, her anvendes til karakterisering af lipidmembraner, kan også bruges på membranproteiner og andre biomolekyler på membranen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society, det tyske Cancer Research Center, University of Tübingen, og Bundesministerium für Bildung und Forschung (bevilge nr. 0312040).

Vi takker Eduard Hermann for at hjælpe os automatisere analysen af ​​den kraft kurven data og Dr. Jakob Suckale for nærlæsning af dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
  2. Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
  3. Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
  4. Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
  5. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
  6. Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  7. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
  8. Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
  11. Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
  12. Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
  13. Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
  14. Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
  15. Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
  16. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
  17. Butt, H. -J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
  18. Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
  19. Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
  20. Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
  21. García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
  22. Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
  23. Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
  24. Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
  25. Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  26. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
  27. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
  28. Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
  29. Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
  30. Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
  31. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
  32. Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
  33. Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
  34. Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
  35. Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
  36. Rigaud, J. -L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics