Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Bij gentherapie toepassingen is het van groot belang cytotoxische en immunogene bijwerkingen veroorzaakt door expressie van virale proteïnen, het transgen zelf of binnenkomende virale eiwitten voorkomen. Adenovirusvectoren (AdV) worden veelvuldig gebruikt om vreemd DNA te introduceren in een grote verscheidenheid van cellen om het effect van transgenexpressie 1,2 onderzoeken. De meest geavanceerde versie van AdV wordt vertegenwoordigd door hoge capaciteit adenovirus vectoren (HCAdV) ontbreken alle virale coderende sequenties 3,4 en biedt daarmee een verpakking capaciteit tot 35 kb in combinatie met een lage immunogeniciteit en lage toxiciteit 5-8. Vanwege hun hoge verpakkingscapaciteit ze laten leveren van grote of meerdere transgenen met een enkele dosis vector. Daarom, zij vertegenwoordigen een waardevol instrument voor de onderzoeksgemeenschap.

In tegenstelling tot de eerste of tweede generatie AdV zonder de vroege genen E1 en / of E3 die eenvoudig kunnen worden geproduceerd met behulp van commerciële kits, vector genoom bouw en virus productie van HCAdV is complexer. Het systeem voor de constructie van HCAdV genomen is gebaseerd op het plasmide pAdFTC met een HCAdV genoom zonder alle virale coderende sequenties en shuttle plasmide pHM5 9-12. Elk gen van belang tot 14 kilobasen (kb) worden gekloneerd in de shuttle vector pHM5 waarbij de meervoudige kloneringsplaats geflankeerd door herkenning / splitsen plaatsen van de homing endonucleasen PI- Sce I I- Ceu I. Daarom kan een gekloneerd gen van interesse worden vrijgegeven door opeenvolgende PI- Sce I en I Ceu I digesteert voor daaropvolgende gerichte insertie in dezelfde restrictieplaatsen aanwezig in het genoom HCAdV in het plasmide pAdFTC. In pAdFTC de transgene insertieplaats tussen de PI- Sce I en I Ceu I splitsingsplaatsen wordt geflankeerd door DNA stuffer en de coderende adenovirale sequenties die vereist zijn voor genoom verpakken als de 5 'en 3' omgekeerde eindstandige herhalingen (ITR's)aan beide uiteinden en het verpakkingssignaal stroomafwaarts van het 5'ITR. De extra DNA stuffer een optimale grootte van de uiteindelijke HCAdV genoom variëren van 27 tot 36 kb efficiënte verpakking tijdens virusproductie te waarborgen. Aangezien pAdFTC is een groot plasmide met tot 45 kb (afhankelijk van de grootte van het ingebrachte transgen) en het gebruik van homing endonucleases naar verhouding lange verwijzingen DNA herkenning vertoont sterke DNA bindende verscheidene opschonen stappen nodig tijdens de overdracht van het transgen uit pHM5 naar pAdFTC. Zorgvuldige behandeling vermijden van schuifkrachten wordt aanbevolen.

De ITR's van de HCAdV genoom geflankeerd door NotI restrictie-enzym herkenningsplaatsen direct stroomopwaarts van het 5'ITR en stroomafwaarts van de 3'ITR 12. Daarom kan HCAdV worden vrijgegeven door Notl digest voor daaropvolgende transfectie van het virale genoom in de HCAdV producerende cellijn. Merk op dat het gebruik van het restrictie-enzym Notl voor relgemak van het virale genoom van het plasmide pAdFTC impliceert dat de ingebrachte transgen mist NotI DNA herkenningsplaatsen. De HEK293 cellen gebaseerde producerende cellen (116 cellen) stabiel uitdrukken Cre recombinase. Voor virus amplificatie 116 cellen zijn co-geïnfecteerd met een helper virus (HV) het verstrekken van alle AdV genen die nodig zijn voor replicatie en verpakken in trans 3,4. De HV is een eerste generatie AdV met een floxed verpakking signaal dat tijdens virusreplicatie door Cre recombinase tot expressie gebracht in 116-cellen 4 wordt verwijderd. Dit zorgt ervoor dat voornamelijk HCAdV genomen met een intacte inpaksignaal worden ingekapseld.

Pre-amplificatie van het HCAdV wordt uitgevoerd door het uitvoeren van seriële passage in stappen 116 cellen gekweekt op oppervlakken in weefselkweekplaten. Na elke doorgang virusdeeltjes vrijkomen uit geïnfecteerde cellen door het uitvoeren van drie achtereenvolgende vries- dooi stappen. Bij elke passage steeds meer cellen worden besmet met1/3 cellysaat van de voorgaande passage. Tenslotte lysaat uit de laatste pre-amplificatiestap wordt gebruikt om producerende cellen gekweekt in suspensie in een spinner fles voor grootschalige amplificatie infecteren. Virionen gezuiverd uit de celsuspensie door het uitvoeren van ultracentrifugatie in een cesium chloride dichtheidsgradiënt 4,12. Met deze procedure lege deeltjes volledig geassembleerd deeltjes worden gescheiden in twee afzonderlijke banden. Om verder te concentreren de HCAdV deeltjes een tweede niet-geleidelijke ultracentrifugatie stap wordt uitgevoerd. Vervolgens werd de verkregen band met de HCAdV verzameld en gedialyseerd tegen een fysiologische buffer. Vector laatste voorbereidingen worden gekenmerkt met betrekking tot de aantallen absolute virusdeeltjes, besmettelijke deeltjes en HV besmetting niveaus. Absolute virale deeltjes kan worden bepaald door het lyseren van virusdeeltjes en meten van de absorptie bij 260 nm of door het uitvoeren van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) 12. Besmettelijkheid van de purified virusdeeltjes kan worden bepaald door qPCR meten HCAdV genomen aanwezig in geïnfecteerde cellen 3 uur na infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Constructie van recombinante HCAdV Genomes basis van het Plasmid pAdFTC

Opmerking: Alle plasmiden zijn eerder beschreven 11,12 en zijn beschikbaar op aanvraag. De klonering procedure is schematisch weergegeven in figuur 1.

  1. Kloon een gen van belang (GOI) omvattende promoter en polyadenylatiesignaal (pA) in het shuttleplasmide pHM5, met een kloneringsstrategie keuze te pHM5-GOI genereren.
    OPMERKING: Omdat pAdFTC een relatief groot plasmide, worden klassieke plasmidebereiding protocollen aanbevolen afschuiving van het plasmide-DNA vermijden door commerciële plasmidezuivering kits die zijn gebaseerd op silica membranen. I- Ceu I en PI -Sce ik sterk binden aan het DNA en verander de elektroforetische mobiliteit van DNA verteerd. Daarom is een fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie (stap 1,3) nodig voor agarosegelelektroforese.
  2. Digest 20 ug PHM5-GOI en 10 ug pAdFTC door I-CeuI (10 U) gedurende 3 uur bij 37 ° C in een totaal volume van 100 pl aan lineariseren plasmiden (~ 2,8 kb + GOI ORF sequentie en ~ 31KB respectievelijk).
  3. Zuiver lineair gemaakte plasmiden behulp fenol- chloroform extractie gevolgd door ethanol (EtOH) neerslag 13.
    1. Voeg 100 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol en meng voorzichtig door het buisje meerdere malen. Centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g.
    2. Breng de bovenstaande vloeistof over in een nieuwe buis, voeg 20 ul natriumacetaat (pH 5, 3 M) en 400 pl ijskoude EtOH (99,8%) en meng suspensie krachtig. Centrifugeer 10 minuten bij 15.000 x g.
    3. Verwijder het supernatant, voeg 300 pl 70% EtOH en centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g. Verwijder supernatant en de lucht drogen DNA pellet. Los het pellet bij 10- 20 ui dH 2 O. Droog geen DNA-pellet te lang, omdat het moeilijker zal zijn om DNA te krijgen in oplossing.
  4. Digest I-Ceu I gedigereerd pHM5-GOI en pAdFTC plasmide uit stap 1,3) gedurende ten minste 3 uur of O / N met de restrictie-enzym PI -Sce I (10 U) bij 37 ° C in een totaal volume van 50 pl en vervolgens zuiveren I -CeuI en PI -Sce I gedigereerd plasmide behulp fenol- chloroform extractie gevolgd door precipitatie met EtOH (zie stap 1,3). Los DNA in 20 ul nuclease-vrij dH 2 O.
  5. Aparte pHM5 plasmideskelet (2,8 kb) en de Indiase overheid (uit stap 1.4) op een preparatieve agarosegel en gel-zuiveren van de Indiase overheid met behulp van een commercieel gel- en PCR clean-up kit. Een vertegenwoordiger agarosegel van het digest wordt getoond in figuur 2A.
  6. Defosforyleren I- Ceu I en PI -Sce gedigereerde pAdFTC (uit stap 1.4) met Calf Intestinal Alkaline fosfatase CIP (10 U) gedurende 1 uur bij 37 ° C in een totaal volume van 25 pl en zuiveren gedefosforyleerd plasmide pAdFTC door fenol-chloroform extractie en daaropvolgende EtOH precipitation (stap 1,3). Elueer DNA in 20 ul nuclease-vrij dH 2 O.
  7. Voer analytische gelelektroforese uit een hoeveelheid van het gedefosforyleerde pAdFTC plasmide (uit stap 1.6) en het gezuiverde GOI-fragment (uit stap 1.5) te analyseren of monsters niet voltooid en de groottes van de verwachte fragmenten correct (zijn ~ 31 kb van gelineariseerde pAdFTC ).
    Opmerking: De grootte van het GOI is variabel afhankelijk van de grootte van de transgene expressiecassette. Schat de relatieve concentraties van de respectievelijke fragmenten voor daaropvolgende ligatie. Een vertegenwoordiger agarosegel gezuiverd fragmenten is getoond in figuur 2B.
  8. Stel de ligatiereactie in een totaal volume van 20 ul gebruikt 400 U T4 DNA ligase en een molaire verhouding van vector in te voegen van 1: 3.
    Opmerking: In overeenstemming met de agarosegel figuur 2B we meestal ligeren in een totaal volume van 20 ul met 2 tot 6 pl vector, 8- tot 12 glinvoegen en 400 U van T4 DNA ligase. Aangezien de DNA-concentratie is doorgaans laag na enkele phenolization stappen gebruiken zoveel DNA mogelijk, zodat geen extra H2O moet worden toegevoegd aan het eindvolume van 20 pl te bereiken. Ligeren bij 16 ° CO / N en vervolgens uitvoeren van fenol-chloroform extractie gevolgd door precipitatie met EtOH (stap 1,3).
    1. Elueer DNA in 15 ul nuclease-vrij dH 2 O en verteren het gezuiverde ligatiereactie met het restrictie-enzym Swal (10 U) gedurende 2 uur bij 25 ° C in een totaal volume van 20 pl. Dan concentreren en zuiveren van DNA, door het uitvoeren van fenol-chloroform extractie gevolgd door precipitatie met EtOH (stap 1,3). Elueer DNA in 10 ul nuclease-vrij dH 2 O.
  9. Transformatie 2 ui van het gezuiverde SwaI gedigereerd ligatieproduct door elektroporatie in DH10B electrocompetente DH5a of E. coli en selecteer klonen gedurende 16 tot 24 uur bij 37 ° C op ampicilline bevattende LBplaten (50 mg / ml ampicilline). Selecteer 5- 10 klonen en bereiden plasmide DNA mini-preparaten gebruikt alkaline lysis gevolgd door fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie daarop (stap 1,3) 13.
  10. Voer een analytische digest van plasmide mini-preparaten, gevolgd door agarosegelelektroforese om de grootte van DNA fragmenten controleren. Suggereerde restrictie-enzymen zijn bijvoorbeeld I- Ceu I en PI-Sce ik het loslaten van de insert, Spe I en Hinc II (figuur 2C).
  11. Amplify een correcte kloon ampicilline bevattende LB-medium (50 mg / ml ampicilline) en voer een midi- of maxi-plasmidepreparaat met elke commercieel verkrijgbare plasmide zuiveringskit.

2. Vrijgave van HCAdV-genoom van pAdFTC Plasmid en Voorversterking van HCAdV vectoren in de Producer Cell Line 116

  1. Digest 20 ug van het pAdFTC-gebaseerde adenovirale productie plasmide dat het gekloneerde GOI uit stap 1,11) ineen totaal volume van 100 pl met behulp Not I (20 U) bij 37 ° C gedurende> 2 uur en uitvoeren van fenol-chloroform extractie gevolgd door tweemaal EtOH precipitatie. Oplossen in 20- 30 ul steriele dH 2 O.
  2. Controleer een portie van 1:10 verdund verteerd pAdFTC-GOI-DNA door gelelektroforese. Een 9 kb fragment van de plasmide ruggengraat en, afhankelijk van de grootte van het GOI, een tweede DNA-fragment voor HCAdV genoom (size: 28- 36 kb) detecteerbaar.
    LET OP: Een representatief voorbeeld van de Not I digest wordt weergegeven in figuur 2D. Gelineariseerd DNA kan enkele dagen bewaard bij 4 ° C of bij -20 ° C gedurende enkele weken.
  3. Voordat u verder gaat met het protocol, zorg ervoor dat de helper virus AdNG163R-2 is versterkt 4.
    Opmerking: cellen die met pAdFTC HCAdV afgeleide vectoren zijn genetisch gemodificeerde organismen die als Biosafety Level 2 (BSL-2), dan kunt u gebruik maken van de juiste insluiting en afvalverwerkingmaatregelen, met inbegrip van persoonlijke beschermingsmiddelen, en werken onder BSL-2 afzuigkappen met laminaire stroming.
  4. Cultuur 116 cellen in MEM Eagle medium aangevuld met 10% FBS en hygromycine B (100 gg / ml). Seed lage passage (passage 10 hieronder) 116 cellen (~ 0.4x 10 6 cellen) in een 60 mm weefselkweekplaat één dag voor transfectie, zodat zij 50- 80% confluentie de volgende dag te bereiken.
  5. Transfectie gelineariseerd HCAdV genoom van stap (2.1) in 116 cellen door gebruik van werkwijzen, zoals calciumfosfaat transfectie of andere commercieel verkrijgbare transfectie reagentia (Figuur 3A). 16- 18 uur na transfectie, verwijder het medium, voeg 3 ml vers medium (MEM, 5% FBS) en cellen infecteren met HV AdNG163R-2 4 5 aanbrengen transducerende eenheden (TU) per cel (aangezien een confluente 60 mm weefselkweek schotel bevat ~ 3,2x 10 6 cellen, voeg ~ 1,6x 10 7 TU van HV).
    1. Beweeg het gerecht elke 20 min gedurende het eerste uur na infectiezorgen voor gelijke HV distributie. Telen geïnfecteerde cellen bij 37 ° C en 5% CO2. Bij efficiënte virusreplicatie cytopathisch effect (CPE) als gevolg van virusreplicatie (cellen afgerond en losjes verbonden of losgemaakt van de weefselkweekschaal) wordt waargenomen 48 uur na infection.If CPE waargenomen eerder de hoeveelheid HV te verlaagd. Als CPE begint later, meer helpervirus te gebruiken.
  6. Oogst cellen waaronder supernatant 48 uur na infectie door spoelen van de cellen van de kweekschaal met het kweekmedium. Cellen die zijn opgehangen in hun kweekmedium worden passage genoemd 0 (P0). P0 gesplitst in twee fracties.
    1. Uit 0,5 ml van de losgemaakte cellen spin down de cellen gedurende 3 min bij 2000 x g en verwijder medium uit de cel pellet, die later gebruikt voor het isoleren van genomisch DNA (gDNA) voor qPCR gebaseerde analyse van het amplificatieproces. WINKEL celpellets bij -20 ° C tot verdere verwerking.
    2. Uit 2,5ml van de losgemaakte cellen los virale deeltjes door bevriezing (bij -80 ° C of in vloeibare stikstof) en ontdooien (bij kamertemperatuur of in een 37 ° C waterbad) de cellen die resupended in het medium 3-4 keer. Deze fractie is dan heet lysaat van P0.
  7. Zorg dat weefselkweekschalen met 116 cellen die zijn gekweekt tot 90- 95% confluentie gebruikt MEM-medium aangevuld met FBS (10%) en hygromycine B (100 gg / ml) en HV beschikbaar voor de volgende passage stappen.
  8. Meng 1 ml vers medium (MEM, 5% FBS) met 2,5 ml van het lysaat van de vorige passage (stap 2.6.2) tot een eindvolume van 3,5 ml, voeg HV toepassen 2 TU per cel (omdat een 60 mm tissue cultuur schotel bij een confluentie van 90- 95% bevat ~ 3,2x 10 6 cellen, voeg ~ 6,4x 10 6 TU van HV). (Figuur 3B). Haal het medium van een 60 mm schaal van 116 cellen en voeg het virale mengsel aan de cellen. Herhaal stap 2.6) - 2.8) tweemaal lysaten van pas te verkrijgenleeftijden P1 en P2.
  9. Meng 17,5 ml vers medium (MEM, 5% FBS) met 2,5 ml van het lysaat van P2 en voeg HV toepassen 2 TU per cel (omdat een 150 mm weefselkweek schotel bij een confluentie van 80- 100% bevat ~ 2x 10 7 cellen, voeg ~ 4x 10 7 TU van de HV). Verwijder het medium uit een 150 mm schaal van 116 cellen te infecteren en cellen met het virale mengsel. Telen geïnfecteerde cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
  10. 48 na infectie oogsten cellen zoals beschreven in stap 2,6) om doorgang P3 (figuur 3B) te verkrijgen.
    1. Herhaal stap 2,6) 1.
    2. Uit hetgeen 19,5 ml P3 afgifte virale deeltjes uit de resupended cellen door invriezen en ontdooien 3-4 keer. Deze fractie is dan heet lysaat van P3.
      Opmerking: Sommige vectoren kunnen eventueel extra passages nodig in 150 mm gerechten totdat ze voldoende worden versterkt. Daarom effectiviteit van de pre-amplificatie proces moet in serie pas worden bewaaktveroudering. qPCR gebaseerde analyse van de versterking proces kan worden uitgevoerd zoals beschreven in paragraaf 3 (zie ook figuur 4A). Pre-amplificatie van HCAdV dragen een expressiecassette voor groen fluorescent eiwit (GFP) kan gemakkelijk worden geëvalueerd door het observeren van het GFP flourecscent signaal met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Figuur 4B).

3. Monitoring van de Amplification proces met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) (zie ook figuur 4A).

  1. Isoleer gDNA van celpellets uit elke passage van de preamplifaction (stap 2,6) - 2,10) met elke commerciële DNA isolatie kit voor isolatie van gDNA uit gekweekte cellen of andere voorkeurswerkwijze. Voor optimale PCR resultaat gebruik gDNA zo vers mogelijk. Anders gDNA kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot verder gebruik.
  2. Om het aantal HCAdV genomen aanwezig in de cellen van de respectieve passage door qPCR analyse volgens genereren van een standaardkromme met gebruikmaking van 10 1 </ sup> - 10 9 exemplaren van een plasmide dat de Indiase overheid in de HCAdV genoom.
  3. Analyseer evenveel gDNA van P0- P3 (stap 2,6-2,10) aanbrengen qPCR middels 400 nM van primers specifiek voor het GOI in de HCAdV genoom. Instructies voor het uitvoeren van respectievelijke chemische qPCR qPCR follow fabrikant. Stel de qPCR programma als volgt: pre-incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min, amplificatie in 40 cycli van 95 ° C gedurende 10 s, 55- 60 ° C gedurende 15 s en 72 ° C gedurende 20 s. Op basis van de standaardcurve het aantal HCAdV genomen in de reactie kan worden geïnterpoleerd.

4. Grootschalige Versterking van HCAdV vectoren in 116 cellen in suspensie te groeien

  1. Voeg 900 ml voorverwarmd (37 ° C) vers MEM gesupplementeerd met 10% FBS en hygromycine B (100 ug / ml) in een 3 l spinner kolf (Figuur 3B).
  2. Verwijder medium uit ten minste 10 afzonderlijke 150 mm weefselkweekschalen met 116 cellen gekweekt bij een confluentie van 90- 100% en spoel af cellen met 10 ml verse voorverwarmde (37 ° C) MEM aangevuld met FBS (10%) en hygromycine B (100 ug / ml) met behulp van een serologische pipet. Pipet op en neer meerdere malen om een ​​homogene celsuspensie te krijgen. Transfer cellen direct in de spinner fles al met 900 ml van stap 4.1).
    Opmerking: Gebruik geen trypsine / EDTA als het negatieve groei van suspensiecellen kunnen beïnvloeden. Na verwijdering van medium onmiddellijk over cellen in de spinfles. Raak hoogste twee weefselkweekschalen tegelijk. Hoe langer de wachttijd na het toevoegen van vers medium hoe moeilijker het zal zijn om de cellen van de kweekschaal losgemaakt weefsel.
  3. Om optimale celgroei Incubate spinfles zorgen op een magnetische roerder in een weefselkweek incubator gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Stel de magneetroerder tot 70 rpm tot hechting van de cellen te voorkomen de glasoppervlakken. Monitor celgroei in spinner kolf om te onderzoeken of cellen gekweekt in de spinner kweekkolf levensvatbaar zijn en of ze groeien tot voldoende hoeveelheden. Telkens voorafgaand aan het toevoegen van vers medium overdracht 2 ml van de bioreactor tot een 60 mm weefselkweekplaat. Let celmorfologie onder een microscoop.
    Opmerking: Cellen vormen klonten drijvend in het kweekmedium geven optimale groei en levensvatbaarheid (zie figuur 4C). Na 24 uur ze vormen kolonies op het oppervlak van de weefselkweekschaal. 30- 50% confluentie geeft optimale dichtheid.
  4. 24 uur na het opzetten van de spinner kolf voeg 500 ml vers medium (MEM, 10% FBS) aangevuld met hygromycine B (100 gg / ml). 24 uur later deze stap te herhalen.
  5. 72 uur na het opzetten van de spinner kweek, voeg 1000 ml vers MEM-medium (10% FBS) met hygromycine B (100 gg / ml) resulterend in een totaal volume van 3 L celsuspensie.
  6. 24 uur na het bereiken avolume drie liter, oogst 116 suspensie cellen door centrifugatie gedurende 10 min bij 500 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Houd de geleegde spinner kolf onder de weefselkweek kap.
  7. Resuspendeer celpellets in vers MEM aangevuld met 5% FBS door en neer te pipetteren ongeveer 8- 10 keer een homogene celsuspensie krijgen. Het volume drager afhankelijk van of lysaat uit stap 2,10) 2. (19,5 ml, zie stap 4.8) 1. optie a) of een gezuiverde virale voorraad van HCAdV uit stap 5.9) 2. (meerdere ui depanding op virale titer, zie stap 4.8) 2., optie b) wordt gebruikt voor infectie van de cellen. Gebruik een totaalvolume van 150 ml.
    1. Optie A: Voor de infectie van 116 suspensiecellen met lysaat van P3 (primaire versterking) overdracht cellen van stap 4.8) in een 250 ml fles opslag uitgerust met een steriele magnetische roerstaaf of 250ml kleinschalig centrifugekolf en co-infecteren cellen met het virus in het lysaat van P3 (stap 2.10.2) en 2 TU van HV per cel. Uitgaande van een dichtheid van 3 x10 5 cellen per ml, het totale aantal cellen is 9x 10 8 cellen. Zo voegen 1,8x 10 9 TU van de HV.
    2. Optie B: Voor de infectie van 116 suspensiecellen met gezuiverd virale voorraad, overdracht cellen van stap 4.8) in een 250 ml fles opslag uitgerust met een steriele magnetische roerstaaf of 250ml kleinschalig centrifugekolf en co-infecteren cellen met de 100 virusdeeltjes per cel van vroeger gezuiverd HCAdV (van stap 5.9). 2). Zo voegen 9x 10 10 VP volgens fysieke titer (gemeten door absorptie bij 260 nm; stap 6) van het gezuiverde HCAdV en 1,8x 10 9 TU van de HV.
  8. Roer de cel-virus mengsel van september 4.8.1) of 4.8.2) in een magnetische roerder in de weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 uur bij 60 rpm. Zorg ervoor dat de opslag fles is niet volledig gesloten voor luchtcirculatie.
  9. 2 uur na infectie overbrengen het totale volume van de cel-virus mengsel terug in de 3 l spinner culture kolf en voeg 1850 ml verse voorverwarmde (37 ° C) MEM medium aangevuld met 5% FBS tot een totaal volume van 2 L en incuberen in de weefselcultuurincubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur bij 70 rpm.
  10. Oogst de cellen door centrifugatie gedurende 10 min bij 890x g bij kamertemperatuur in 500 ml centrifugebuizen. Verwijder het medium en resuspendeer gepelleteerde cellen in een totaal volume van 28 ml van DPBS. Pipet op en neer om een ​​homogene cel suspensie te verkrijgen. Bevriezen van de cel-virus suspensie in vloeibare stikstof of bij -80 ° C om ervoor te zorgen dat de schorsing volledig bevroren. Bewaar de cel-virus suspensie bij -80 ° C totdat het starten van het virus zuivering.

5. Dialyse van HCAdV

  1. Virale lysaat van cesiumchloride (CsCl) gradiënten bereiden vries cel-virus suspensie uit stap 4,11) in vloeibare stikstof en ontdooien in een waterbad bij 37 ° C vier maal.
  2. Centrifugeer het virale lysaat bij 500 xg gedurende 8 minuten bij RT en verzamel de bovenstaande vloeistof met de HCAdV.
  3. Voor Ultracentrifugatie bereiden CsCl oplossingen follows.Weigh 37,5 g (1,5 g / cm 3), 33,5 g (voor 1,35 g / cm 3) en 31,25 g (1,25 g / cm 3) respectievelijk CsCl poeder en vul met dH 2 O tot 25 ml.
    1. Roer tot oplossing wordt helder en steriele filter de oplossingen. Eindelijk verwijderen 1 ml van elke oplossing en wegen op een mooie schaal te controleren Of de dichtheid correct is. 1ml moet 1,5 g, 1,35 en 1,25 g respectievelijk gewicht.
    2. Als de dichtheid te hoog instellen door stapsgewijze toevoeging van kleine hoeveelheden (pl) steriel dH 2 O. Na toevoeging van dH 2 O opnieuw meten van de densiteit. Indien nodig voeg meer dH 2 O.
    3. Herhaal deze procedure totdat de dichtheid correct is. Als de dichtheid te laag is aan te passen door het toevoegen van kleine hoeveelheid CsCl poeder. Steriel filter het opnieuw en controleer de dichtheid. Als de dichtheid te hoog aan te passen door adding dH 2 O zoals hiervoor beschreven. Als de dichtheid is nog steeds te laag weer toe mor CsCl, steriel filter en controleer de dichtheid. Herhaal deze procedure totdat de dichtheid correct is.
  4. Bereid CsCl stap gradiënten in zes heldere ultracentrifuge buizen. Voorzichtig en langzaam pipet CsCl oplossingen in de buizen met de volgende volgorde: 0,5 ml van 1,5 g / cm 3 CsCl-oplossing, 3 ml van 1,35 g / cm 3 CsCl-oplossing en 3,5 ml van 1,25 g / cm 3 CsCl-oplossing (figuur 2C) .
  5. Overlay ~ 4,5 ml geklaard vector supernatant van stap 5.2) op de top van de 1,25 g / cm3 CsCl laag. Centrifuge de gradiënten in een ultracentrifuge met een swing out rotor (SW-41) bij 12 ° C gedurende ten minste 2 uur bij 226.000 x g (35.000 rpm) met langzame versnelling en vertraging aparte HCAdV-genoom bevatten virale deeltjes uit lege deeltjes en mobiele puin.
    OPMERKING: Onder optimale condities een diffuse band van celresten formes bovenopde buizen. Hieronder twee witte banden kan worden waargenomen. De bovenste band bevat lege deeltjes, terwijl de onderste band is gelijk aan de HCAdV (Figuren 2C en 5A).
  6. Verwijder voorzichtig de lagen van celafval en lege deeltjes en laat 1 ml van de lagere banden van elke buis en overdracht virus met een schone pipetpunt in een steriele 50 ml buizen. Voeg tot 24 ml van 1,35 g / cm 3 CsCl oplossing voor de verzamelde virusdeeltjes en meng voorzichtig.
  7. Vul centrifugebuizen met 1,35 g / cm 3 CsCl-virusoplossing boven en centrifuge O / N (18 tot 20 h) bij 226.000 xg (35.000 rpm) bij 12 ° C in een ultracentrifuge met een swing out rotor (SW-41 ) met langzame versnelling en vertraging.
  8. Verzamel de HCAdV aanwezig in de prominente lagere band. Als een potentiële bovenste band bevat leeg te verwijderen bovenste lagen van de top met een pipet (zie figuren 2C en 5B) Vervolgens neemt u weg van de onderste band using een pipet.
  9. Dialyseer de verzamelde virusdeeltjes voor buffer-uitwisseling.
    1. Snij een strook dialysebuis (MWCO: 50.000) van ongeveer 8 cm, wassen met steriele dH 2 O driemaal. Sluit één zijde van de dialyse buis met een plastic klem en breng de verzamelde virus van stap 5,8) in buis met een 1 ml pipet. Vermijd luchtbellen in de slang en sluit het aan de andere kant met een plastic klem dialyse sluitingen.
    2. Dialyseer in 1 liter dialyse buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glycerol en 1 mM MgCl2 in gedeïoniseerd H2O) gedurende 2 uur bij 4 ° cwith langzaam roeren. Uitwisseling dialyse buffer met 2 l dialysebuffer en dialyze O / N bij 4 ° C onder langzaam roeren. U kunt ook gebruik maken van een sucrosebuffer (140 mM NaCl, 5 mM Na 2 HPO 4 x2H 2 O, 1,5 mM KH 2 PO 4 en 730 mM sucrose, pH 7,8).
    3. Verzamel gedialyseerd virusdeeltjes uit stap 5.9) 2. met behulp van een 1 ml pipette. Bereid meerdere aliquots van de gewenste kleine hoeveelheden (25 tot 100 pi) en opslaan gezuiverd virus bij -80 ° C.

6. Het meten van de fysieke titer van Final HCAdV Voorbereidingen van optische dichtheid (OD)

  1. Verdun 25 ul van de uiteindelijke vector preparaat uit stap 5.9) 2 met 475 ul lysisbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS)), schud gedurende 20 min bij RT en tenslotte centrifugeer 2 minuten bij kamertemperatuur bij 15.000 x g.
  2. Aangezien de extinctie bij 260 nm (A260) zijn meestal lage, meet absorptie vier keer met 100 pl van het supernatant en berekent gemiddelde van de vier metingen. Bereken het aantal virusdeeltjes per ml (vp / ml -1) met de volgende formule: vp / ml -1 = (gemiddelde A260) x (20) x (1,1 x 10 12) x (36 kb / HCAdV grootte in kb ).
    OPMERKING: Resultaten van een typische opbrengst van absolute virale partikels (OD titer) getoond in figuur 7A

7. Meten Totaal Deeltjes, infectieuze eenheden van de HCAdV en HV de besmettingsgraad van het Final Vector Voorbereiding door qPCR. Een schema van de titratie procedure is weergegeven in figuur 6

  1. Zaad HEK293 cellen in 6 of 12 well weefselkweek platen, zodat de cellen tot 90% confluentie op de volgende dag. Om het aantal infectieuze virusdeeltjes (infectieuze titer) bepalen infecteren cellen van een putje in een plaat met meerdere holtes met 1 pi en een tweede putje met 10 ul van gezuiverd virus van stap 5,9) 3.
  2. Oogst cellen 3 uur na infectie. Verwijder medium en voeg trypsine om de hele goed te bedekken en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5 min. Spoelen van de cellen met trypsine met een pipet en spin neer de cellen bij 890 g gedurende 3 min bij RT.
  3. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 200 ul van DPBS en was ze grondig om gratis (niet-infectieuze) vector te verwijderen. Centrifugeer gedurende 3 min bij 890 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellets in 200 ul van verse DPBS.
    Opmerking: Voor een nauwkeurige bepaling van de besmettelijke titer, is het cruciaal om alle niet-infectieuze virusdeeltjes uit de cel oppervlakken te verwijderen door trypsine behandeling en grondig wassen.
  4. Om de totale virusdeeltje aantal (besmettelijke deeltjes en niet-infectieuze deeltjes = fysieke titer) te bepalen, de oogst niet-geïnfecteerde HEK293 cellen uit twee putten zonder trypsine door spoelen van de cellen met hun kweekmedium met een pipet.
  5. Spin down de cellen gedurende 3 min bij 890 xg bij kamertemperatuur. Gooi het medium en resuspendeer gepelleteerde cellen in 200 gl DPBS. Subsequently voeg 1 pl en 10 pl gezuiverd HCAdV preparaat rechtstreeks aan de cellen. Met niet- geïnfecteerde cellen als achtergrond, dezelfde voorwaarden gDNA isolatie en vervolgens Q-PCR te verzekeren.
  6. Isoleer gDNA van HEK293 cellen afkomstig van stap 7,3) en 7,5)
    1. Vortex cellen opnieuw gesuspendeerd in 200 ul DPBS (stap 7.3 en 7.4) gedurende 3 sec, voeg 200 ul van SDS-oplossing. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS) en 20 ui proteïnase K (20 mg / ml) en vortex suspensie 3 sec. Incubeer 16 uur bij 12- 55 ° C en schud langzaam. Voeg vervolgens 2 pl RNAse A (20 mg / ml) en incubeer 30 minuten bij 37 ° C.
    2. Voeg 350 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol en centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe buis en herhaal deze stap een keer
    3. Breng de bovenstaande vloeistof over in een nieuwe buis, voeg 50 ul natriumacetaat (pH 5, 3 M) en 1 ml ijskoude EtOH (99,8%) en meng suspensie. Centrifuge monsters gedurende 10 minuten bij 15.000 xg genomisch DNA pellet.
    4. De bovenstaande vloeistof, voeg 500 pl 70% EtOH en centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g. Verwijder het supernatant, voeg 500 pl 70% EtOH en schud gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g.
    5. Verwijder het supernatant en de lucht drogen DNA pellet. Droog geen DNA pellets lang, aangezien het moeilijker is om gDNA krijgen oplossing. Resuspendeer de pellet DNA in 120 ul van dH 2 O en incubeer gedurende 1 uur bij ~ 37 ° C onder schudden. Als DNA-oplossing wordt viskeus, schud gedurende enkele uren bij 37 ° C, en incubeer bij 55 ° C gedurende ~ 1 uur.
  7. Infectieuze HCAdV-deeltjes absolute HCAdV deeltjes te bepalen, wordt een standaardcurve van 10 1 - 10 8 kopieën van een plasmide dat het GOI in de HCAdV genoom.
  8. Bepaal totale deeltjes en infectueuze deeltjes door analyse van dezelfde hoeveelheden gDNA van geïnfecteerde HEK293 cel uit stap 7,3) en 7,4) toegepast qPCR middels 400 nM van primers specifiek voor het GOI in de HCAdV genoom.
  9. Stel het PCR-programma als volgt: pre-incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min, amplificatie in 40 cycli van 95 ° C gedurende 10 sec, 55 ° C gedurende 10 seconden en 72 ° C gedurende 20 sec. Op basis van de standaardkromme (stap 7,7), interpoleren het totale aantal adenovirale genomen in de reactie.
  10. Bereken het aantal adenovirale genomen in de uiteindelijke vector preparaat met de volgende formular: (Aantal HCAdV / gewicht ng gDNA bij de reactie) x (gewicht ng DNA van alle cellen in de geïnfecteerde schaal / volume virus in ui) .
    LET OP: Het typische bereik voor absolute en infectieuze virusdeeltjes opbrengsten zijn ongeveer 1x10 7 -1x10 8 virale deeltjes / ul. Titers die tien maal hoger of lager zijn dan hier vertoonde kunnen worden beschouwd als normaal. Hogere titers zou een verbetering zijn. Wat betreft de verhouding van absolute HCAdV particles aan besmettelijke HCAdV deeltjes, de ervaring leert dat ongeveer 5 tot 10% van de absolute HCAdV deeltjes zijn besmettelijk (Figuur 7A).
  11. Om de verontreinigingsniveaus met HV bepalen uitvoeren qPCR door het amplificeren van een deel van het adenovirale late gen 3 (L3) in de HV genoom. Gebruik van een plasmide dat de adenovirus late gen 3 (L3) om een ​​standaardcurve (stap 7,7) genereren.
  12. In deze reactie toe te passen 400 nM van de primers L3 forward 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'en L3 omgekeerde 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3' samen met 300 nm van de L3-specifieke probe 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
  13. Stel het PCR-programma als volgt: voorincubatie / activering bij 95 ° C gedurende 10 min, amplificatie gedurende 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min. Gebruik een universele probe PCR Mastermix voor qPCR reactie. Op basis van de standaardkromme (stap 7,7) Bereken het aantal infectious HV deeltjes in de uiteindelijke vectorbereiding. Zie (Figuur 7A) voor typische opbrengst van HV deeltjes.
  14. Tenslotte berekent de verhouding van absolute infectieuze deeltjes HCAdV tot HV verontreinigingsniveaus de kwaliteit van de vectorbereiding evalueren.
    OPMERKING: Tot nu toe kan een klein deel van de resterende HV niet worden uitgesloten. Gewoonlijk het percentage HV verontreiniging ~ 5% van infectieuze deeltjes of minder, die aanvaardbaar is (Figuur 7B). Natuurlijk HV zo min mogelijk wenselijk, zeker als het vector preparaat zal worden gebruikt voor dierproeven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier representatieve voorbeelden voor klonering, amplificatie en zuivering van HCAdV preparaten worden getoond. Een overzicht van de kloneringsstrategie (figuur 1) en representatieve voorbeelden voor klonering en afgifte van de HCAdV genoom door restrictie-enzym digest worden voorzien (figuur 2). Een typische restrictiepatroon na de vrijgave van de GOI-expressiecassette van pHM5 door PI- Sce I en I I Ceu verteren en vervolgens met fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie (zie stap 1.2- 1,5) wordt getoond (Figuur 2A). Typisch een ~ 3 kb band die overeenkomt met de pHM5 plasmideskelet en een tweede band overeenkomend met de expressiecassette van het GOI kan worden waargenomen. De band die het GOI-expressiecassette wordt vervolgens gezuiverd uit de agarosegel. Het gezuiverde GOI-expressiecassette wordt geanalyseerd op een agarosegel tezamen met het gezuiverde, gedefosforyleerde pAdVFTC dat wals gedigereerd met PI- Sce I en I Ceu I respectievelijk (stap 1,7) om de juiste grootte te verifiëren en de relatieve hoeveelheid moleculen voor daaropvolgende ligatie (figuur 2B) te schatten. Na ligatie (zie stap 1,8), gevolgd door fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie en SwaI verteren uncut pAdFTC en vervolgens met fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie (stap 1,9), ligatieproducten worden getransformeerd in bacteriën en klonen te elimineren zijn geselecteerd op ampicilline bevattende LB- agarplaten. Meestal tientallen tot honderden klonen verkregen, waarvan 5- 10 klonen worden voorbereid plasmide DNA mini-preparaten. Een restrictiepatroon van een analytische digest HincII van positieve en negatieve klonen met lege pAdFTC als negatieve controle (zie ook stap 1,10) weergegeven (figuur 2C). Hier positieve klonen niet een 5 kb band, die aanwezig is in lege pAdFTC en negatieve klonen en een 1,7 kb fragment verschijnt is te laten ziendat niet in de lege pAdFTC en negatieve klonen. Voor deze respectieve Indiase overheid geeft dit aan tha klonen succesvol was. Een positieve kloon die is gezuiverd via Midiprep werd vervolgens geknipt met No tI aan de HCAdV-genoom die de Indiase overheid van pAdVFTC-Indiase overheid (stap 2.2) vrij te geven. Tenslotte nr tI gedigereerde DNA ist tweemaal gezuiverd met behulp van fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie met hoge zuiverheid van het DNA voor daaropvolgende transfectie in 116-cellen te garanderen. Analyse van een kleine fractie van de nr tI gedigereerde pAdVFTC-GOI op een agarosegel toont ~ 9 kb band die overeenkomt met de pAdFTC plasmideskelet en een grote band tot ~ 36 kb (afhankelijk van de grootte van het GOI expressiecassette) overeenkomen met de HCAdV genoom (Figuur 2D). Een overzicht van de amplificatie en zuivering pipeline is schematisch weergegeven (figuur 3). Representatieve voorbeelden van de monitoring van de vector pre-amplificatie proces worden geleverd ( (Figuur 4A). Merk op dat het aantal vector genomen descreases meestal tijdens de eerste passages en sterk toeneemt in latere passages. Een vector kopie aantal 10 6 - 10 7 per 15.000 cellen is voldoende om 116 cellen voor grootschalige productie infecteren in een 3 liter spinfles. Als de Indiase overheid in de HCAdV vector genoom bevat een GFP expressie cassette, kan de pre-amplificatie proces (hoofdstuk 2) ook worden gecontroleerd door fluorescentie microscopie. Representatieve foto's van elke passage worden getoond (Figuur 4B). Merk op dat het aantal GFP positieve cellen daalt meestal tijdens de eerste passages en sterk toeneemt in de late passages. Als het aantal GFP positieve cellen bereikt ~ 100%, werd de vector geamplificeerd sufficiently tot 116 cellen voor grootschalige productie infecteren in een 3 liter spinfles. De grootschalige amplificatieproces van een HCAdV met GFP expressie-cassette werd gevolgd door microscopische analyse van het kweekmedium en de cellen die werd overgebracht uit de centrifugekolf een weefselkweek schotel. Microscopische foto's van cellen die HCAdV in suspensie cultuur (zie stap 4.4 en 4.11) worden verstrekt (Figuur 4C). Merk op dat cellen groeien in groepjes aangeeft dat de groei voorgaande cel voldoende en gezonde cellen. Bij gebruik van fluorescentiemicroscopie ~ 100% van deze cellen werden GFP-positief, wat aangeeft efficiënte transductie celsuspensie in de bioreactor en efficiënte vectorproductie. Vectordeeltjes werden gezuiverd uit het medium en cellen van 3 liter suspensiekweek door CsCl ultracentrifugatie. Representatieve beelden van de HCAdV vector zuivering middels CsCl dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie worden getoond (Figuur 5). Na eenn de eerste centrifugeren met behulp van een CsCl stapgradiënt meestal twee banden worden waargenomen. De bovenste band bevat lege gedeeltelijke capsiden terwijl de onderste band bestaat uit DNA-bevattende vector deeltjes (stap 5.4- 5,5) (Figuur 5A). DNA dat vectordeeltjes worden vervolgens geoogst (stap 5,6) en samengevoegd voor een tweede ultracentrifugatie stap om de vectordeeltjes geconcentreerd. Deze stap resulteert meestal in een enkele band van DNA met vectordeeltjes die uiteindelijk wordt geoogst voor daaropvolgende dialyse (stap 5.7- 5,8) (Figuur 5B). Gedialyseerd vector preparaten werden gekarakteriseerd door meting van het aantal absolute deeltjes infectieuze deeltjes en verontreinigingen HV. Een schematisch overzicht van de titratieprocedure (hoofdstuk 6 en 7) is aangebracht (figuur 6). Representatieve resultaten voor de karakterisering van de uiteindelijke vector preparaat worden getoond (Figuur 7). Het staafdiagram toont typische vectordeeltje nummers dieverkregen volgens de procedure die wordt beschreven in dit protocol. Deeltjes absolute aantallen vector deeltjes werden bepaald door de optische dichtheid (hoofdstuk 6), besmettelijke vector deeltjes en HV besmetting werden gemeten door qPCR (deel 7) (Figuur 7A). De ervaring leert, dat de OD titer overschat het aantal virusdeeltjes. Absolute virale deeltjes gemeten door OD kan 20- 500 maal hoger dan infectueuze virale deeltjes gemeten door Q-PCR. Besmettelijke vector deeltjes meestal gemaakt variëren van 5 tot 10% van de absolute deeltjes wanneer beide werden gemeten door Q-PCR (deel 7). Als het vector preparaat een zeer goede kwaliteit, meer dan 20% absolute deeltjes besmettelijk. De typische verhouding tussen de HV en HCAdV infectieuze deeltjes (stap 7.14) varieert gewoonlijk tussen 1-5% van infectieuze deeltjes (Figuur 7B). Dit is aanvaardbaar omdat de HV is replicatie deficiënt. Niettemin minder HV vervuiling mogelijk (<1% van infectieuze deeltjes) zoude voorkeur.

Figuur 1
Figuur 1. Stroomdiagram van het klonen van de Indiase overheid in pAdFTC. De Indiase overheid is gekloond in de MCS van de pHM5 shuttle plasmide. Plasmiden pAdFTC en pHM5-GOI worden gedigereerd met I- Ceu I en PI- Sce I en gezuiverd door fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie. Het gedigereerde pHM5 wordt geladen op een preparatieve agarose gel om het gen van belang (zie ook stap 1,5) te zuiveren, terwijl de verteerde plasmide pAdFTC wordt gedefosforyleerd. Vervolgens wordt de ligatiereactie met CIP behandelde pAdFTC en de transgene expressiecassette is ingesteld (zie stap 1.8) en na afloop gezuiverd door fenol-chloroform extractie en EtOH neerslag. De daaropvolgende Swa I digestie van het ligatieproduct gevolgd door fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie voorkomt groei van klonen dragen pAdFTC zonder insert. Zwarte trihoeken geven restrictie-enzym herkenningsplaatsen; grijze vakken geven AdV5 omgekeerde terminale herhalingen (ITR), witte dozen gemarkeerd met Ψ geven AdV5 inpaksignaal, rode pijl geeft promotor, groene vakken geven transgene (gen van belang, Indiase overheid) worden uitgedrukt, blauwe vakken geven polyadenylatiesignaal, oranje of blauw pijlen geven antibiotica resistentiegenen van het plasmide ruggengraat, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Representatieve resultaten van het klonen procedure en het vrijgeven van de HCAdV genoom van pAdVFTC. (A) Onthechting van Indiase overheid-expressie cassette uit pHM5 door PI-Sce I en I Ceu I digest (zie ook stappen 1.2- 1.5). (B) PI-Sce I en I Ceu I respectievelijk (stap 1.7). (C) Analytische Hinc II samenvatting van pAdVFTC klonen met en zonder Indiase overheid (zie ook stap 1.10). (D) Vrijgave van de HCAdV-genoom die de Indiase overheid van pAdVFTC-Indiase overheid door Geen tI digest (stap 2.2) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
. Figuur 3. Schematische weergave voor hoge-capaciteit adenovirale vector amplificatie en zuivering (A) HCAdV DNA transfectie en helper virus (HV) infectie: Transfectie van gelineariseerde HCAdV genoom die de Indiase overheid in de HCAdV producent cellijn (116 cellen [4]) en subsequent infectie met het HV AdNG163R-2 [4].   (B) Amplificatie van HCAdV: Na pre-amplificatie stappen serieel overdragen cellysaat in nieuw weefselkweek schaal en co-infecteren met HV, grootschalige productie wordt uitgevoerd in een 3 L suspensiekweek (C) HCAdV zuivering. Voor zuivering virus wordt geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie cesiumchloride gradiënten (D) Dialyse. Gezuiverd HCAdV deeltjes gedialyseerd tegen 2 L opslagbuffer. HCAdV, hoge capaciteit adenovirale vector; ITR, adenovirus serotype 5 omgekeerde terminale herhaling; Ψ, verpakking signaal; HV, helper virus; MOI, veelvoud van infectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4 <br /> Figuur 4. Representatieve resultaten van het amplificatieproces (A) Monitoring van de pre-amplificatie proces door amplificatie van virale genomen met behulp van qPCR (zie ook paragraaf 3). (B) Als de Indiase overheid bevat GFP als een transgen, de pre-amplificatie-werkwijze kan worden gevolgd door fluorescentie microscopie. (C) Representatieve resultaten van de grootschalige amplificatieproces in een spinner fles examplified HCAdV voor GFP codeert. Het linker paneel toont een microscopisch beeld van geïnfecteerde 116 cellen uit de spinner fles. Een monster kweekmedium en de cellen werden overgebracht naar een 60 mm weefselkweekplaat. Merk op dat klonten van versterkte cellen zichtbaar. De rechter paneel toont hetzelfde beeld met behulp van fluorescentie microscopie. Bijna 100% van de cellen zijn getransduceerd met HCAdV dragen GFP. Klik hier ombekijk een grotere versie van deze figuur.

Figuur 5
Figuur 5. Representatieve resultaten na CsCl gradiëntcentrifugatie (A) Na het uitvoeren van een stap gradiënt (zie ook stap 5.5).. (B) Na het continue gradiënt (zie ook stap 5.7) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Schematisch overzicht van de titratie procedure. (A) Meting van infectueuze deeltjes: Cellen in een multi-well plaat geïnfecteerd met verschillende hoeveelheden gezuiverde virus en verzameld celpellets (B) Meting o.f absolute deeltjes: Unifected cellen vormen een multi-well worden verzameld door trypsine en centrifugeren. Na resuspensie gezuiverde virus wordt toegevoegd en genomische DNA geïsoleerd. (C) Isolatie van genoom DNA. (D) om virale genoom kopie nummers een kwantitatieve PCR (Q-PCR) wordt uitgevoerd kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.

Figuur 7
Figuur 7. Representatieve resultaten voor de karakterisering van de uiteindelijke vectorbereiding. (A) Absolute aantallen deeltjes van een vector preparaat volgens de gepresenteerde protocol bepaald met verschillende methoden:. OD titer gemeten door de optische dichtheid (hoofdstuk 6), infectieuze titer en HV verontreiniging gemeten door qPCR (deel 7) (B)Verhouding tussen de totale besmettelijke HCAdV deeltjes en HV besmetting niveaus gemeten door qPCRs (hoofdstuk 7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier gepresenteerde protocol maakt zuivering van HCAdV vectoren gebaseerd op menselijke adenovirus type 5 gebaseerd op eerder beschreven procedures 4,12. De HCAdV genoom binnen pAdFTC plasmide mist alle adenovirus genen en alleen draagt ​​de 5'- en 3'-ITR's en het verpakkingssignaal. In deze strategie de HV AdNG163R-2 4 biedt alle benodigde genen voor een efficiënte virus productie in trans. Dit biedt een verpakking van maximaal 35 kb, die duidelijk outcompetes eerste en tweede generatie ADVS of veelgebruikte lentivirus (LV) - of adeno-geassocieerd virus (AAV) gebaseerde vectoren. Een tweede voordeel van HCAdV bijzonder voor in vivo toepassingen is het feit dat zij in tegenstelling tot de eerste of tweede generatie ADVS verlaagde cytotoxische en immunogene bijwerkingen veroorzaakt door de expressie van virale eiwitten 5-8 weergegeven.

Toch is de hier beschreven protocol wordt meer tijd enarbeidsintensief dan voor andere virale vectoren zoals LV- of AAV-vectoren als eerste of tweede generatie ADVS. Een belangrijk obstakel is het klonen van grote transgenen en de daaropvolgende overdracht van het virus productie plasmide pAdV-FTC. Het gebruik van homing endonucleasen PI- Sce I en I I Ceu bieden nauwkeurige en gerichte insertie van het transgen van het plasmide shuttle pHM5, maar hebben het nadeel sterk vasthouden voor het gesplitste DNA. Om die reden veel fenol-chloroform cleanup stappen zijn nodig bij het voorbereiden en plasmide- insert-DNA gedurende de kloneringsprocedure. Daarom rigoureus na de verstrekte klonen protocol is strikt aanbevolen. Na kloneren van het HCAdV genoom wordt afgegeven uit het plasmide pAdFTC van NotI restrictie-enzym digest en vervolgens getransfecteerd in de producerende cellijn. Merk op dat de eerste transfectie efficiëntie zijn essentieel voor het bereiken van voldoende virus versterking. Belangrijk is dat het protocol biedt verschillende stappenwaarvan de procedure kan worden hernieuwd bij opeenvolgende stappen niet. Tijdens voorversterking 1 3 van de lysaten kunnen worden opgeslagen als back-up voor de procedure vanaf dat moment opnieuw starten of om herhaling bij meer virus geproduceerd moet worden verkort.

HCAdV die grote, complexe of meerdere transgenen of bepaalde stuffer DNA kan amplificeren langzamer dan verwacht. Daarom is het cruciaal om volg de pre-amplificatieproces voordat suspensiekweek gekweekt in een spinfles. Als pre-amplificatie niet succesvol is, moet de procedure worden gestopt en gestart vanaf het begin opnieuw. Als pre-amplificatie inefficiënt, kunnen extra passages nodig zijn tot de hoeveelheid virus voldoende hoog is om de cellen gekweekt in een 3 L spinfles infecteren. Als alternatief voor suspensiekweek in een spinner fles, kan 20 tot 30 150 mm weefselkweekschalen worden gebruikt voor de finale doorgang. Dit kan echter meer tijd en werken intensief.

Voor qPCR metingen gDNA ofwel kunnen worden gezuiverd via de hier vermelde protocol of in de handel verkrijgbare kit voor het isoleren van gDNA uit gekweekte cellen. Via de handel verkrijgbare kit protocol een dag kan worden verkort, maar een variërende gedeelte van de HCAdV genoomkopieën die aanwezig zijn in geïnfecteerde cellen tijdens de zuivering verloren gaan, afhankelijk van de gebruikte uitrusting. Daarom zal HCAdV genomen enigszins ondervertegenwoordigd in volgende Q-PCR metingen vergeleken met de gegevens in stap 7,4 methode).

Obtained totale infectieuze titers in een laatste vector voorbereiding afgeleid van één centrifugekolf bereik van 1 x 10 10 5 x 10 11 infectieuze deeltjes. Deze hoeveelheid is voldoende om vele presteren in vitro experimenten. Afhankelijk van de doelcellen, ook verschillende in vivo experimenten uitgevoerd. Bijvoorbeeld, voor het bereiken van voldoende lever transductie na systemische toediening 1 x 10 9 infectieuze deeltjes vereist.

Samengevat, de brede cel tropisme en de mogelijkheid om capside-gemodificeerde adenovirus te produceren samen met de verbeterde veiligheidsprofiel van HCAdV vectoren zonder alle virale genen render deze HCAdV vectorsysteem een ​​uiterst waardevol instrument voor gen therapeutische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10, (5), 440-447 (1999).
  2. Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25, (1), 3-11 (2014).
  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13565-13570 (1996).
  4. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8, (5), 846-852 (2003).
  5. Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9, (18), 2709-2716 (1998).
  6. Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78, (11), 5966-5972 (2004).
  7. Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102, (7), 2403-2411 (2003).
  8. Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13, (5), 370-381 (2013).
  9. Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9, (17), 2577-2583 (1998).
  10. Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10, (12), 2013-2017 (1999).
  11. Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99, (11), 3923-3930 (2002).
  12. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4, (4), 547-564 (2009).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics